Bioengineering

Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Nanodeeltjes gebaseerde bestelauto's hebben aangetoond grote belofte voor intracellulaire targeting toepassingen, een mechanisme om specifiek te veranderen cellulaire signalering en genexpressie. Deze voertuigen kunnen worden beladen met geneesmiddelen, eiwitten en nucleïnezuren ontworpen om cellulaire reacties effect en een gewenst effect in doelweefsels bereiken. Veel soorten nanocarriers zijn onderzocht voor therapeutische en diagnostische nut waaronder lipiden, polymeren, silicium en magnetische materialen. Deze systemen zijn aantrekkelijk vanwege hun potentieel voor lokale afgifte van geneesmiddelen, verhoogde de therapeutische concentratie in doelweefsels, en vermindering van systemische toxiciteit.

Vaste lipidenanodeeltjes (SLN) zijn een goed bestudeerde voorbeeld van een nanodeeltje afgiftesysteem dat is ontstaan als een veelbelovend geneesmiddel afgiftevehikel afgelopen jaren. SLN kunnen gemakkelijk worden geformuleerd voor meerdere toepassingen zoals biologische sensing ^1, cosmetica ² en therapeutic levering ^3-7. Hun nut voort uit het feit dat zij volledig bestaan uit resorbeerbare, toxische lipiden, resulterend in verhoogde biocompatibiliteit. Tijdens synthese kunnen lipofiele geneesmiddelen in LIN.AFSCHR voertuigen worden ingebouwd, waardoor de oplosbaarheid en geschiktheid geneesmiddelen verhogen voor parenterale toediening. SLN voertuigen helpen ook om ingekapseld therapieën te stabiliseren, het verminderen van hun afbraak en klaring, en het maximaliseren van therapeutische werking. Deze voertuigen zijn bijzonder geschikt voor langwerkende, gereguleerde afgifte preparaten vanwege hun stabiliteit bij lichaamstemperatuur ^3,4,8,9. Belangrijk inkapseling van geneesmiddelen in lipidenanodeeltjes verandert de intrinsieke farmacokinetische profielen van de geneesmiddelmoleculen. Dit levert een potentieel voordeel doordat de gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen met een nauwe therapeutische index. De afgiftesnelheid van SLN opgenomen geneeswijze kan worden afgestemd op basis van de lipide afbraaksnelheid of het geneesmiddel diffusiesnelheid in delipide matrix.

SLN zijn vaak ontworpen om te accumuleren op bepaalde doelweefsels. Bijvoorbeeld, de grootte (typisch groter dan 10 nm) versterkt retentie in de bloedsomloop, waar lekkende vasculatuur tumorweefsel vergemakkelijkt depositie. Bovendien heeft de wijze van toediening deeltje bleek te veranderen biologische verdeling met de potentie om specifieke fysiologische structuren te richten zoals lymfeknopen ^10,11. Bij afzetting in doelweefsels, de gepaste cellulaire interacties en eventuele internalisatie van nanodeeltjes uitdaging omdat het vermogen van celmembranen om selectief de stroom van ionen en moleculen in en uit de cel ^12. Om cellulaire opname te vergemakkelijken, is het mogelijk nanocarriers specifieke liganden zoals peptiden, kleine moleculen en monoklonale antilichamen ^13,14 wijzigen. Verscheidene mechanismen waaronder zowel passieve penetratie en actieve transport van nanodeeltjesover het celmembraan zijn eerder beschreven ^3,12,15. In het algemeen is aangetoond dat cellen nanodeeltjes interacties worden beïnvloed door de fysisch-chemische eigenschappen van de nanodeeltjes zoals grootte, vorm, oppervlaktelading en oppervlaktechemie, naast celspecifieke parameters zoals celtype of celcyclusfase ^12.

Een eerder onderzoek aangetoond dat de synthese van sub-10 nm SLN voor plaatselijk ^{16 en} biomarker detectie toepassingen ¹ met behulp van de methode ¹⁷ fase-inversie temperatuur (PIT). Dit is een zachte synthesemethode ² waarbij de samenstelling blijft constant terwijl de temperatuur geleidelijk wordt gewijzigd. Continu roeren van de verwarmde oplossing bij afkoeling tot KT leidt tot een nano-emulsie. Dit leidt tot de synthese van SLN met kleinere deeltjesgrootte ¹ dan eerder gerapporteerd met behulp van verschillende werkwijzen voor de synthese van lipiden nanoparticles ^17-22. De resulterende maat schaal kleiner dan 20 nm, een voordeel voor intracellulaire targeting toepassingen vanwege grotere oppervlak en de mogelijkheid van verhoogde cellulaire interacties.

Een schema van SLN, die een fluorescerende kleurstof of therapeutisch te leveren, wordt in figuur 1. De SLN bestaan uit een lipide inrichting (bijvoorbeeld lineair alkaan) waardoor de opname van lipofiele stoffen (bijvoorbeeld kleurstoffen of therapeutica) en een oppervlakte exterior (bijvoorbeeld lineaire ionische surfactant), omgeven door water. In deze studie werden SLN beladen met een fluorescerende kleurstof en gebruikt als een model voor deeltjes-cel interacties te onderzoeken. Primaire menselijke dermale fibroblasten en muis dendritische cellen werden blootgesteld aan kleurstof-geladen SLN na verloop van tijd om interacties te karakteriseren met betrekking tot toxiciteit en deeltjes opname. A 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) bepaling werd utilized om de juiste dosering niveaus vast te stellen. Fluorescentie microscopie en flowcytometrie werden twee methoden toegepast om deeltjes opname in vitro onderzocht.

Figuur 1. Schematische voorstelling van SLN tonen de belangrijkste bestanddelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Verwerking van SLN

Synthese van SLN
Opmerking: Gebruik de PIT methode ^1,17,20 naar de sub-20 nm SLN ¹ te bereiden.
1. Gebruik aseptische techniek, Bioreagents of celkweek klasse reagentia en steriele materialen (dwz, pipetten, spatels, flesjes, enz.).
2. Gebruik een bio kast voor de synthese van SLN (figuur 2).
3. Combineer 0,6 mg fluorescente kleurstof (Nile Red (NIR), NiR concentratie ongeveer 0,3 mg / ml) en 0,10 g Heneicosane (Lipid, 5 wt / wt% lipide concentratie) in een flesje (15 ml), co-smelten bij 90 ° C, en roer.
4. Voeg 0,11 g polyoxyethyleen (10) oleylether (Surfactant, 5,5 wt / wt% surfactant concentratie). Co-smelt het verkregen mengsel bij 90 ° C en roer.
5. Voeg 1,79 g steriel water aan het mengsel verwarmen tot 90 ° C en roer totdat een transparante nano-emulsie wordt gevormd.
  Opmerking: Onder voortgezet roeren en gecontroleerde afkoeling, SLNs worden gemaakt. Deze omstandigheden leiden tot een omkering van het water-in-olie emulsie een olie-in-water emulsie. Lipofiele moleculen zoals NiR partitie naar de vetdruppels.
6. Bereid een nanoemulsion parallel zonder toevoeging van de fluorescerende kleurstof, om te dienen als een controlemonster. Combineer 0.10 g Heneicosane en 0,11 g polyoxyethyleen (10) oleylether in een flesje (15 ml) co-smelt bij 90 ° C en roer.
  1. Voeg 1,79 g steriel water aan het mengsel verwarmen tot 90 ° C en roer totdat een transparante nano-emulsie wordt gevormd.
7. Verder steriliseren elk nanoemulsion met een steriel 0,2 urn filter.
Figuur 2. Schematische voorstelling van de synthese van de SLN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deeltjesgrootte en Polydispersity
1. Met dynamische lichtverstrooiing (DLS) de deeltjesgrootte en de polydispersiteit van de SLN ¹ met een glazen cuvet en een instrument om deeltjesgrootte te meten.
2. Voorafgaand aan de metingen van de monsters, meet de deeltjesgrootte van twee bekende standaarden volgende protocol van de fabrikant voor de standaard voorbereiding en meting.
3. Vul het glas cuvet met 1,5 ml standaardoplossing en meet de standaard oplossing met behulp van dezelfde meting voorwaarden als de monsters.
  Opmerking: Vorige stap werd herhaald voor elke standaard.
4. Meet de monsters zoals opgesteld. Voor elk gebruik van de volgende experimentele parameters: een looptijd van 100 sec, brekingsindex van water (1,33), viscositeit van water bij 20 ° C (1.002 mPa sec).
  Opmerking: Deze techniek maakt gebruik van in frequentie verschoven licht om de grootte van de nanodeeltjes te meten.
5. Rapporteren de gemiddelde deeltjesdiameter en polydispersiteit van partikel grootteverdeling.
Smeltpunt en latente warmte van Melting
1. Gebruik een differentiële scanning calorimeter (DSC) voorzien van een autosampler en vloeibare stikstof koudebron het thermisch gedrag van SLN ¹ te onderzoeken.
2. Pipetteer de zo bereide SLN in een 40 gl aluminium pan met een massa van ongeveer 25 mg en hermetisch sluit de pan met een universele crimper druk om vochtverlies tijdens de DSC scan minimaliseren.
3. Meet elke nanoemulsion 5-80 ° C.
4. Rapporteer het smeltpunt en de latente smeltwarmte van de DSC grafiek, waarbij de vallei staat voor het smeltpunt en de integraal van het gebied onder de curve in de DSC-plot gedeeld door de hoeveelheid materiaal vertegenwoordigt de latente smeltwarmte.

2. SLN Interactie met fibroblasten en dendritische cellen

Cultuur van primaire humane fibroblasten
1. Cultuur primaire menselijke fibroblasts volgens de instructies van de fabrikant in vloeibaar medium voor het kweken van humane dermale fibroblasten (gemiddeld 106), aangevuld met de lage groei serum supplement (LSGS) kit. Handhaaf cellen in een bevochtigde atmosfeer bij 37 ° C, 5% _CO2 en subcultuur bij het bereiken van 80% confluentie.
2. Zowel MTT en beeldanalyse, zaadcellen in een 96-puts plaat bij een dichtheid van 2 x 10 ⁴ cellen per putje, en laat equilibreren bij 37 ° CO / N vóór SLN blootstelling.
3. Op tijdstip nul SLN verdund in compleet medium zoals aangeduid (figuur 4) met betrekking tot lipide concentratie, en voeg 10 ul per putje aan elk repliceren goed in de 96-well plaat.
4. Handhaaf cellen bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende de incubatieperiode.
MTT toxiciteit Assay
1. Na 24 uur incubatie met SLN bepalen cellulaire levensvatbaarheid met de MTT-bepaling, volgens het protocol van de fabrikant. </ li>
2. Was cellen eenmaal en voeg vers medium aan elk putje (100 ul / putje). Dood controleputjes door incubatie in 70% methanol gedurende 10 min voor het vervangen door vers medium.
3. Voeg MTT reagens (10 gl per putje) aan elk putje van de microtiterplaat en incubeer O / N bij 37 ° C.
4. Na O / N incubatie oplosbaar intracellulair formazine kristallen met de ontvangen reinigingsoplossing (100 gl per putje) volgens het protocol van de fabrikant.
5. Na 3 uur incubatie bij kamertemperatuur, verkregen absorptiewaarden gemeten bij een golflengte van 570 nm met behulp van een microplaat reader.
  Opmerking: MTT reagens moet minder dan 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyl tetrazolium bromide.
Fluorescentie microscopie
1. Op specifieke tijdstippen na toediening van fibroblasten met SLN, was de fibroblasten tweemaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gedurende 10 min vast met koude 70% methanol.
2. Na 10 minVervang de methanol met PBS en beelden vast te leggen met behulp van een omgekeerde microscoop, met behulp van een band pass (BP) 690/50 nm filter set.
Cultuur van de muis beenmerg dendritische cellen
1. Induceren muis beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC) zoals eerder beschreven ^23,24. In het kort plate enkele cel suspensies van C57BL / 10 beenmerg in 100 mm petrischalen bij 2 x 10 ⁶ / plaat met recombinant Muis granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF, 300 U / ml) en recombinant Muis IL-4 (B-cel stimulerende factor, 200 U / ml). Veranderen de media om de 3 dagen.
2. Op dag 7, voeg NiR geladen SLN de gerechten in een uiteindelijke concentratie van 0,5 en 5,0 ug / ml lipide en onderhouden van de cellen in een 37 ° C, 5% _CO2 incubator voor de gewenste duur van de blootstelling.
3. Verzamel cellen van de maaltijden door opzuigen alle media in de plaat, verzamelen in een 50 ml buis, gevolgd door grondig wassen van de plaat (losjes ad verjagenherent cellen) met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 4 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Verzamel de verkregen celsuspensie in dezelfde 50 ml buis.
Beoordeling van de SLN Incorporation via flowcytometrie
1. Bepaal de concentratie van de celsuspensie verkregen in punt 2.4.3 en distribueren 3x10 ⁵ cellen in een 12 mm x 75 mm ronde bodem FACS buis.
2. Was de cellen door toevoeging van 1 ml PBS en daarna centrifugeren van de buis gedurende 5 minuten bij 400 xg, bij een temperatuur van 4 ° C.
3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 100 pl PBS / 2 mM EDTA / 0,1% runderserumalbumine (BSA) (kleurbuffer) die anti-CD11c-FITC monoklonaal antilichaam (0,25 ug / ml uiteindelijk). Incubeer gedurende 30 min op ijs in het donker.
4. Was de cellen met 1 ml PBS en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 400 xg, bij een temperatuur van 4 ° C.
5. Verwijder het supernatant en resuspendeer elkepellet met 400 pl buffer kleuring. De cellen zijn nu klaar voor acquisitie van de monsters met een flowcytometer (eventueel uitgerust met blauwe en rode lasers).
6. Met behulp van flowcytometrie analyse software, een beoordeling van de integratie van de SLN van DC door gating op de bevolking van CD11c + cellen (FITC positief) en het vergelijken van de intensiteit van de SLN-geassocieerde fluorescentie (gemeten in de PerCP-Cy5.5 of APC kanalen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De PIT methode werd gebruikt om de SLN synthetiseren en de fase-inversie temperatuur werd bepaald onder gebruikmaking van een waterbad. De monsters werden verhit langzaam en voorzichtig geroerd totdat de oplossing helder was. De faseomkering temperatuur voor de SLN gemaakt met heneicosane lipide 45 ° C. Tabel 1 vat de deeltjesgrootte, polydispersiteit, smeltpunt en latente smeltwarmte de SLN. De SLN gesynthetiseerd met de verwerkingsvoorwaarden bovenbeschreven gevolg control SLN en NiR geladen SLN met een gemiddelde deeltjesdiameter van 18,59 en 16,87 nm en een polydispersiteit van 5,83 en 4,47, respectievelijk (figuur 3). De stabiliteit van de SLN dispersie werd gevolgd door het meten van de deeltjesgrootte in 6 dagen bij twee verschillende opslagtemperaturen (4 en 23 ° C). De deeltjesgrootte niet verandert dan 6 dagen (gegevens niet getoond).

Het thermisch gedrag van de SLN werd bestuderen enated met gebruikmaking van differentiële scanning calorimetrie. De gesynthetiseerde SLN een smeltpunt van 38,0 (± 0,4) en 36,8 (± 0,2) ° C voor de controle SLN en NiR geladen SLN respectievelijk. In tegenstelling, het smeltpunt van de massa lipide 40,0 ° C, waarin de onderdrukking van het smeltpunt van de SLN opzichte van de bulk lipide. Zoals verwacht, de beperking tot kleine afmetingen en grote oppervlakte-tot-volumeverhouding trap het nanodeeltje smeltpunt ^1. Bovendien is de latente smeltwarmte voor controle SLN en NiR-loaded SLN is 5,1 (± 0,2) en 4,0 (± 0,1) J / g, respectievelijk. Deze resultaten geven aan dat de mate van kristalliniteit van het SLN wordt beïnvloed door de lading, waarbij het NIR-loaded SLN vertoonde een lagere kristalliniteit vergeleken met de controlegroep SLN.

Figuur 3. Deeltjesgrootteverdeling vantypisch nano-emulsies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Monster	Deeltjesgrootte (nm)	Polydispersiteit	Smeltpunt (° C)	Latente smeltwarmte (J / g)
SLN (Control)	18,59	5.83	38,0 ± 0,4	5,1 ± 0,2
NiR-SLN	16,87	4.47	36,8 ± 0,2	4,0 ± 0,1

Tabel 1. Samenvatting van de fysische eigenschappen en thermische gedrag van de controle SLN en NiR-loaded SLN zoals deeltjesgrootte, polydispersiteit, smeltpunt en latente smeltend.

Om de interactie van deeltjes en cellulaire modellen onderzoeken, de dosering beperkingen van de SLN als rechtstreeks op primaire cellen in kweek, werden eerst vastgesteld. Met behulp van een MTT assay, de dosis-respons effect op de celstofwisseling werd gemeten, wanneer toenemende concentratie van deeltjes leidde tot een afname in cellulaire levensvatbaarheid (ten opzichte van de onbehandelde controlecellen). Er was geen waarneembaar verschil in toxiciteit tussen de cellen blootgesteld aan SLN alleen versus NiR geladen SLN deze vooraf bepaalde doses. Parallel werden cellen visueel onderzocht op hechting weefselkweek polystyreen en afbeeldingen werden genomen om de representatieve celmorfologie en de opname van fluorescerende partikels in de tijd (Figuur 5) te tonen. Met een dosis gelijk aan 5 ug / ml lipide (ongeveer 80% cellulaire levensvatbaarheid) deeltje opname werd waargenomen met 2 uur na blootstelling.

ys ">

Figuur 4. Levensvatbaarheid van primaire menselijke dermale fibroblasten na 24 uur incubatie met nanodeeltjes. Levensvatbaarheid werd gemeten met behulp van een MTT assay en gegevens stellen percentage levensvatbare cellen ten opzichte van onbehandelde controles. Concentraties vertegenwoordigen gewicht / volume lipide. Gegevens betreffen ten minste drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud. Fout balken geven de standaard fout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. primaire humane dermale fibroblasten na (A) en 2 (B) 24 uur incubatie met NiR-beladen nanodeeltjes. Nanodeeltjes concentratie gelijk aan 5 ug / ml lipide.Beelden zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd in tweevoud. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Op basis van de resultaten van de dosisbeperking studies, werd het verband tussen dosis en SLN toegevoegde gehalte in muizen BMDC onderzocht. Deze cellen worden algemeen beschouwd als de beste in vitro model van verschillende DC subsets bestaande in vivo en zorgen voor fundamenteel onderzoek niveau onderzoeken van zowel de cellulaire en moleculaire effecten van voorgenomen manipulaties. BMDC werden onbehandeld gelaten of blootstelling O / N ofwel 0,5 of 5,0 ug / ml lipide van het NIR-loaded SLN (vergelijkbaar met humane fibroblasten, gebruik van 50 ug / ml lipide resulteerde in minder dan 10% levensvatbare cellen) en het niveau van nanodeeltjes opname bepaald door de intensiteit van de fluorescentie in NiR BMDCs via flowcytometrie. Een directe Correning tussen de concentratie van SLN en de hoeveelheid van fluorescentie beoordeeld BMDCs waargenomen (figuur 6A). Een analyse van de kinetische NIR-loaded SLN opname bleek een zeer snelle opname door BMDC. De SLN fluorescentiesignaal was reeds duidelijk na 1 uur blootstelling, terwijl een plateau rond 5u blootstelling (Figuur 6B).

Figuur 6. SLN opname door dendritische cellen correleert met de concentratie van de blootstelling. (A) Muizen beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC) werden blootgesteld O / N NIR-SLN, de concentratie van lipide aangegeven, en het niveau van incorporatie geëvalueerd via flowcytometrie. Histogram overlays zijn allemaal gated op de CD11c + bevolking. (B) Kinetic van SLN incorporatie door BMDC. De cellen werden blootgesteld aan NiR-SLN (5ug / ml) voor de aangegeven tijd en het niveau van de fluorescentie (op gated CD11c + cellen) werd beoordeeld door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze studie, de synthese van SLN en hun toepasbaarheid voor intracellulaire targeting aanvragen onderzocht. Deze biocompatibele nanodeeltjes hebben aangetoond belofte als levering voertuigen voor verschillende toepassingen, waaronder drug delivery, gene silencing, en vaccin technologieën ^25-30. Ultraklein SLN werden gesynthetiseerd met behulp van een gemakkelijk proces en hun interacties met primaire huidcellen en primaire immune cellen werden onderzocht. SLN werden ontworpen om inkapseling van een fluorescerende kleurstof (NIR), die diende als voorbeeld therapeutische lading bevatten.

De PIT-methode werd gebruikt om te synthetiseren SLN en de resulterende deeltje eigenschappen (deeltjesgrootte, polydispersiteit, smeltpunt en latente warmte van het smeltproces) werden geëvalueerd met behulp van dynamische lichtverstrooiing en differentiële scanning calorimetrie. Deeltjesgrootte en polydispersiteit analyse bleek de synthese van ultra-kleine SLN met smalle polydispersiteit, ideaal voor intracellulaire doelwiting toepassingen. Zoals eerder gemeld, kan de deeltjesgrootte een belangrijke rol in de cellulaire interacties ¹² spelen. De omvang van nanodeeltjes is aangetoond dat het een dramatisch effect, beïnvloeden opname-efficiëntie, internalisatie pathway selectie, intracellulaire lokalisatie en cytotoxiciteit ^12. Enkele algemene trends met betrekking tot cel-nanodeeltjes interacties gedocumenteerd in de literatuur omvatten: kritische grootte kan variëren met het type en oppervlak cell eigenschappen van de nanodeeltjes en kleine nanodeeltjes hebben een hogere waarschijnlijkheid worden geïnternaliseerd door passieve-opname dan grote ¹² . Thermische analyse van de deeltjes in deze studie bleek een ander niveau van kristalliniteit (dwz latente smeltwarmte) tussen controle- SLN en die geladen met NiR kleurstof. De kristalliniteit van de SLN afgenomen door de toevoeging van de fluorescerende kleurstof, die als onzuiverheid. De kristalliniteit van het therapeutisch afgiftesysteem is aangetoond be een belangrijke factor die de levering beïnvloedt en dosis ^31. Een afname in kristalliniteit van het SLN voertuig parameters beïnvloeden zoals therapeutische laadvermogen en geneesmiddelafgiftekinetiek ^31. De PIT methode is een zachtere synthesetechniek vergeleken met andere methoden, met de beperking dat alleen lipofiele geneesmiddelen in de deeltjes worden opgenomen. Ondanks deze beperking, SLN gesynthetiseerd met behulp van deze methode zijn zeer biocompatibel, waardoor vervolgens geschikte delivery platform voor vele toepassingen in biomedisch onderzoek.

De effecten van SWK interactie menselijke dermale fibroblast levensvatbaarheid werden geanalyseerd met behulp van een MTT assay. Een dosisafhankelijke afname in levensvatbaarheid werd waargenomen met toenemende concentraties van SWK. Tijdens SLN synthese worden de lipidendeeltjes gestabiliseerd met een oppervlakte laag. Aangezien de deeltjesgrootte afneemt, oppervlakte toeneemt, evenals de mogelijke celoppervlak interacties en cellulaire blootstelling to de oppervlakte laag die celmembranen kunnen beschadigen. Deze experimenten liet het bepalen van de dosering concentratie waarbij cellulaire opname van deeltjes kan worden waargenomen met vermijding van een significante afname in cellevensvatbaarheid wegens verstoring membraan. MTT-analyse is een kwantitatieve techniek die breed toepasbaar voor het begrip van cellulaire gezondheid. Tegelijkertijd werden de cellen onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie om de fluorescentie van de lading fluorescerende kleurstof, NiR visualiseren. Met deze techniek werd deeltje opname waargenomen na 2 uren incubatie met menselijke fibroblasten. Fluorescentie microscopie verschaft kwalitatieve informatie over cellulaire morfologie en eigenschappen. Zorg moet worden genomen om overmatige achtergrondkleuring en imaging artefacten te vermijden. Bovendien, als muismodellen algemeen de eerste keuze voor diepgaande cellulaire en moleculaire onderzoeken, analyseerden we de interactie tussen SLN en muizencellen. In het bijzonder een groteinteresse ligt in het gebruik van nanodeeltjes van de selectieve en gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen die de werking van het immuunsysteem zou wijzigen. Bijgevolg flowcytometrie werd gebruikt om de opname van deeltjes met de muis dendritische cellen te meten. Deze gegevens bevestigden dat fagocytische cellen zoals dendritische cellen een vergelijkbare reeks SLN concentratie verdragen (met verminderde levensvatbaarheid waargenomen bij 50 pg / ml lipide als met menselijke dermale fibroblasten) en het toegevoegde gehalte rechtstreeks correleert met de concentratie van SLN blootstelling. Bovendien DC bleek een zeer snelle opname van SLN's, wat suggereert dat deze populatie een waardevolle doelgroep via SLN-gemedieerde drug delivery zou vertegenwoordigen.

Deze studie omvat de beschrijving van een werkwijze voor de synthese van ultra-kleine populaties van biocompatibele nanopartikels, evenals verschillende in vitro methoden waarmee hun cellulaire interacties te evalueren. In toekomstige studies, aanvullende testskan worden gebruikt om verder te karakteriseren het deeltje-cel interacties en uiteindelijk leiden de succesvolle ontwikkeling van therapeutische nanocarriers. Deze omvat studies van geneesmiddelafgifte, analyse van de cellulaire tropisme, de meting van pro-inflammatoire cytokine niveaus en analyse van de cellulaire transcriptomische tijd verandert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).