Analyse af Udvikling Tooth Kim innervation Brug Mikrofluid Co-kultur Devices

Summary

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Abstract

Innervation spiller en central rolle i udviklingen, homeostase og regenerering af organer og væv. Imidlertid er mekanismerne bag disse fænomener ikke godt forstået endnu. Især er den rolle, innervation i tand udvikling og regeneration forsømt.

Adskillige in vivo-undersøgelser har givet vigtige oplysninger om de mønstre af innervation af dental væv under udviklings- og reparation processer i forskellige dyremodeller. Men de fleste af disse fremgangsmåder ikke er optimale til at fremhæve den molekylære basis for interaktionerne mellem nervefibre og målorganer og væv.

Co-kulturer udgør en værdifuld metode til at undersøge og manipulere samspillet mellem nervefibre og tænder på en kontrolleret og isoleret miljø. I de sidste årtier har konventionelle co-kulturer under anvendelse af samme dyrkningsmedium udført i meget korte perioder (f.eks, to dage)at undersøge de attraktive eller frastødende effekter af at udvikle mundtlige og dental væv på sensoriske nervefibre. Imidlertid er udvidelse af kulturen periode, der kræves for at undersøge virkningerne af innervation på tanden morfogenese og cytodifferentiation.

Mikrofluidiksystemer tillader co-kulturer af neuroner og forskellige celletyper i deres passende kulturmedier. Vi har for nylig påvist, at trigeminale ganglier (TG) og tænder er i stand til at overleve i en lang periode, hvor co-dyrket i mikrofluide anordninger, og at de opretholder i disse betingelser samme innervation mønster, at de viser in vivo.

På dette grundlag beskriver vi, hvordan at isolere og co-kultur udvikler trigeminusganglier og tand bakterier i en mikrofluid co-kultur system.This protokol beskriver en enkel og fleksibel måde at co-kultur ganglier / nerver og målvæv og studere roller specifikke molekyler på sådanne interaktioner i et controlled og isoleret miljø.

Introduction

Innervation spiller en central rolle i udviklingen, homeostase og regenerering af organer og væv ^1,2. Endvidere er innervation involveret i reguleringen af stamcelleproliferation, mobilisering og differentiering ^3-5. Faktisk har de seneste undersøgelser realiseret i væv af orofacial kompleks vist, at parasympatiske nerver er nødvendige for epitelial stamceller funktion under udvikling og revitalisering af spytkirtlerne ^6,7. Ligeledes er det blevet vist, at innervation er nødvendigt for udviklingen og vedligeholdelsen af smagsløgene ^8-11. Det er således vigtigt at analysere de endnu forsømte roller innervation i udviklingen af ​​andre vigtige orofaciale organer og væv, såsom tænder.

På trods af den rige innervation af voksne tænder, og i modsætning til alle andre organer og væv i kroppen, udvikping tænder begynder at blive innerveret tidligst postnatale faser. Tænder udvikles som et resultat af sekventielle og gensidige interaktioner mellem den mundtlige ectoderm og kraniel neurale crest-afledte mesenchyme. Disse interaktioner giver anledning til epitel-afledte ameloblaster og mesenchym-afledte odontoblasts, der er ansvarlige for dannelsen af emalje og dentin, henholdsvis ^12. Sensoriske nerver fra trigeminusganglier og sympatiske nerver fra den overlegne cervikale ganglier innerverer den voksne tænder ^13-15. Under embryogenese, nervefibre udgår fra trigeminale ganglier projekt over for udviklingslandene tand kim, og gradvis omgiver dem, men de ikke trænge ind i dentale papil mesenkym ^13. Nervefibre ind i dental pulp mesenchym på mere avancerede udviklingsstadier, der korrelerer med odontoblast differentiering og dentin matrixdeponering ^16. Dental pulp innervation er gratiseted snart efter tandfrembrud i mundhulen ^13. Tidligere undersøgelser har vist, at forskellige semaphorins og neurotrophiner er involveret i reguleringen af innervation under odontogenese ^16-19. Tidligere undersøgelser har klart vist, at innervation er en forudsætning for tand dannelse i fishes ^20. Nyere undersøgelser har vist, at homeostase af dental mesenchym stamceller i mus fortænder reguleres af sensoriske nerver via sekretion af sonisk pindsvin (Shh) ^21. Ikke desto mindre rolle innervation i tand initiering, udvikling og regeneration er stadig meget kontroversielt i pattedyr ^22-24.

En overflod af in vivo studier har givet vigtige oplysninger om de mønstre af innervation af dental væv under udviklings- og reparation processer forskellige dyremodeller ^13,25,26. Men de fleste af disse hensigtsømhed ikke er optimale til at fremhæve den molekylære basis for samspillet mellem nervefibre og målorganer og væv. Co-kulturer udgør en værdifuld metode til at undersøge og manipulere samspillet mellem nervefibre og tænder på en kontrolleret og isoleret miljø ^26-29. Samtidig, co-dyrkning er underlagt forskellige tekniske justeringer. For eksempel, nerver og specifikke dental væv (f.eks dental pulp, dental follicle, dental epitel) kræver ofte forskellige kulturmedier for at sikre væv overlevelse for lange perioder ^30-32.

I de sidste årtier har konventionelle co-kulturer ved hjælp af den samme dyrkningsmedium udført i meget korte perioder (f.eks to dage) for at undersøge de attraktive eller frastødende effekter af at udvikle mundtlige og dental væv på sensoriske nervefibre ^27-29.Imidlertid er udvidelse af kulturen periode forpligtet til at undersøge virkningerne af innervation på tanden morfogenese og cytodifferentiation, og studere dynamikken i nervefibre forgrening inden målorganer. Derfor ville ikke-sammenhængende co-kulturer være mere passende at foretage undersøgelser neuronale-dental væv interaktioner.

Mikrofluidiksystemer tillader co-kulturer af neuroner og forskellige celletyper i deres passende kulturmedier. I disse indretninger er dental væv og neuroner adskilt i forskellige rum, samtidig med at væksten af axoner fra de neurale cellelegemer gennem mikrokanaler mod rum indeholdende deres målvæv ^33. Mikrofluidenheder er allerede blevet brugt til at studere samspillet mellem neuroner og mikroglia ^34,35 samt celle til celle interaktioner i kræft og neovaskularisering ^35. Desuden er disse systemer blevet anvendt til at undersøge samspillet mellem dorsal rodganglier og osteoblaster ^36.

Vi har for nylig påvist, at trigeminale ganglier (TG) og tænder er i stand til at overleve i lange perioder, hvor co-dyrket i mikrovæskeanordninger ^37. Desuden har vi påvist, at tænderne fra forskellige udviklingsstadier opretholde disse in vitro betingelser de samme frastødende eller attraktive virkninger på trigeminus innervation, at de viser in vivo ^37. Denne protokol indeholder oplysninger om en enkel, kraftfuld og fleksibel måde at co-kultur ganglier / nerver og målvæv og at studere roller specifikke molekyler på sådanne interaktioner i et kontrolleret og isoleret miljø.

Protocol

Alle mus blev opretholdt og håndteres i henhold til den schweiziske dyrevelfærd Law og i overensstemmelse med reglerne i Cantonal Veterinary kontoret, Zürich. 1. Udarbejdelse af Dissektion Materiel, Kultur Media, mikrofluidenheder Autoklave mikro-dissektion pincet og sakse (121 ° C, sterilisering tid: 20 min) og gemme dem i en steril beholder. Sterilisere dækglas (24 mm x 24 mm) ved at inkubere dem i 1 M HCI i 24 timer på en orbital ryster ved 37 ° C. Vaske dem tr…

Representative Results

Disse resultater viser, at isolerede trigeminusganglier kan vokse i et rum af mikrovæskeanordning og desuden, at udviklingen af ​​de isolerede tand bakterier opretholdes i en lang periode i det andet rum af mikrofluidapparatet. Forskellige kulturmedier anvendes i de to rum, og mikrorillerne mellem de to rum tillader udvidelse af axon fra trigeminus ganglion over for udviklingslandene tand bakterier. Figur 3 repræsenterer en visualisering af neurofilament via immunfluorescens 37, i en co…

Discussion

Forrige in vitro studier af tand innervation var baseret på konventionelle co-kulturer af trigeminusganglier og dental væv eller celler ^26,28,29. Disse undersøgelser blev udført for at undersøge hovedsagelig de attraktive virkninger af disse celler eller væv på sensoriske axoner ^38. Selvom bringe betydelige fremskridt på området, blev en række tekniske spørgsmål rejst. Tooth bakterier begynder at degenerere efter få dages kultur ^37. Baseret på disse observationer, …

Materials

AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033