マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

Abstract

神経支配は、臓器や組織の発達、ホメオスタシスおよび再生に重要な役割を果たしています。しかし、これらの現象の根底にあるメカニズムはまだよく理解されていません。具体的には、歯の発生と再生における神経支配の役割は無視されます。

in vivo試験でのいくつかは、様々な動物モデルの開発および修復プロセス中に歯の組織の神経支配のパターンに関する重要な情報を提供しています。しかし、これらのアプローチのほとんどは、神経線維と標的器官と組織との間の相互作用の分子的基礎を強調するために最適ではありません。

共培養物を制御し、隔離された環境で神経線維と歯の間の相互作用を調査し、操作するための貴重な方法を構成しています。過去数十年間で、同じ培地を用いた従来の共培養物は、非常に短い期間に行われている（ 例えば 、2日）感覚神経線維上の口腔や歯の組織の開発の魅力や反発効果を調査します。しかし、培養期間の延長は、歯の形態形成と細胞分化の神経支配の影響を調査するために必要です。

マイクロ流体システムは、適切な培養培地中のニューロンと異なる細胞型の共培養を可能にします。我々は最近、三叉神経節（TG）と歯が長期間生存することができることを実証している時に共培養マイクロ流体デバイスで、それらは、これらの条件で、それらが生体内で示す同一の神経支配のパターンを維持します。

これに基づき、我々は単離する方法を説明し、共培養マイクロ流体共培養system.Thisプロトコルで三叉神経節と歯の細菌の開発は神経節/神経および標的組織培養共同すると役割を研究するために、シンプルで柔軟な方法について説明しますCONTRでこのような相互作用の特定の分子のolledと隔離された環境。

Introduction

神経支配は、臓器や組織^1,2の発達、ホメオスタシスおよび再生に重要な役割を果たしています。 ^{5 -}さらに、神経支配は、幹細胞の増殖、分化及び動員³の調節に関与します。実際には、口腔顔面複合体の組織で実現最近の研究は、上皮前駆細胞は唾液腺^6,7の開発と再生中の機能のために副交感神経が必要であることを示しています。 ^{11 -}同様に、神経支配が味蕾⁸の開発及び維持のために必要であることが実証されています。したがって、このような歯のような他の重要な口腔顔面器官および組織の発達における神経支配のまだ無視役割を分析することが重要です。

大人の歯の豊富な神経支配にもかかわらず、ボディ、develo他のすべての臓器や組織とは対照的に、pingの歯は、最も初期の出生後の段階で神経支配され始めます。歯は口腔外胚葉および頭蓋神経堤由来の間葉間シーケンシャルと逆数の相互作用の結果として発生します。これらの相互作用は、それぞれ^12、上皮由来エナメル芽細胞とエナメル質や象牙質の形成に関与している間葉由来の象牙芽細胞を生じさせます。 ^{15 -}上頸神経節から三叉神経節および交感神経からの感覚神経は大人の歯^13を支配します。胚発生時には、神経線維は、現像歯胚に向けて三叉神経節プロジェクトから発せられると次第にそれらを囲むが、彼 ​​らは歯乳頭間葉¹³に浸透しません。神経線維は、象牙芽細胞分化と象牙質マトリックスの沈着¹⁶と相関より高度な発達段階に歯髄間葉を入力してください。歯髄神経支配はCOMPLですすぐに口腔¹³内の歯の噴火後にeted。 ^{19 -}これまでの研究では、様々なセマフォリンおよびニューロトロフィンは、歯牙¹⁶の間に神経支配の調節に関与することを明らかにしました。以前の研究は明らかに神経支配が魚²⁰で歯の形成のための前提条件であることを実証しました。より最近の研究は、ソニックヘッジホッグ^（SHH）21の分泌を介して感覚神経によって調節されるマウス切歯歯科間充織幹細胞の恒常性を示しました。 ^{24 -}それにもかかわらず、歯の開始、開発、再生中の神経支配の役割は、哺乳類²²にまだ非常に論争です。

インビボ研究の過多は、様々な動物モデル^13,25,26の開発および修復プロセス中に歯の組織の神経支配のパターンに関する重要な情報を提供しています。しかし、これらのほとんどは、アプロ痛みは、神経線維と標的器官と組織との間の相互作用の分子的基礎を強調するために最適ではありません。 ^{29 -}共培養は、制御され、隔離された環境²⁶に神経線維と歯の間の相互作用を調査し、操作するための貴重な方法を構成しています。同時に、共培養は、種々の技術的な調整を受けます。 ^{32 -}例えば、神経および特定の歯の組織（ 例えば、歯髄、歯小嚢、歯科上皮）は、多くの場合、時間^は30の長期間のための組織の生存を保証するために、異なる培地を必要とします。

^{29 -}過去数十年間で、同じ培地を用いた従来の共培養は、感覚神経線維²⁷の口腔および歯の組織を開発するの魅力や反発効果を調査するための非常に短い期間（ 例えば 、2日）のために行われています。しかし、培養期間の延長は、歯の形態形成および細胞分化における神経支配の影響を調査するために、および標的器官内の分岐神経線維の動態を研究するために必要とされます。したがって、非連続的な共培養は、神経、歯の組織の相互作用の研究を実行することがより適切であろう。

マイクロ流体システムは、適切な培養培地中のニューロンと異なる細胞型の共培養を可能にします。それらの標的組織^33を含む区画に向かってマイクロチャネルを介して神経細胞体からの軸索の成長を可能にしながら、これらのデバイスでは、歯の組織およびニューロンは、異なる区画に分離されます。マイクロ流体デバイスは、すでにがんや血管新生³⁵で細胞の相互作用へのニューロンとミクログリア^34,35との間の相互作用、ならびに細胞を研究するために使用されてきました。さらに、これらのシステムは、ドースの間の相互作用を研究するために使用されていますアル根神経節および骨芽細胞^36。

我々は最近、三叉神経節（TG）と歯が時間共培養した場合、マイクロ流体デバイス³⁷での長期間生存することができることを実証しています。また、我々は、異なる発達段階から歯がこれらのin vitroの条件彼らは生体内 ³⁷ に示す三叉神経支配で同じ反発や魅力的な効果に維持することを実証しました。このプロトコルは、単純な強力かつ柔軟な方法する共培養神経節/神経と標的組織と制御され、隔離された環境でのこのような相互作用の特定の分子の役割を研究するための情報を提供します。

Protocol

全てのマウスは、チューリッヒ、スイスの動物福祉法に、州立獣医局の規制に準拠してに従って維持し、取り扱いました。

解剖素材、文化メディア、マイクロ流体デバイスの作製

1. オートクレーブマイクロ解剖ピンセットやハサミ（121℃、滅菌時間：20分）、滅菌容器に保管してください。
2. 37℃でオービタルシェーカー上で24時間、1 M HCl中でそれらをインキュベートすることにより、ガラスカバースリップ（24ミリメートル×24 mm）を滅菌します。 99％エタノールで滅菌蒸留H ₂ O 3回とそれらを3回洗浄します。乾燥後、37℃または滅菌流フードの下でカバースリップ。最後に、滅菌を完了するためにUV光（30分）にカバースリップをオートクレーブまたは露出します。カバースリップは、次いで、70％エタノールに保存することができます。
3. 滅菌ピンセットを使用してパッケージから慎重AXIS軸索分離デバイ​​スを取り外し、滅菌ペトリ皿に置きます。 滅菌生検パンチ（φ：1ミリメートル）を使用すると、培養室に対応して（ 図1）で培養するサンプルあたり一つの穴を作成します。
   注：それらが適用された圧力によって損傷する可能性があるとして、微小溝に近すぎるパンチしないでください。
4. 70％エタノールでそれらを浸すことにより、AXIS軸索分離デバイ​​スを滅菌します。完全無菌流フードの下で乾燥した後、AXIS軸索分離デバイ​​スとカバーガラス。先に進む前に、3時間以上の間隔をあけてください。
   注：不完全な乾燥は、マイクロ流体デバイスの組立不良になります。
5. 6ウェルプレート内で35ミリメートルペトリ皿にまたはウェルに各カバースリップを置きます。
6. 絶縁装置とカバーガラスとの間に完全な接着を可能にするために曲がった端部を有するピンセットで慎重にしっかりとカバーガラスとプレスにAXIS軸索遮断装置を配置します。
7. ポリ-D-リジンの各培養室では、ピペットを150μl（滅菌蒸留H ₂で0.1 mg / mlのO）。培養チャンバからすべての空気を除去するために、5分間真空下でのマイクロ流体デバイスを置きます。
8. 空気は、依然としてチャンバへの再ピペットポリ-D-リジン溶液、チャンバ内見られる場合。
9. 37℃で、ポリ-D-リジンO / Nを有するデバイスをインキュベートします。
10. 滅菌蒸留H ₂ Oで室を3時間を洗います
11. 150（PBS中のシグマアルドリッチ、5μg/ mlの、または無血清培地）μlのラミニン作業溶液とチャンバーを記入し、37℃でO / Nインキュベート。
12. 48ミリリットルたNeurobasal培地、1mLのB-27、100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、5 ngの/ mlの神経成長因子（NGF）：三叉次のように構成される神経節培養³⁷のための培地50mlを準備、0.25のPMシトシンアラビノシド。
13. 40ミリリットルDMEM-F12 10mlのウシ胎児血清（FBS、最終濃度：20％）を以下のように構成され、歯胚培養³⁷培地50mlを調製し、100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、150 / mlのアスコルビン酸。

2.マウスの胚の発生と解剖

1. 膣プラグ（膣プラグ：開発0.5、E0.5の胚日）に応じて、胚の年齢を判断し、形態学的基準を介して確認します。このプロトコルのために、私たちは一般的にE14.5-E17.5マウス胚を使用しています。
2. 解剖エリアとエタノール70％でステレオスコープを清掃してください。
3. 頚椎脱臼を経由して妊娠中の母親を生け贄に捧げます。グリッド上に第一および第二指でマウスの首をブロックし、決定に尾を引きます。
4. 下腹部の周りの皮膚を切開し、はさみを使って腹部を開きます。子宮の位置を確認します：妊娠のような後期の段階で、子宮が豊富に腹腔を埋めます。
5. 氷上でPBSで満たされたチューブ内の子宮と場所を解剖。氷の上で、組織はいくつかの時間のために残すことができます。機関のガイドラインに従って、母の死体を捨てます
<LI>子宮から胚を解剖し、それらの胚体外組織からそれらを解放。氷上でPBS中で胚を置きます。
6. はさみを使用して胚を刎ねると、マイクロ解剖ハサミ（ 図2A）を使用して、ヘッドの残りの部分から下顎を分離します。三叉神経節を損傷することなく、正確に下顎を外します。後者は下顎に近接して局在しているように、それらの偶発的な損傷が可能です。氷上で、冷PBS中で下顎と頭の残りの部分を保持します。
7. TGを分析するには、頭を取ると、以前に冷PBSで満たされた解剖ガラスシャーレ上に置きます。鉗子を使用して、皮膚や頭蓋骨を削除します。終脳とリフトの下に鉗子を配置することにより、次に終脳と小脳を削除します。終脳と小脳が露出頭蓋骨の底部を残して、一緒に反転します。
8. （ 図2Bに示されている）三叉神経節をローカライズ。鉗子を使用してください三叉神経からTGを分離します。ナイフのように解剖針を使用して、三叉神経突起の残党を排除します。冷PBSで満たされたペトリ皿に解剖TGを配置し、氷上で保管してください。
9. 、胚の歯を解剖下顎を配置するには、以前に冷PBSで満たされた解剖ガラスシャーレ上に、頭蓋骨から分離。ナイフのように解剖針を使用して、舌と顎の周囲の皮膚を取り除きます。顎の正中線に沿って切断することにより、左右の半顎を分離します。 図1Cに示すように、歯胚は、簡単に可視化されます。解剖針を使用して歯胚を分離し、非歯の組織の過剰を取り除きます。冷PBSで満たされたペトリ皿に解剖歯胚を置き、氷上で保管してください。

3.マイクロ流体共培養

1. 解剖後、マイクロ流体デバイスからラミニンを削除します。 respecti200μlのチャンバーを埋めますメディアVEの。
2. ピンセットで、（ 図1D）を打ち抜いて作成した穴の中に静かに解剖し、TGと歯胚を転送します。歯胚が浮いていないことを確認し、彼らがカバーガラスに連絡するまで、彼らは沈むこと。
3. 培養を37℃、5％CO ₂のインキュベーター内のサンプル_。
4. 培地を48時間ごとに変更します。完全にチャンバーを空にしないでください、培養室に直接ピペットではありません。チャンバの完全な排出はチャンバ内の気泡の形成をもたらします。チャンバ内への直接ピペッティングは軸索損傷をもたらすであろう。これらの問題を回避するために、井戸の外側に向かってピペットポインティング培地を除去し、同様に、チャンバの反対側に位置井戸の側に新鮮な培地をピペット。
5. 培養期間中、同時培養を簡単タイムラプス顕微鏡によって画像化することができます。共培養物を10日間維持することができます。
6. 培養後のペリオD、室につき1つのウェルにPBSを150μlをピペットし、チャンバーを3回PBSを流すことにより、チャンバーを洗浄します。
7. PBSを除去し、チャンバー当たり1つのウェルに（PBS中）パラホルムアルデヒド150μlの4％をピペットでサンプルを修正。室温で15分間インキュベートします。
8. 3.6で説明したようにPBSで2回チャンバーを洗浄します。
9. さらに分析を進めます。

Representative Results

これらの結果は、単離された三叉神経節は、単離された歯の細菌の開発は、マイクロ流体デバイスの他の区画内の長期間持続すること、加えて、マイクロ流体デバイスの一の区画で成長し得ることを示します。異なる培地は、二つの区画で使用されると、2つの区画間マイクログルーブは、現像歯胚に向かって三叉神経節からの軸索の伸長を可能にする。 図3マウスの共培養において、免疫蛍光³⁷を介して、神経フィラメントの視覚化を表します記載のマイクロ流体共培養系における胚の三叉神経節およびマウス胚性切歯。一貫して、三叉神経節からの軸索が多く10日間培養での開発歯胚によって廃止されている。図3（a）は、この中に軸索室の概要を示し、マウスの門歯は、in vivoでの開発時に神経支配されていません。共培養系。 図3（b）及び（c）を示して軸索室とマイクロ畑内の神経突起の進行倍率。歯の細菌（または任意の共培養の器官または組織）は、組織学的染色のために、または遺伝子発現分析のために処理し、容易にマイクロ流体デバイスから除去され、別々に、例えば分析することができます。

上から搭載されたマイクロ流体共培養装置（A）図1.ビュー。 。（B）部分的に横方向の培養室（CC）は赤（エオシン）、青（トルイジンブルー）で強調表示されます。マイクログルーブ（mg）を培養チャンバー間の白い線として見ることができます。神経節と共培養した器官/組織が装置内にパンチ穴（PH）を介して適切な培養チャンバ内に配置されています。培地をウェル（MW）を介して追加され、削除されます。 「https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2（A）マウス胚の頭部の側面図（開発E14.5の胚日）。黒い線は、下顎の両方が三叉神経節と歯の細菌の完全性を維持するためにカットする場所を示しています。下顎、頭蓋骨と終脳を除去した後（B）マウス胚ヘッド（E14.5）。黒の矢印は、三叉神経節（TG）を示します。 （C）舌を除去した後のマウス胚（E14.5）の下顎。 （：; FM切歯：最初の臼歯社）黒矢印は、異なる歯胚の局在を示しています。 （D）マイクロ流体共培養装置の概略図。p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

三叉神経節および野生型E15.5マウス胚からの切歯歯胚の図3.共培養。軸索室の（A）の概要（ニューロフィラメント、DAPI）。スケールバー：300ミクロン。 （B）軸索室に成長マイクログルーブと神経突起の高倍率（ニューロフィラメント、DAPI;蛍光と明視野画像の重ね合わせ）。スケールバー：150μmの。 （C）微小溝内の軸索の成長を示す高倍率（神経フィラメント）。スケールバー：75μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

Discussion

歯の神経支配のインビトロ研究における前は三叉神経節及び歯の組織または細胞^26,28,29の従 ​​来の共培養に基づいていました。これらの研究は主に感覚軸索³⁸にこれらの細胞または組織の魅力的な効果を調査するために行きました。フィールドに大きな進歩をもたらしたが、いくつかの技術的な問題が提起されました。歯胚を培養³⁷の数日後に退化し始めます。これらの観​​察に基づいて、同じ培養条件下で成長したニューロン及び歯は、これら2つの組織間のクロストークに関与する分子のいずれかの最終的な解析を損ないます。最適な培養条件は、三叉神経節及び歯の組織の生理学的分子プロファイルを維持するために必要とされます。

マイクロ流体システムは、最適化されたメディア^34,36にニューロンおよび種々の細胞型の共培養でこれまでに使用されています。このマイクロ流体システムは、より多くの信仰を表すことができ完全に神経細胞体、軸索の端末と、標的組織は、一般に、異なる細胞および分子の微小環境にさらされているin vivoの状況。より最近では、マイクロ流体デバイスは、共培養全体後根神経節および骨芽細胞³⁶に使用されています。我々は最近、三叉神経節と歯が時間共培養した場合、マイクロ流体デバイス³⁷での長期間生存することができることを実証しました。また、我々は、異なる発達段階から歯がこれらのin vitroの条件彼らは生体内 ³⁷ に示した三叉神経支配で同じ反発や魅力的な効果に維持することを実証しました。

記載されているプロトコルは、三叉神経節と歯の細菌の顕微解剖のために、特に、練習と手先の器用さを必要とします。三叉神経節は、簡単に切開中に切断されます。したがって、我々は代わりに解剖力の解剖針の使用を示唆していますPS、神経節の周囲の組織を除去するために。周囲の間葉組織からそれを分離しながら、歯の上皮の損傷を避けるために、歯胚を解剖しながら、同様に、特に注意が必要です。過度の振動が培養カバーガラスに三叉神経節の接着性を損なうことができますようにまた、共培養の最初の日の間に、特に注意は、培養器の取り扱いに注意が必要です。共培養期間中、培地を除去する必要があり、培養室と反対側に、ウェルにピペッティングして添加しました。培養チャンバーの近傍で志望やピペットメディアが軸索損傷をもたらすであろう。

説明されたプロトコルは、いくつかの胚および胚の器官または出生後の組織および細胞タイプの神経支配を研究するために改変することができます。マイクロ流体システムは、ニューロン、成長ティーとの間の相互作用の研究のための、より長い培養期間を可能にするために、適切なプラットフォームを表すことができ番目。また、歯科用コンパートメントからニューロンの分離は、特定のタンパク質の局在化および定量^33,37の効果の分析を可能にします。ブロッキング抗体または組換えタンパク質はまた、ニューロンおよび歯の組織に及ぼす​​影響を分析するためのマイクロ流体デバイスの別々の区画に加えることができます。例えば、NGFと三叉神経節の治療は、それらの生存をサポートし、神経細胞の伸長を可能にします。しかし、この作品の外因性でNGFは、歯由来のシグナルが神経引力や反発力のための唯一の原因である歯胚コンパートメント、存在しません。同様に、他の組換え分子は、抗体または薬剤は、制御された状態でシステムを操作するために使用することができます。

提示されたプロトコルの主な制限は、商業マイクロ流体デバイスの相対的なコストが高く、基本的に2D-セット共培養系のアップに存在します。実際には、全体の臓器を培養することができますが、D、両方の臓器や軸索がカバーガラス上に2D接着性培養条件で増殖します。システムのカスタマイズは、神経支配の三次元、現実的な表現を得るために必要とされます。

結論として、マイクロ流体デバイスは、臓器の開発や再生中の神経支配の役割を調査し、最適な培養条件におけるニューロンと標的組織との間の相互作用の研究を可能にするために最適です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS Axon Isolation Devices	Millipore	AX15010-TC	Microchannels of different lenght are available
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
Recombinant Mouse beta-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12	Gibco	11320-033