Abstract
Innervazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo, omeostasi e la rigenerazione di organi e tessuti. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi fenomeni non sono ancora ben compresi. In particolare, il ruolo di innervazione in sviluppo dentale e rigenerazione è trascurato.
Diversi studi in vivo hanno fornito importanti informazioni sui modelli di innervazione di tessuti dentali durante lo sviluppo e riparazione processi di vari modelli animali. Tuttavia, la maggior parte di questi approcci non sono ottimali per evidenziare le basi molecolari delle interazioni tra le fibre nervose e organi bersaglio e dei tessuti.
Co-culture costituiscono un valido metodo per indagare e manipolare le interazioni tra le fibre nervose e denti in un ambiente controllato e isolato. Negli ultimi decenni, co-colture convenzionali utilizzando lo stesso terreno di coltura sono stati effettuati per periodi molto brevi (ad esempio, due giorni)per studiare gli effetti di attrazione o repulsione di sviluppare tessuti orali e dentali su fibre nervose sensoriali. Tuttavia, l'estensione del periodo di coltura è necessario per studiare gli effetti del innervazione sul dente morfogenesi e citodifferenziazione.
Sistemi di microfluidica permettono co-colture di neuroni e diversi tipi di cellule nella loro terreni di coltura appropriati. Abbiamo recentemente dimostrato che gangli del trigemino (TG) ed i denti sono in grado di sopravvivere per un lungo periodo di tempo in cui co-coltivate in dispositivi microfluidici, e che mantengono in queste condizioni lo stesso modello innervazione che mostrano in vivo.
Su questa base, si descrive come isolare e co-coltura di sviluppo del trigemino gangli e dei denti germi in un protocollo di co-coltura microfluidica system.This descrive un modo semplice e flessibile di co-coltura gangli / nervi e tessuti bersaglio e per studiare i ruoli di molecole specifiche su tali interazioni in un controlled e ambiente isolato.
Introduction
Innervazione svolge un ruolo chiave nello sviluppo, omeostasi e la rigenerazione di organi e tessuti 1,2. Inoltre, innervazione è coinvolto nella regolazione della proliferazione delle cellule staminali, la mobilitazione e la differenziazione 3-5. Infatti, recenti studi realizzati in tessuti del complesso orofacciale hanno dimostrato che i nervi parasimpatici sono necessari per la funzione epiteliali cellule progenitrici durante lo sviluppo e la rigenerazione delle ghiandole salivari 6,7. Analogamente, è stato dimostrato che innervazione è necessario per lo sviluppo e il mantenimento delle papille gustative 8 - 11. Pertanto, è importante analizzare i ruoli ancora trascurati innervazione nello sviluppo di altri importanti organi e tessuti orofacciali come i denti.
Nonostante la ricca innervazione dei denti adulti, e in contrasto con tutti gli altri organi e tessuti del corpo, svidenti ping cominciano ad essere innervato nelle fasi postnatali prime. Denti si sviluppano a causa di interazioni sequenziali e reciproche tra l'ectoderma orale e cranio neurale mesenchima crest-derivati. Queste interazioni danno luogo a ameloblasts epiteliali derivate e odontoblasti mesenchima-derivati che sono responsabili della formazione di smalto e dentina, rispettivamente 12. Nervi sensoriali del gangli trigeminali e nervi simpatici dai gangli cervicale superiore innervano i denti adulti 13 - 15. Durante l'embriogenesi, fibre nervose che emana dal progetto gangli trigeminali verso i germi di sviluppo dei denti e progressivamente li circondano, ma non penetrare nel dentale papilla mesenchima 13. Fibre nervose entrano la polpa dentale mesenchima a stadi di sviluppo più avanzati che correlano con la differenziazione odontoblast e matrice dentina deposizione 16. Dental polpa innervazione è completed subito dopo l'eruzione dei denti nel cavo orale 13. Studi precedenti hanno rivelato che diversi semaforine e neurotrofine sono coinvolti nella regolazione della innervazione durante l'odontogenesi 16-19. Studi precedenti hanno chiaramente dimostrato che innervazione è un prerequisito per la formazione dei denti nei pesci 20. Studi più recenti hanno dimostrato che l'omeostasi delle cellule staminali mesenchima dentale in incisivi mouse è regolata da nervi sensoriali attraverso la secrezione di sonic hedgehog (Shh) 21. Tuttavia, il ruolo di innervazione in dente iniziazione, lo sviluppo e la rigenerazione è ancora molto controversa nei mammiferi 22 - 24.
Una pletora di studi in vivo hanno fornito importanti informazioni sui modelli di innervazione di tessuti dentali durante lo sviluppo e riparazione processi di vari modelli animali 13,25,26. Tuttavia, la maggior parte di questi Approdolori non sono ottimali per evidenziare le basi molecolari delle interazioni tra le fibre nervose e organi bersaglio e dei tessuti. Co-culture costituiscono un valido metodo per indagare e manipolare le interazioni tra le fibre nervose e denti in un ambiente controllato e isolato 26 a 29 -. Allo stesso tempo, co-coltura è soggetta a varie regolazioni tecniche. Ad esempio, nervi e tessuti dentali specifici (ad esempio, pasta dentale, follicolo dentale, epitelio dentale) spesso richiedono terreni di coltura diversa per garantire la sopravvivenza del tessuto per lunghi periodi di tempo 30-32.
Negli ultimi decenni, co-colture convenzionali che utilizzano lo stesso mezzo di coltura sono stati effettuati per periodi molto brevi (ad esempio, due giorni) per studiare gli effetti di attrazione o repulsione di sviluppare tessuti orali e dentali sulle fibre nervose sensoriali 27-29.Tuttavia, l'estensione del periodo di coltura è necessario per studiare gli effetti di innervazione sul dente morfogenesi e citodifferenziazione, e per studiare le dinamiche di fibre nervose si diramano all'interno organi bersaglio. Pertanto, co-colture non contigui sarebbe più adatto per realizzare studi su tessuti interazioni neuronali-dentale.
Sistemi di microfluidica permettono co-colture di neuroni e diversi tipi di cellule nella loro terreni di coltura appropriati. In questi dispositivi, tessuti dentali e neuroni sono separati in differenti compartimenti, pur consentendo la crescita degli assoni dai corpi cellulari neuronali attraverso microcanali verso il compartimento contenente il tessuto bersaglio 33. Dispositivi microfluidici sono già stati utilizzati per studiare le interazioni tra neuroni e microglia 34,35, così come cellule alle interazioni cellulari nel cancro e neovascolarizzazione 35. Inoltre, questi sistemi sono stati utilizzati per studiare le interazioni tra dorsal gangli e osteoblasti 36.
Abbiamo recentemente dimostrato che gangli del trigemino (TG) ed i denti sono in grado di sopravvivere per lunghi periodi di tempo quando co-coltivate in dispositivi microfluidici 37. Inoltre, abbiamo dimostrato che i denti da diverse fasi di sviluppo di mantenere in queste condizioni in vitro gli stessi effetti ripugnanti o attraenti innervazione del trigemino che mostrano in vivo 37. Questo protocollo fornisce informazioni su un modo semplice, potente e flessibile di co-coltura gangli / nervi e tessuti bersaglio e per studiare il ruolo di molecole specifiche su tali interazioni in un ambiente controllato e isolato.
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Protocol
Tutti i topi sono stati mantenuti e gestiti secondo la Legge benessere degli animali svizzera e nel rispetto delle norme del ufficio cantonale di veterinaria, Zurigo.
1. Preparazione di dissezione Materiale, Cultura Media, dispositivi microfluidici
- Autoclave pinze micro-dissezione e forbici (121 ° C, tempo di sterilizzazione: 20 min) e conservarle in un contenitore sterile.
- Sterilizzare coprioggetto di vetro (24 mm x 24 mm) da loro incubazione in 1 M HCl per 24 ore in un agitatore orbitale a 37 ° C. Lavare per tre volte con una soluzione sterile, H 2 O distillata e tre volte con etanolo 99%. Secco poi i coprioggetti a 37 ° C o sotto cappa a flusso sterile. Infine, autoclave o esporre i coprioggetti alla luce UV (30 min) per completare la sterilizzazione. Coprioggetto possono essere conservati in etanolo al 70%.
- Rimuovere accuratamente i dispositivi di isolamento AXIS Axon dal pacchetto con pinza sterile e metterli in una piastra di Petri sterile. Utilizzando una biopsia sterile (ø: 1mm) creare un foro per ogni campione da coltivate (figura 1) in corrispondenza delle camere di coltura.
NOTA: Non pugno troppo vicino alle microscanalature, in quanto potrebbero essere danneggiati dalla pressione applicata. - Sterilizzare i dispositivi di isolamento AXIS Axon da loro immergendo in etanolo al 70%. Asciutto, quindi AXIS Axon dispositivi di isolamento e coprioggetti completamente sotto una cappa a flusso sterili. Attendere almeno 3 ore prima di procedere.
NOTA: essiccazione incompleta provocherà assemblaggio difettoso dei dispositivi microfluidici. - Posizionare ogni vetrino in una capsula di Petri da 35 mm o in un pozzo all'interno di un 6-pozzetti.
- Posizionare il dispositivo di isolamento AXIS Axon sul vetrino e premere delicatamente ma con fermezza, con una pinza con estremità piegate in modo da consentire la piena adesione tra il dispositivo di isolamento e il vetrino di vetro.
- In ciascuna camera di coltura, pipetta 150 ml di poli-D-lisina (0,1 mg / ml in sterile, distillata H 2O). Posizionare i dispositivi microfluidici sotto vuoto per 5 minuti, per eliminare tutta l'aria dalle camere di coltura.
- Se l'aria è ancora visibile all'interno delle camere, ri-pipetta la soluzione poli-D-lisina nelle camere.
- Incubare i dispositivi con poli-D-lisina O / N a 37 ° C.
- Lavare camere tre volte con sterili, H 2 O. distillata
- Riempire camere con 150 microlitri soluzione laminina lavoro (Sigma-Aldrich, 5 mcg / ml, in PBS o terreno privo di siero), e incubare O / N a 37 ° C.
- Preparare 50 ml di terreno per le colture gangli trigeminali 37, così composto: 48 ml Neurobasal medio, 1 ml di B-27, 100 U / ml di penicillina / streptomicina, 2 mM L-glutammina, 5 ng / ml fattore di crescita nervoso (NGF) , 12:25 citosina arabinoside.
- Preparare 50 ml di mezzo di crescita per dente germinali 37, così composto: 40 ml DMEM-F12, 10 ml di siero bovino fetale (FBS, concentrazione finale: 20%), 100 U / ml di penicillina / streptomicina, 2 mM L-glutammina, 150 mg / ml di acido ascorbico.
Embrione Generazione ed Dissection 2. mouse
- Determinare l'età embrionale secondo tappo vaginale (spina vaginale: embrionale giorno di sviluppo 0.5, E0.5) e confermare tramite criteri morfologici. Per questo protocollo, generalmente usiamo gli embrioni E14.5 E17.5-mouse.
- Pulire l'area dissezione e lo stereoscopio con etanolo al 70%.
- Sacrifica la madre incinta tramite dislocazione cervicale. Bloccare il collo del mouse con il primo e secondo dito su una griglia, e tirare con decisione la coda.
- Sezionare la pelle intorno basso addome, e aprire l'addome con le forbici. Individuare l'utero: durante queste ultime fasi della gravidanza, l'utero abbondantemente riempire la cavità addominale.
- Sezionare l'utero e posto in un tubo riempito con PBS sul ghiaccio. Quando sul ghiaccio, il tessuto può essere lasciato per vari hr. Eliminare il cadavere della madre in base alle linee guida istituzionali <li> sezionare gli embrioni dall'utero e liberarli dai loro tessuti extraembrionali. Mettere gli embrioni in PBS sul ghiaccio.
- Decapitare gli embrioni con forbici, e separare la mascella inferiore dal resto della testa con le forbici micro-dissezione (Figura 2A). Rimuovere proprio la mascella inferiore, senza danneggiare i gangli del trigemino; come quest'ultimo sono localizzate in prossimità della mascella inferiore, il loro danneggiamento accidentale è possibile. Conservare la mandibola e il resto della testa in PBS freddo, sul ghiaccio.
- Per sezionare TG, prendere la testa e metterlo su un piatto di vetro Petri dissezione, già pieno di PBS freddo. Utilizzando le pinze, togliere la pelle e il cranio. Rimuovere poi il telencefalo e il cervelletto ponendo forcipe sotto telencefalo e ascensore; telencefalo e cervelletto si capovolgere insieme, lasciando il fondo del cranio esposto.
- Localizzare gangli del trigemino (Figura 2B). Utilizzare le pinzeper separare il TG dai nervi trigemino. Eliminare i resti delle proiezioni trigeminali con gli aghi di dissezione come coltelli. Posizionare il TG sezionato in una capsula di Petri riempita con PBS freddo e tenerli su ghiaccio.
- Per sezionare denti embrionali, posizionare la mascella inferiore, precedentemente separato dal cranio, sulla piastra di Petri di vetro dissezione, pieno di PBS freddo. Usando aghi dissezione come coltelli, rimuovere la lingua e la pelle che circonda la mascella. Separare la destra emi-griffe sinistra e tagliando lungo la linea mediana della mandibola. I germi dei denti sono facilmente visibili, come mostrato nella Figura 1C. Isolare i germi dei denti utilizzando aghi dissezione e rimuovere l'eccesso di tessuti non-dentali. Posizionare i germi dente sezionato in una capsula di Petri riempita con PBS freddo e tenerli su ghiaccio.
3. Microfluidic co-culture
- Dopo la dissezione, rimuovere laminina dai dispositivi microfluidica. Riempire le camere con 200 microlitri della respective media.
- Con pinze, trasferire delicatamente i TG e dei denti germi sezionato nei fori creati dalla punzonatura (Figura 1D). Assicurarsi che i germi dei denti non galleggiano e che affondano fino a quando entrano in contatto con le lamelle.
- Cultura campioni in incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Modificare il terreno di coltura ogni 48 ore. Non svuotare le camere completamente, e non pipettare direttamente nelle camere di coltura. Completo svuotamento delle camere comporterebbe la formazione di bolle d'aria all'interno delle camere; pipettaggio diretto nella camera potrebbe causare un danno assonale. Per evitare questi problemi, rimuovere il supporto punta della pipetta verso il lato esterno dei pozzetti; analogamente, pipettare il mezzo fresco sulla parete del pozzetto situato di fronte alle camere.
- Durante il periodo di coltura, co-culture possono essere facilmente ripreso al microscopio time-lapse. Co-culture possono essere mantenuti per più di 10 giorni.
- Dopo il perio culturad, lavare le camere pipettando 150 ml di soluzione in un pozzo per ogni camera, e lasciando PBS fluire attraverso le camere per tre volte.
- Rimuovere la PBS e fissare i campioni pipettando 150 ml di paraformaldeide 4% (in PBS) in un pozzetto per camera; incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Lavare le camere due volte con PBS come descritto in 3.6.
- Procedere con ulteriori analisi.
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Representative Results
Questi risultati mostrano che isolati gangli trigemini possono crescere in un compartimento del dispositivo microfluidico e, inoltre, che lo sviluppo dei germi isolati dente è mantenuta per un lungo periodo di tempo in altro compartimento del dispositivo microfluidico. Diversi terreni di coltura sono utilizzati nei due scomparti, e le microscolpiture tra i due compartimenti consentono estensione dell'assone dal ganglio trigeminale verso i germi di sviluppo dei denti. Figura 3 rappresenta una visualizzazione di neurofilamenti tramite immunofluorescenza 37, in una co-coltura di un mouse embrionale ganglio trigeminale e mouse incisivo embrionali nel sistema di co-coltura microfluidica descritto. Incisivi mouse non sono innervati durante lo sviluppo in vivo,. Sempre, assoni del ganglio trigeminale sono abrogati dal dente sviluppando germe di cultura per ben 10 giorni la figura 3A mostra una panoramica della camera assonale in questo sistema di co-coltura. Figura 3B e 3C mostrano ingrandimenti progressivi dei neuriti all'interno delle camere assonale e delle micro-boschetti. Germi dente (o qualsiasi co-colture di organi o tessuti) possono essere facilmente rimossi dai dispositivi microfluidici e analizzate separatamente esempio, preparate per colorazioni istologiche o per l'analisi di espressione genica.
Figura 1. Vista di montaggio dispositivo microfluidica co-coltura (A) dall'alto; . (B) in parte laterale Le camere di coltura (cc) sono evidenziati in rosso (eosina) e blu (blu di toluidina); microsolchi (mg) può essere visto come una linea bianca tra le camere di coltura. Gangli e co-coltura organi / tessuti vengono inseriti nella camera di cultura adeguata attraverso i fori (ph) nel dispositivo. Media sono aggiunti e rimossi tramite i pozzi (MW). Target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. (A) Vista laterale di una testa di topo embrione (giorno di sviluppo embrionale E14.5). La linea nera indica dove la mascella inferiore deve essere tagliato al fine di preservare l'integrità di entrambi i gangli e dei denti germi trigemino. Testa (B) del mouse embrione (E14.5) dopo la rimozione della mascella inferiore, cranio e telencefalo. Frecce nere indicano gangli trigeminali (TG). (C) inferiore mascella di embrione di topo (E14.5) dopo asportazione della lingua. Frecce nere indicano la localizzazione dei diversi germi dente (Inc: incisivi; FM: primi molari). (D) Rappresentazione schematica del dispositivo di co-coltura microfluidica.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Co-cultura del ganglio trigeminale e dente incisivo germe da wild-type embrioni di topo E15.5. (A) Panoramica della camera assonale (neurofilamento, DAPI). Scala bar: 300 micron. (B) ingrandimento maggiore delle microscanalature e neuriti in crescita nella camera assonale (neurofilamento, DAPI, sovrapposizione di immagini fluorescenti e campo chiaro). Scala bar: 150 micron. (C) Maggiore ingrandimento che mostra la crescita degli assoni nei microsolchi (neurofilamenti). Scala bar:. 75 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Precedente in studi in vitro di dente innervazione erano basati su co-colture convenzionali di gangli trigeminali e tessuti dentali o cellule 26,28,29. Sono stati condotti Questi studi per investigare principalmente gli effetti interessanti di queste cellule o tessuti di assoni sensoriali 38. Anche se portare significativi progressi nel campo, alcuni problemi tecnici sono state sollevate. Germi denti cominciano a degenerare dopo pochi giorni di coltura 37. Sulla base di queste osservazioni, neuroni in crescita e denti nelle stesse condizioni di coltura alterino eventuale analisi di molecole coinvolte nel cross talk tra questi due tessuti. Condizioni di coltura ottimali sono necessari per salvaguardare il profilo fisiologico molecolare di gangli trigeminali e tessuti dentali.
Sistemi di microfluidica sono stati utilizzati finora per co-coltura di neuroni e vari tipi di cellule nei media ottimizzato 34,36. Questo sistema microfluidica può rappresentare più fedeappieno la situazione in vivo, dove i corpi cellulari neuronali, terminali assoni e tessuti target sono generalmente esposti a differenti microambienti cellulari e molecolari. Più recentemente, i dispositivi microfluidici sono stati utilizzati per co-coltura intera gangli della radice dorsale e osteoblasti 36. Abbiamo recentemente dimostrato che gangli trigeminali e denti sono in grado di sopravvivere per lunghi periodi di tempo in cui co-coltura in dispositivi microfluidici 37. Inoltre, abbiamo dimostrato che i denti da diverse fasi di sviluppo di mantenere in queste condizioni in vitro gli stessi effetti ripugnanti o attraenti innervazione del trigemino che esposte in vivo 37.
Il protocollo descritto richiede pratica e destrezza manuale, in particolare per la microdissezione del trigemino gangli e dei denti germi. Gangli trigeminali sono facilmente strappati durante la dissezione. Pertanto, si consiglia l'uso di aghi dissezione invece di forza dissezioneps, al fine di rimuovere il tessuto circostante gangli. Allo stesso modo, particolare attenzione dovrebbe essere presa mentre dissezione germi dei denti, al fine di evitare di danneggiare l'epitelio dente mentre la separa dai tessuti mesenchimali circostanti. Inoltre, durante il primo giorno di co-coltura, particolare attenzione dovrebbe essere presa nella gestione della incubatrice, come vibrazioni eccessive può compromettere trigemino ganglio adesione al vetrino cultura. Durante il periodo di co-coltura, supporti devono essere rimossi e aggiunti pipettando nei pozzetti, sul lato opposto alle camere di coltura. Aspiranti o pipettaggio media in prossimità delle camere di coltura si tradurrebbe in un danno assonale.
Il protocollo descritto può essere modificato per studiare l'innervazione di diversi organi e tessuti embrionali embrionali o postnatali e tipi di cellule. Sistemi di microfluidica potrebbe rappresentare una piattaforma adeguata per consentire periodi più lunghi per la cultura lo studio delle interazioni tra i neuroni e tee crescenteesimo. Inoltre, la separazione della neuronale dal vano dentale permette l'analisi degli effetti della localizzazione specifica proteina e quantificazione 33,37. Anticorpi bloccanti o proteine ricombinanti potrebbero anche essere aggiunti ai compartimenti separati dei dispositivi microfluidica per analizzare i loro effetti sui tessuti neuronali e dentali. Ad esempio, il trattamento dei gangli del trigemino con NGF sostiene la loro sopravvivenza e permette escrescenza neuronale. Tuttavia, in questo esogena lavoro NGF è assente dal vano dente germe, dove i segnali dente-derivati sono l'unico responsabile per attrazione o repulsione neuronale. Analogamente, altre molecole ricombinanti, anticorpi o farmaci possono essere utilizzati per manipolare il sistema in condizioni controllate.
Le principali limitazioni del protocollo presentato risiedono nella elevata costo relativo di dispositivi microfluidici commerciali e la sostanza, 2D-set up del sistema di co-coltura. Infatti, sebbene organi interi possono essere culturad, entrambi gli organi e degli assoni crescono in condizioni di coltura 2D-aderenti su un vetrino di vetro; personalizzazione del sistema sarebbe necessario per ottenere una tridimensionale, rappresentazione realistica di innervazione.
In conclusione, i dispositivi microfluidici sono ottimali per studiare il ruolo di innervazione in sviluppo o rigenerare organi e permettono lo studio delle interazioni tra neuronali e di destinazione tessuti in condizioni di coltura ottimali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
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