यहाँ हम इन विट्रो में propriospinal कनेक्शन के कार्यात्मक उत्थान का अध्ययन करने के लिए बहु-इलेक्ट्रोड सरणियों पर संवर्धित रीढ़ की हड्डी की स्लाइस पर आधारित है कि एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के organotypic टुकड़ा संस्कृतियों neuronal विकास से neurodegeneration तक पहुँचने के लिए विभिन्न शारीरिक और रोग की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। अलग सेल संस्कृतियों की तुलना में, organotypic स्लाइस एक अक्षुण्ण cytoarchitecture और स्थानीय अन्तर्ग्रथनी circuitry के साथ अधिक जटिलता का लाभ प्रदान करते हैं। इसी समय, ऊतक विवो संदर्भ में पूरी की जटिलता को फंसाने के लिए आवश्यकता के बिना एक अलग तरह से विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, चुनाव की कोशिकाओं के लिए आसान और बार-बार उपयोग, warranted है बाह्य वातावरण ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है और आम तौर पर, इन विट्रो मॉडल उनके इन विवो समकक्षों की तुलना में कम महंगे हैं। हाल के वर्षों में, विभिन्न अध्ययनों इसी रहने वाले जानवरों 1,2 बनाम दीर्घकालिक संस्कृतियों के विकास की प्रोफाइल के बीच हड़ताली समानता प्रस्तुत किया। यह विभिन्न सीएनएस Regio की कि neuronal सर्किट दिखाया गया हैएनएस विकास के दौरान सहज नेटवर्क गतिविधि को व्यक्त करने और organotypic स्लाइस आंशिक रूप से इस घटना 3 -7 का कहना है कि। पृथक रीढ़ की हड्डी की तैयारी विशेष रूप से ताल पीढ़ी 6 और neuronal सर्किट 1 के गठन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
Organotypic स्लाइस की सहज गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए एक रास्ता बहु इलेक्ट्रोड सरणियों (MEAS) के शीर्ष पर संस्कृति उनके लिए है। इन उपकरणों के कई एक साथ कोशिकाओं (बहु इकाई रिकॉर्डिंग) से कार्रवाई की क्षमता के द्वारा उत्पन्न बाह्य क्षमता की निगरानी कर सकते हैं कि कई इलेक्ट्रोड होते हैं। विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग के उच्च अस्थायी समाधान के लिए एक दिया न्यूरोनल सर्किट के भीतर सटीक गतिविधि गतिशीलता को फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, के विपरीत पैच-clamping तकनीक न्यूरॉन्स उनके व्यवहार में प्रभावित नहीं कर रहे हैं कि वास्तव में लंबी अवधि के माप और परिणाम परमिट है, जो गैर-आक्रामक है।
एफया इस अध्ययन का उद्देश्य, organotypic रीढ़ की हड्डी सह संस्कृतियों और एकाधिक रिकॉर्डिंग के संयोजन रीढ़ की हड्डी के भीतर कार्यात्मक उत्थान जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। वयस्क उच्च रीढ़ रीढ़ की हड्डी के नुकसान से उबरने के लिए संभावित सीमित है के बाद से, विभिन्न रणनीतियों रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद उत्थान को बढ़ावा देने के लिए अध्ययन किया गया है। अब तक, corticospinal पथ आमतौर पर इस तरह की जाँच के लिए पसंद की मॉडल प्रणाली की गई है। इन प्रयोगों आम तौर पर समय लेने वाली है, महंगे हैं और कारण एकल समूहों के भीतर उच्च परिवर्तनशीलता के लिए बड़े जानवर साथियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सबूत propriospinal कनेक्शन (पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी के भीतर ही सीमित कर रहे हैं कि न्यूरॉन्स) रीढ़ की हड्डी घावों 8 निम्नलिखित वसूली की प्रक्रिया में एक निर्णायक भूमिका निभा सकते हैं कि पता चलता है। इन तंतुओं आरोही और फाइबर इलाकों उतरते के हस्तक्षेप के बिना विवो में अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो जाता है। Bonnici और Kapfhammer 9 अनुदैर्ध्य रीढ़ की हड्डी का इस्तेमाल कियाएक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में प्रसव के बाद चूहों की टुकड़ा संस्कृतियों। यांत्रिक घावों प्रदर्शन करने के बाद वे अर्द्ध मात्रात्मक रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों के बीच axons की रूपात्मक उत्थान का विश्लेषण किया। वे एक परिपक्व उम्र में कटौती संस्कृतियों में घाव साइट पार करने में कम नहीं है लेकिन कोई भी एक्सोन मनाया। 7 दिन क्षति के बाद – इसके विपरीत, एक युवा अवस्था में lesioned थे कि संस्कृतियों 5 axonal उत्थान के एक उच्च राशि का प्रदर्शन किया। हालांकि, कार्यात्मक कनेक्शन के लिए प्रमाण प्रस्तुत नहीं किया गया।
इसलिए, कार्यात्मक उत्थान की जांच की अनुमति देता है कि propriospinal फाइबर के इन विट्रो मॉडल में एक प्रतिनिधि के विकास के रीढ़ की हड्डी में पुनर्योजी प्रक्रियाओं के बारे में हमारे ज्ञान का विस्तार करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है।
प्रस्तुत की प्रक्रिया में कई तत्वों सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों की सिद्धि के लिए मौलिक हैं। Meas, समाधान की तैयारी और टुकड़ा संस्कृतियों के उत्पादन के दौरान सभी कदम एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं। वे सहज गतिविधि 14 प्रभावित कर सकते हैं, क्योंकि एंटीबायोटिक्स पोषक तत्व मध्यम करने के लिए लागू नहीं कर रहे हैं। विदेश मंत्रालय कोटिंग के दौरान सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा बाह्य मैट्रिक्स जेल समाधान के लिए हर समय ठंड रहती है कि यह सुनिश्चित करना है। फ्रिज में और पूरी प्रक्रिया के लिए बर्फ पर रख यह पिघलना 0 डिग्री सेल्सियस के करीब एक अधिकतम तापमान सुनिश्चित करने के लिए। बर्फ के ठंडे विच्छेदन बफ़र्स का उपयोग करके एक कम तापमान स्लाइस त्वरित अलगाव और सेक्शनिंग की तैयारी, साथ ही ध्यान दे के दौरान स्वस्थ संस्कृतियों का प्रतिशत बढ़ जाती है। इसके अलावा, प्लाज्मा / थ्रोम्बिन जमावट सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक है। सबसे पहले, प्लाज्मा ठीक से Mixe है कि यह सुनिश्चित कर लेंथ्रोम्बिन के साथ घ। दूसरा, MEAS को स्लाइस की उचित लगाव सुनिश्चित करने के लिए जितना संभव हो उतना अवशेषों को हटाने के लिए विशेष ध्यान देते हैं। यह कदम अत्यंत समय के प्रति संवेदनशील है; समय सीमा के बहुत छोटा है, तो प्लाज्मा / थ्रोम्बिन मिश्रण का बहुत अधिक निकाल दिया जाता है। समय सीमा के बहुत लंबा है, तो जमावट पहले से ही अवशिष्ट प्लाज्मा / थ्रोम्बिन के साथ स्लाइस को हटाने का खतरा बढ़ रही है, क्या हुआ।
यांत्रिक घावों की योजना बनाई है, तो यह एक सटीक डिजाइन के साथ Meas का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। घाव का इरादा है, जहां क्षेत्र इलेक्ट्रोड, तारों और इन्सुलेशन के मुक्त होने की जरूरत है। अन्यथा, विदेश मंत्रालय के electrics क्षतिग्रस्त हो और इसलिए, कोई रिकॉर्डिंग अब और किया जा सकता है जा रहे हैं।
एक और महत्वपूर्ण कदम घाव के आकार का सवाल है। यह घाव के बाद दो जवान स्लाइस reconnecting के बारे में दो दिनों में 10 लेता है कि पहले से दिखाया गया है। सभी प्रयोगों के लिए, अंगूठे का नियम अंतरिक्ष betwe कि इस्तेमाल किया गया थाघाव के बाद स्लाइस एन विदेश मंत्रालय नाली (300 माइक्रोन) की चौड़ाई से बड़ा नहीं होना चाहिए। घाव कोई कनेक्शन है, सब पर बहुत बड़ा है, तो एक बड़ा घाव आकार, कनेक्शन के लिए एक लंबे समय के फ्रेम में परिणाम या हो सकता है। टिप्पणी करने के लिए, पूर्व प्रयोगों से पता चला है कि एक बहुत कम कनेक्शन की दर में एक प्रारंभिक दो स्लाइस के रखने के आगे दूर से 1 मिमी का परिणाम है।
बजाय इनक्यूबेटर से 37 डिग्री सेल्सियस की रिकॉर्डिंग, आरटी के लिए कम से कम 10 मिनट की एक समायोजन समय की शुरुआत से पहले, और बाह्य समाधान करने के लिए, बजाय पोषण माध्यम की सिफारिश की है। इन प्रारंभिक मिनट के दौरान गतिविधि के पैटर्न के करीब अवलोकन मापा डेटा रिकॉर्डिंग शुरू किया गया था उचित रूप से करने के बाद संस्कृति की फोड़ पैटर्न का प्रतिनिधित्व करता है।
गतिविधि, डाटा अधिग्रहण और आगे की प्रक्रिया का पता लगाने के लिए, घर का बना हार्डवेयर, लैब में प्रोग्राम (, एम्पलीफायरों और एम्पलीफायरों के लिए कनेक्शन रिकॉर्डिंग कक्ष)देखें, सी ++ और IgorPro इस्तेमाल कर रहे हैं। वाणिज्यिक विदेश मंत्रालय setups और अन्य सॉफ्टवेयर संकुल इन कार्यों के लिए के रूप में अच्छी तरह से उपयुक्त हैं। इधर, इलेक्ट्रोड के द्वारा देखा संकेतों 1001 बार परिलक्षित, और फिर 6 किलोहर्ट्ज़ की दर से डिजीटल हैं।
विवो में, वे आरोही और फाइबर इलाकों उतरते के हस्तक्षेप के बिना अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो जाता है क्योंकि प्रस्तुत मॉडल propriospinal कनेक्शन की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। दो रीढ़ की हड्डी की स्लाइस की सह संवर्धन सुंदर ढंग से इस मुद्दे को दरकिनार कर सकते हैं। संस्कृतियों कसकर नियंत्रित और आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है कि एक microenvironment प्रदान करते हैं। दूसरी ओर, supraspinal और संवेदी इनपुट लापता पाठ्यक्रम की है। इसके अतिरिक्त, संस्कृति तैयार करने की प्रक्रिया सीएनएस नुकसान की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। Astrocytes और microglia तरह glial कोशिकाओं इसलिए बढ़ प्रसार और साथ घावों पर प्रतिक्रिया के लिए जाना जाता है, ऊतक पुनर्गठित एक निश्चित सीमा तक है। प्रस्तुत मोड से संबंधितयांत्रिक घावों के प्रदर्शन के बाद एल एक glial निशान के गठन नहीं मनाया गया। एक स्पष्टीकरण astrocytes की अनुकूली तंत्र पहले से ही तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान शुरू हो गया है कि और संस्कृतियों के घावों एक और जवाब में परिणाम नहीं था कि हो सकता है। इसके अलावा, माइलिन जुड़े अवरोधकों की भागीदारी है, उदाहरण के लिए कोई सबूत नहीं है।, No गो-ए, एक पुराने उम्र में lesioned संस्कृतियों का कम उत्थान क्षमता में। हालांकि, यह Rolipram, स्लाइस के बीच 10 से 23 DIV बढ़ जाती है कार्यात्मक उत्थान पर घावों के प्रदर्शन के बाद सीधे प्रारंभिक फॉस्फोडाइस्टरेज़ 4 अवरोध करनेवाला के साथ इलाज है कि दिखाया गया था। इन परिणामों के कार्यात्मक वसूली पुरानी संस्कृतियों में बढ़ाया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है। घाव साइट को पार एक्सोन की संख्या की गणना करते समय काफ़ी है, एक कम उम्र में lesioned संस्कृतियों और एक पुराने उम्र में lesioned संस्कृतियों के बीच कोई अंतर नहीं है की खोज की थी। इन निष्कर्षों axonal उत्थान की कमी प्रमुख कारण च नहीं है का सुझावया इसलिए संस्कृति में देर घावों के बाद वसूली की हानि और उत्थान का कार्य विश्लेषण की अनुमति देता है कि एक मॉडल की जरूरत पर जोर। Synaptic के गठन और synaptic plasticity वसूली की प्रक्रिया 10 में एक प्रमुख भूमिका निभा सकता है। ये तंत्र हाल के वर्षों के दौरान ध्यान की एक बहुत फायदा हुआ है और यह आजकल व्यापक रूप से वे रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद परिणाम पर एक बड़ा असर होता है कि स्वीकार कर लिया जाता है। इसलिए, अलगाव में और महान विस्तार में इन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए स्थिर स्थिति प्रदान करता है कि एक मॉडल निश्चित रूप से रीढ़ की हड्डी में कार्यात्मक उत्थान के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |