Summary
Burada in vitro propriyospinal bağlantıları işlevsel rejenerasyonu çalışma çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürlü omurilik dilimleri dayanan bir protokol mevcut.
Introduction
Merkezi sinir sisteminde (CNS) Organotipik dilim kültürler nöron gelişmeden nörodejenerasyona ulaşan muhtelif fizyolojik ve patolojik fenomenler incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrışmış hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, organotipik dilim sağlam bir hücre mimarisini ve yerel sinaptik devresi ile daha fazla karmaşıklık avantajı sunuyoruz. Aynı zamanda, dokuya in vivo bağlamda bütünün karışıklık bulaştırmak için gerek kalmadan bir izole edilmiş şekilde analiz edilebilir. Ayrıca, tercih edilen hücrelere kolay ve tekrar erişim garanti edilir hücre dışı ortamı hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve genellikle in vitro modelleri, in vivo göre daha az maliyetlidir. Son yıllarda, çeşitli çalışmalar mukabil yaşayan hayvanların 1,2 karşı uzun vadeli kültürlerinin gelişim profiller arasında çarpıcı benzerlikler sundu. Çeşitli merkezi sinir sistemi regio bu nöronal devreler gösterilmiştirns geliştirme sırasında spontan ağ etkinliğini ifade ve organotipik dilimleri kısmen bu fenomeni 3 -7 korumak. İzole spinal kord hazırlıkları özellikle ritim nesil 6 ve nöronal devrelerin 1 oluşumunu araştırmak için kullanılmıştır.
Organotipik dilim spontan aktivite kayıt için bir yol çoklu elektrot diziler (ÇÇA) üstünde kültürüne onları etmektir. Bu cihazlar çok sayıda eşzamanlı hücreleri (multi-unit kayıt) aksiyon potansiyelleri tarafından oluşturulan hücre dışı potansiyelleri izleyebilirsiniz birden elektrotlar içerir. MEA kayıtları yüksek zamansal çözünürlüğü verilen nöronal devrenin içinde kesin aktivite dinamiklerini yeniden kullanılabilir. Ayrıca, aksine yama-sıkma tekniği nöronlar davranışlarında etkilenmez gerçeği uzun vadeli ölçümleri ve sonuçları izin veren, non-invaziv olduğunu.
Fya da Bu çalışmanın amacı, omurilik organotipik ko-kültür ve çoklu kayıtları kombinasyonu omurilik içinde fonksiyonel rejenerasyon araştırmak için kullanıldı. Yetişkin yüksek omurgalıların omuriliğin hasar kurtarmak için potansiyeli sınırlı olduğundan, farklı stratejiler omurilik yaralanması sonrası rejenerasyon teşvik etmek çalışılmıştır. Şimdiye kadar, kortikospinal yolu genellikle bu tür soruşturmaların için seçim model sistem olmuştur. Bu deneyler genellikle zaman alıcı, pahalı ve sonucu tek gruplar içinde yüksek değişkenliğe büyük hayvan kohortlardan gerektirir. Dahası, kanıt propriyospinal bağlantıları (tamamen omurilik içinde sınırlıdır nöronlar) omurilik lezyonları 8 Aşağıdaki toparlanma sürecine çok önemli bir rol oynayabilir düşündürmektedir. Bu elyaflar artan ve elyaf yolları azalan müdahalesi olmadan, in vivo çalışma zordur. Bonnici ve Kapfhammer 9, uzunlamasına omurilik kullanılanalternatif bir yaklaşım olarak doğum sonrası farelerin dilim kültürleri. Mekanik lezyonlar yaptıktan sonra onlar yarı kantitatif omurilik segmentleri arasında akson morfolojik rejenerasyonu analiz. Onlar olgun yaşta kesilen kültürlerde lezyon sitesini kapısı az değil hiçbiri aksonlar gözlemlenmiştir. 7 gün sonra, hasar - Buna karşılık, daha genç bir aşamada lezyonlu sonunda kültürler 5 aksonal rejenerasyon yüksek miktarda gösterilir. Ancak, fonksiyonel bağlantıları için kanıt sundu değildi.
Bu nedenle, fonksiyonel rejenerasyon soruşturma sağlar propriyospinal liflerin vitro model bir temsilcisi gelişimi omurilikte rejeneratif süreçleri ile ilgili bilgimizi genişletmek için değerli bir araç olabilir.
Protocol
Hayvan bakım İsviçreli yerel yetkililer (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, onay NRS. 52/11 ve 35/14) tarafından onaylanan kurallarına uygun olarak yapıldı. Bu yönergeler Avrupa Topluluğu Direktifi 2010/63 / AB ile uyum içindedir.
Not: Steril aletler ve çözümleri ile bir laminer akış kaputu Çalışma tüm adımlar 1 - alt adımlara dahil 5.
ÇÇA hazırlanması 1.
Not: taraflı çevre, bir cam alt tabaka, mikro-işlenmiş metal elektrot ve bir SU-8, polimer yalıtım tabakasının oluşmaktadır (. Ayrıca Tscherter ark 3'e bakın). Bu çalışmanın amacı doğrultusunda, ticari olarak mevcut ÇÇA'lar özelleştirilmiş elektrot dizisi düzeni (Şekil 1 A ve B) ile emredildi. 68 elektrotlar elektrotlar ücretsiz 300 mikron genişliğinde oluk, Elek iki bölgeye bölünmüş olan bir dikdörtgen ızgara şeklinde düzenlenmiştirical yol açar ve yalıtım. Her bir elektrot büyüklüğü 40 x 40 mm olan ve merkezden merkeze 200 um ile birbirinden aralıklıdır. Dört büyük toprak elektrotları kayıt sitenin etrafında konumlandırılmış. Onlar kendi boyutunda (21 mm x 21 mm) piyasada mevcut diğer standart ÇÇA farklı ve sabit bir kayıt odasına sahiptir.
- En az 30 saniye, her% 100 etanol (2x),% 70 etanol (1 x) ve damıtılmış su (2x) dezenfeksiyon durulama ölçümü için. Kurumaya bırakın. Temiz bir cam petri (150 mm x 25 mm) 12 ölçümü ve kapağını kapatın - 10 koyun.
- 120 ° C de 20 dakika süreyle otoklavlanmaktadır ölç. Oda sıcaklığında saklayın.
- -20 ° C'de ölçümü ve mağaza alikotları kaplama solüsyonu (maddeler listesine bakınız) hazırlayın.
- Bağımsız bir steril petri kabı (35 mm x 10 mm), her MEA koyun.
- Elektrotların üstüne 150 ul soğutulmuş kaplama çözümü koymak ve petri kapağını kapatmak için bir soğutulmuş pipet kullanın. Yaklaşık 10 dakika sonra, üst hava kabarcıkları kontrolGerekirse elektrotlar ve yavaşça bir lastik kaplı spatula ile çıkarınız. Oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
- Aspire kaplama çözeltisi kalıntıları, damıtılmış, steril su ile doğum öncesi ve embriyonik nöronlar ve 2x için optimize ortamı ile 1x yıkayın. Taraflı çevre ertesi güne kadar kullanılmadığı takdirde, kuluçka O / N 37 ° C'de damıtılmış, steril su içinde tutmak. Aksi takdirde, oda sıcaklığında direkt olarak kurumaya bırakın.
Organotipik Kültürleri Hazırlanması ve Büyüme İçin Gerekli Malzemeler 2.
- Kalsiyum içermeyen yıkama solüsyonu (malzeme listesine bakınız) hazırlayın.
- Yaklaşık 20 dakika boyunca 3000 x g'de, (kabarcıkların oluşumunu önlemek, hafifçe sallayarak, 1: 1) santrifüj ve steril bir tüpe açık bir içerik süzün yıkama çözeltisi içinde, tavuk plazma sulandırın. Kısım -20 ° C'de cryotubes ve mağaza içine 200 ul.
- Buna göre sığır plazması (200 U / ml) ve steril-filtre (0,2 um gözenek filtresi) trombinin sulandırın. Cryt içine kısım 200 ul-20 ° C'de otubes saklayın.
- 30 kültürler için besleyici ortam 100 ml (malzeme listesine bakınız) hazırlanması.
3. Omurilik Doku Diseksiyon
25 için embriyo, omurilik dilimlerinin sayısına bağlı olarak, Prosedür verim - 35 ko-kültür ve steril koşullar altında, bir laminar akış başlığı içinde hazırlanır: Not.
- Kas içine enjeksiyon yoluyla ana hayvana pentobarbital (0,4 ml) içindeki bir öldürücü doz uygulanır. Pedal çekilme refleksi kontrol ederek derin anestezi onaylayın. Başları kesilerek sezaryen ve fedakarlık ile E14 sıçan embriyolar sunun.
- Steril, soğutulmuş, yıkama çözeltisi ile doldurulmuş bir petri kabına embriyoların organları aktarın.
- Arka ayaklarında üstünde bir neşter ve ön ayakları üstünde başka biriyle tam bir çapraz kesim yapın ve vücuttan bacaklarda çıkarın. Sonraki frontal düzlemde bir kesim spinal co içeren arka parça viserayı ayırmak için yapmakrd.
- Dilimlemek için, bir montaj disk üzerinde bir seferde omurilik biri içeren parçaları geri aktarın ve 225 kalınlığında kesilmiş - Bir doku kıyıcı ile 250 mikron. Doğranmış doku üzerinde yıkama çözeltisi bir damla koymak ve 35 mm steril, soğutulmuş, yıkama çözeltisi ile doldurulmuş x 10 mm petri kaplarına bir spatula ile dilimleri aktarın.
- Ayrı ayrı dilim için, doku kalan uzak omurilik teşrih. Ekli dorsal kök ganglionlar bırakın.
- Dilimleri 4 ° C'de 1 saat bekletin.
4. ÇÇA üzerinde Omurilik Doku Dilimleri Montaj
- Inkübatör, steril besin ortamı Isınma (37 ° C, hafifçe oksijenlenme için kapağı sökülebilir).
- Odak elektrod dizi stereo bir mikroskop altında bir petri oda sıcaklığında kauçuk kaplı uçları steril cımbızla Pozisyon MEA. Temiz tozsuz ve steril elektrot dizisinde tavuk plazma 6 ul damlacık ortalayın. Dikkatlice kaydırın, küçük bir spatula kullanarakventral taraf plazma damlacık içine birbirine bakacak şekilde iki omurilik bölümleri. Spatula ile elektrotlara dokunmayın.
- Tavuk plazma damlacık etrafında trombin 8 ul ekleyin. Trombin pipet kullanarak dikkatlice karıştırın ve iki dilim etrafında tavuk plazma / trombin karışımı yayıldı. Yine, doğrudan kırılgan elektrot dizisi dokunmayın. Sadece koagülasyon önce, aşırı tavuk plazma / trombin aspire.
- MEA / kültür takımı, 37 ° C'de inkübatör içinde nemlendirilmiş bir odada yaklaşık 1 saat süre ile oturur yüksek nem tutmak için petri Cap.
- Dikkatle petri kap ve yaklaşık 30 dakika süreyle tekrar inkübatör içine koymak, kültür odası besin ortamında 10 ul ekle.
- Bir silindir tüp içine steril, kauçuk kaplı uçları her MEA / kültür tertibatını yerleştirin 3 besin ortamının ml ve sıkıca kapatın kapağı ekleyin. % 5 CO 2 inkübatör rpm - 1 dönen silindir tambur roller tüpü yerleştirin
- Haftada 2 kez - in vitro 7 gün (DIV) ve daha sonra 1 sonra besin orta yarısı değiştirin.
5. Mekanik Lezyonlar
- Odak doku ile stereo mikroskop altında besin ortamı olmadan bir petri silindir tüp ve yersiz steril, kauçuk kaplı ipuçları MEA / kültür takımını atın. Görme iki dilim kaynaşmış doğrulayın.
- MEA kauçuk kaplı ipuçları cımbız yerleştirerek montaj sabit MEA / kültür tutun.
- Doku dilimleri yakın MEA oluk bir neşter bıçak yerleştirin. Yerine yatay neşter tutun.
- Neşter kadar idare ancak neşter bıçak tabanından bıçak "rulo" ipucu ve böylece oluk kapsayan doku içinden keser o şekilde MEA oluğuna kalmana izin kaldırın.
- 25 G iğne ucu necess ise şiddetli herhangi bir kalıntı doku bağlantılarıli. Oluk içindeki alanda sadece iş ve ihale kenarları dokunmayın.
- Silindir tüp içine geri MEA / kültür tertibatını koyun. Kültürlere taze besin ortamının 3 ml sağlayın ve inkübatör silindir tambur içine geri koyun.
Spontan Faaliyet 6. Elektrofizyolojik Kayıtlar
- DIV seçilen sayıdan sonra iki omurilik dilim arasındaki fonksiyonel rejenerasyon araştırmak için, bir mikroskop bir kayıt odasındaki MEA / kültür tertibatını monte ve yaklaşık 500 ul hücre dışı çözüm (malzeme listesine bakınız) uygulanır.
- Sistem stabilize etmek için izin ilk kayıttan önce 10 dakika bekleyin.
- RT'de MEA her aktivite tespit elektrottan yaklaşık 10 dakika süreyle Tutanak temel spontan aktivite 2x.
- Istikrarlı dışı koşulları sağlamak her kayıt seansından sonra hücre dışı çözüm alışverişinde.
- Ağ disinhibit için, hücre-dışı çözelti, co geçerlidirstriknin (1 uM) ve gabazine (10 uM) ntaining. Kayıt başlamadan önce en az 2 dakika bekleyin.
7. Veri analizi
Not: ekstraselüler kaydedilen aksiyon potansiyellerinin tespiti için her bir elektrodun standart sapmaları ve sonraki diskriminatör dayalı bir dedektör kullanmak. Bu prosedür, Tscherter ve ark., 3 detaylı olarak tarif edilmektedir.
- Standart prosedürlerle 3 (Şekil 1F) uygun bir tarama planı her elektrotun tespit nöronal aktivitenin gösterir.
- Belirleyin ve 1 msn adımlarla kaydırılır 10 msn kayar pencere içinde uygun kanallar olayların sayısını toplanarak her bir dilim için toplam ağ etkinliğini görüntüler (Şekil 1G ve Tscherter ve ark., 3).
- Her dilim ayrı patlamaları (birkaç elektrotlar üzerinde görünen faaliyet kümeleri) algılamak. Bu nedenleKarşılık gelen toplam ağ etkinliği minimal zirve faaliyeti eşiğini ayarlamak ve her patlama başlangıç ve patlama sonunu tanımlar. Örneğin, uygun bir eşik ortalama patlama genliği% 25 ve bir patlama başlangıç olarak bir zaman penceresinde son olay olmanın en az 5 ms, bir patlama bitiş bir zaman penceresinde ilk etkinlik olma tanımlanabilir en az 25 milisaniye (HEIDEMANN ve ark. 10).
- Fonksiyonel rejenerasyon iki dilim arasında senkronize patlamaları yüzdesini hesaplamak ölçmek için. Bunu yapmak için, bir dilim bir patlama ve diğer dilim aşağıdaki kaymasının arasındaki gecikmeyi hesaplamaktadır.
Not: gecikme ortalama patlama uzunluğundan daha küçük olduğunda bir patlama çifti olarak adlandırılan "senkronize" dir. Özellikle birçok aktivite ile ko-kültürlerde olasılığı her iki tarafın tesadüfen seçilen gecikme pencerede bir patlamasını başlatılmasını dair kanıtlar vardır. Bu durum, sy yüzde miktarının dikkate alınmalıdırnchronized patlamaları. Hesaplamalar ayrıntılı bilgi için Heidemann ve ark bakın. 10.
Kültürler ve İmmünohistokimya 8. Tespit
- Yıkama veya inkübasyon dahil tüm adımlar için doku içinden çözümün doğru yayılmasını sağlamak için bir devirme masaya kültürleri koymak emin olun.
- Kayıt oturumu kurulumu dışında MEA / kültür takımını almak bittikten sonra doğrudan, bir petri (35 mm x 10 mm) koymak ve yaklaşık 2 ml ekstrasellüler çözüm ekleyin.
- In vitro süre boyunca oluşmuş çevreleyen hücre katmanlarından dilimleri ayırmak için, 10 ul pipet alabilir ve dilimleri daire. Kültürleri zarar vermemeye dikkat edin. Bu aşamasını atlamak ancak gerçekleştirildiğinde daha sonra gömme kolaydır mümkündür.
- Ince bir ametal şırınga iğne kullanın dışı soluti ile dolu bir 1 ml şırınga ile birlikte (materyalleri listesi bakınız)yavaşça MEA kapalı kültürünü darbe için.
- Pasteur pipet ucu çıkarın ve slivered ucundaki lastik ampulü takınız. (Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 0.1 M) ile% 4 paraformaldehit) fiksatif içine kültür aktarmak için arka uç kullanın. Çok küçük ve kültürler katlanmış olacak ve muhtemelen tahrip çünkü transferi için Pasteur pipet ucu standart kullanmayın. 4 ° C'de 2 saat - 1 saptamak için. Distile su ile durulayın ve MEA parmak uçları ile doku artıkları çıkarmak ama çivi ile çizmeyin. 4 ° C'da damıtılmış su içinde mağazası ÇÇA'lar
- En az 10 dakika her biri PBS içinde 3 kez yıkanır Kültürlerin. 4 ° C de PBS içinde saklayın veya doğrudan boyama işlemi ile başlar.
- Çözeltisi (% 5 keçi serumu,% 1 sığır serum albümini, PBS içinde% 0.3 deterjan) bloke en az 90 dakika boyunca kültürler inkübe edin.
- Bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş birinci antikor ekleyin ve 4 ° C 'de 3 gece inkübe edilir.
- L at için PBS içinde yıkayın 3xdoğu 30 dakika her.
- Oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş ikinci bir antikor ekleyin.
- En az 30 dakika her biri için PBS içinde yıkama 3x.
- Bir nesne slayt kaldırılmış ucu ile Pasteur pipeti ile dilimleri aktarın. Aşırı PBS çıkarın ve orta montaj embed.
Representative Results
E14 fare embriyonlarının omurilik türetilmiş ko-kültürler fonksiyonel iyileşme potansiyeli araştırmak için, lezyon 28 DIV 8 bir zaman penceresi içinde yapıldı. 2 ila 3 hafta sonra, kendiliğinden nöron faaliyeti ÇÇA (Şekil 1 C ve D) ile kaydedildi. Ekstraselüler kaydedilen aksiyon potansiyelleri, her bir elektrot (Şekil 1E) çevrimdışı tespit edilmiştir. Ağ etkinlik araziler takip raster araziler oluşturulan bu verilerin (Şekil 1F), Dan yan (Şekil 1G) başına ayrı ayrı toplam aktiviteyi görselleştirmek için. Her dilim spontan aktivite genellikle öbekler halinde düzenlenmiştir. Dilimler işlevsel bağlıysa, bu patlamaları bir dilim diğer yaymak olabilir. Bu nedenle, iki dilim arasında senkronize kaymalarının miktarı kantitatif fonksiyonel rejenerasyon ölçmek için hesaplandı. Nasıl dönüşüm int ayrıntılı bilgi içinFarklı araziler o yapılır ve senkronize aktivitenin yüzde hesaplama formülü türetilmiştir nasıl, Heidemann ve ark., 10 bakınız edilir.
Tüm deneylerde, etkinliği ilk standart koşullar altında kaydedilmiştir. İkinci bir aşamada, sinaptik inhibisyonu, hücre dışı banyo çözeltisine striknin (1 uM) ve gabazine (10 uM) ilave edilerek bloke edilmiştir. Bu disinhibisyon patlamaları tanımını ve böylece dilimleri arasındaki patlama senkronizasyon belirlenmesini kolaylaştırır uzamış patlamaları ve patlama aralıklarla daha düzenli bir aktivite deseni, genellikle yol açar.
Genç yaşta lezyonlu Kültürler - kültürleri sonraki aşamalarda (> 19 DIV) (Şekil 2 A yenilemek yeteneği belirgin bir azalma gösterdi de lezyonlu ise (7 9 DIV) 2-3 haftalar lezyon sonra senkronize aktivitenin yüksek miktarda görüntülenen - F). Bu bulgular rejenerasyon yeteneği olduğunuspinal kord kesit kültürlerinde işlevsel bağlantıların kültür üç hafta içinde in vivo olarak daha gelişmiş olan, temsil eden düşük bir seviyeye, in vivo olarak embriyonik durumu temsil eden yüksek düzeyde azalır.
Bağlantıların ne tür aslında iki dilim arasına daldı eşitleme katılıyor? Propriyospinal bağlantıları yanı sıra, lifler de motonöronlar veya dorsal kök ganglion nöronlarının ortaya çıkabilecek. Bu omurilik 10 dilimler arasındaki dorsal kök ganglion nöronları fonksiyonel bağlantı hakkında olmadığını önceden gösterilmiştir. Bununla birlikte, motor nöronlar dahil olması olasılığı kalmıştır. Motor nöronlar nikotinik reseptörlerin 13 ile omurilik nöronlarına kolinerjik bağlantılar oluşturmak bilindiğinden, omurilik ko-kültürler aktivitesi 8 DIV, kültürler yüksek aktivitesi 10 senkronize göstermektedir bir anda ve nikotinik antagonist Mecam kaydedilmiştirilamin (MEC, 100 uM) hücre-dışı banyo çözeltisine ilave edildi. Iki dilim arasındaki bağlantının motor nöronlar bir katılımı senkronize bir aktivite azalması yüzdesi ile sonuçlanacaktır. Ancak, bu durumda değildi (MEC: 91.0 ± 4.5% n = 7; kontrolü: 93.6 ± 4.6%, n = 7, p> 0.05, Wilcoxon eşleştirilmiş çifti testi). Bu sonuçlar kolinerjik sinaps dilimler arasındaki fonksiyonel bağlantının katkıda olmadığını göstermektedir. Motor nöronlar, aynı zamanda merkezi sinir sistemi 11, 15 içindeki sinapslarda glutamat salgılamaktadır gösterilmiştir Bununla birlikte, bu deneyler, tamamen katılımlarını dışlamaz.
SMI-32 uygulandı ile motonöronlar olmayan fosforile nörofilaman H karşı immünohistokimyasal lekelenmelerinin tespit etmek. Bu dilim (Şekil 3A) üzerine dağıtılmış motonöronlar için tipik birçok etiketli büyük hücre gövdeleri, ortaya koymuştur. SMI-32 antikoru motoneuro hücre gövdelerini etiketlemek için bildirilmiştirns 12 ve bu bulgu da kullanılabilir kültürler 13 için de geçerlidir. Ayrıca, B-III-tubulin veya neun yanı sıra glial hücre gövdeleri, örneğin. Karşı genel örneğin nöronal hücre gövdeleri, bir renklendirmeler, GFAP antikoru ile astrositler diğer raporlar doğrultusunda ve (bu hücre tiplerinin morfolojik açıklamalarını maç Şekil 3 B - D). Bununla birlikte, SMI-32 antikoru ile akson etiketlenmesi (Şekil 3E) ile ilgili olup. Beklentilerin aksine, bu antikor kullanarak liflerin büyük bir ağ görünür ve fosforile nörofilaman H (Şekil 3F) etiketleri SMI-31 boyanma benzer. Bu sonucun bir yorumu nörofilaman fosforilasyonu / defosforilasyonundan gelişimsel düzenleme, in vivo duruma göre kullanılan kültürlerde olduğu gibi sıkı olmadığını olabilir. Aynı akson fosforile ve fosforilatlanmamış nörofilament karışık olay Expl olabilirBu bulguyu değilim. Başka bir olasılık SMI-32 etiketli aksonlar projeksiyon nöronlarının kaynaklanan olmasıdır. Tsang ve arkadaşları 16 o örneğin göstermiştir, Clark'ın sütun ve sütun intermediolateral hücre nöronlar motor nöronlar yanında SMI-32 tarafından boyandı. Bu tür nöronların belirgin nörit çoğalması da SMI-32 pozitif liflerin bolluğu açıklayabilir.
Şekil 1. Ekran ve spontan Faaliyet Analizi. (A) MEA diyagramı. Platin örtülü elektrotlar, siyah, kırmızı, şeffaf teller ve sarı MEA ortasında oluk tasvir edilmiştir. (B) MEA merkezinde bulunan elektrot dizisinin Close-up. Diyagramları nazik M. Heuschkel tarafından sağlanmaktadır. (C) 8 SAYI eski Kültür Parlak alan görüntüe. Dilimler büyüdü ve birbirine bakan kenarları boyunca kaynaşmış. Sarı bar MEA electrode- ve yalıtım gerektirmeyen oluk temsil eder. Deneylerin Ölçek çubuğu = 400 mikron (D) Timeline. E14 sıçan embriyoların iki spinal kord dilimleri ÇÇA üzerinde yanyana yerleştirilir. Birkaç gün içinde, dilim büyür ve sigorta birbirine bakan kenarları boyunca. 8 bir zaman dilimi içinde - 28 DIV, tam lezyonlar füzyon sitesi üzerinden yapılmaktadır. İki üç hafta sonra spontan aktivite kaydedilir ve kültürler immünohistokimyasal boyamalar için sabittir. (E), bir 23 DIV eski kültürün her bir elektrot spontan aktivite izleri. Net görselleştirme için, sadece her iki eser gösterilmiştir. Turuncu izleri sol taraftan sağ tarafta dilim kaydedilmiştir aktivite, mavi izleri betimliyor. Patlamaların çoğu ikisi arasındaki senkronize edilir. Sol dilim sadece p meydana gelen bir patlama ok noktalarıartially doğru dilimine yayılır. Sağ dilim etkinliği Ancak göre yan ortalama maksimal zirve aktivitesinin en az% 25 seçilmiş eşiğine ulaşamadı ve bu nedenle, bir patlama olarak algılanmaz. Sağdaki büyütme son senkronize patlama çifti tasvir. (E) 'de gösterilen faaliyet (F) Raster çizimi. (E) 'de gösterilen faaliyet tanımlanan patlamaları (taban çizgisinin altına çubuklar) ile (G) Ağ etkinliği arsa. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Değil Senkronize Faaliyet karşı Senkronize. (A, B) kültürlerin Raster araziler lesioneGenç yaşta d (7 at - 9 DIV), standart koşullarda (A) ve disinhibisyon altında (B) kapsamında senkronize aktivitesini gösteren. (C, D) standart koşullar (C) ve disinhibisyon altında (D) altında olmayan senkronize aktivitesini gösteren (> 19 DIV at) bir yaşta lezyonlu kültürlerin Raster araziler. Senkronize aktivitesi (E, F) ortalama yüzdesi, standart koşullar (E) ve disinhibisyon altında (F) altında kaydedilmiştir her lezyon gün için işlenmiştir. 3 hafta lezyonun gün sonra - Kayıtlar 2 alınmıştır. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FŞEKIL 3. immünohistokimyasal Karakterizasyonu. SMI-32 ile motor nöral hücre gövdeleri (A) Boyama. (B) olgun nöronal hücre gövdeleri ve süreçlerin β-III tubulin etiketleme. GFAP ile astrositlerde (C) Kimlik. Neun olgun nöronal hücre gövdesinin (D) Etiketleme. SMI-31 tarafından tanımlanan fosforilatlanmamış sinir lifi H. (F) Fosforlaştırılmış nörofilaman H (E) SMI-32 boyanması. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. Her ikisi de dikkat edin, SMI-31 ve SMI-32, liflerin büyük bir ağ kültürlerinde görülebilir. Barlar AD = 20 um, H & F = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Sunulan prosedürde çeşitli unsurlar doğru ve tekrarlanabilir deneyler başarı için esastır. ÇÇA'lar, çözeltilerin hazırlanması ve dilim kültürlerinin üretimi sırasında tüm adımlar bir laminer akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Onlar kendiliğinden aktiviteyi 14 etkileyebilir çünkü antibiyotikler besin ortamına uygulanmaz. MEA kaplama sırasında, en önemli kısmı ekstrasellüler matriks jel çözüm her zaman soğuk kalır emin olmaktır. Buzdolabında ve tüm işlem için buz üzerinde tutmak o çözülme 0 ° C'ye yakın bir maksimal sıcaklığını sağlamak için. Buz soğuk diseksiyon tamponlar kullanarak düşük sıcaklığa dilim hızlı izolasyon ve kesit hazırlanması yanı sıra ödeme dikkat sırasında sağlıklı kültürlerin yüzdesini arttırır. Ayrıca, plazma / trombin koagülasyon en kritik adımlardan biridir. İlk olarak, plazma düzgün Mixe emin oluntrombin d. İkinci olarak, ÇÇA için dilimler düzgün eki sağlamak için mümkün olduğunca fazla kalıntı kaldırılması için özel dikkat. Bu adım son derece zaman duyarlıdır; zaman çerçevesi çok kısa ise, plazma / trombin karışımı çok fazla kaldırılır. Zaman çerçevesi çok uzunsa, pıhtılaşma zaten artık plazma / trombin ile birlikte dilimleri kaldırarak riskini artıran oldu.
Mekanik lezyonlar planlanan, bu doğru bir tasarıma sahip ÇÇA kullanmak önemlidir. Lezyon amaçlanan alan elektrotlar, teller ve yalıtımın serbest olması gerekir. Aksi takdirde, MEA elektrik hasarlı ve bu nedenle, hiçbir kayıtlar artık yapılabilir gidiyoruz.
Başka önemli bir adım lezyonun boyutunu ilgilidir. Bu lezyon sonrası iki genç dilim bağlamadan iki gün 10 alır, daha önce gösterilmiştir. Tüm deneyler için, kural uzay betwe olduğu kullanıldılezyon sonrası dilimleri en MEA oluk (300 um) genişliğinden daha büyük olması gerekir. Lezyon hiçbir yeniden bağlanma hiç, çok büyük ise A büyük lezyon boyutu, yeniden bağlanma için daha uzun bir zaman dilimi içinde sonuçlanabilir veya olabilir. Açıklama, eski deneyler ortaya koyduğu çok düşük bağlantı hızı bir başlangıç iki dilim yerleştirilmesi daha uzağa 1 mm'den sonuçları.
Bunun yerine kuluçka 37 ° C kayıtları, oda sıcaklığına kadar, en az 10 dakikalık bir ayar süresi, başlamasından önce, ve hücre dışı çözeltiye yerine yetiştirme ortamı önerilmektedir. Bu ilk dakika boyunca faaliyet desen yakın gözlem ölçülen veri kayıt başlandı uygun sonra kültür patlaması modelini temsil sağlar.
Aktivite, veri toplama ve ileri işleme tespiti için, ev yapımı donanım, Lab programları (, amplifikatörler ve amplifikatörler bağlantıları odasına kayıt)GÖRÜNTÜSÜ, C ++, IgorPro kullanılır. Ticari MEA kurulumları ve diğer yazılım paketleri bu işlemler için de uygundur. Burada, elektrotlar tarafından görülen sinyaller 1001 defa büyütülmüş ve daha sonra 6 kHz hızında dijitalize edilmiştir.
In vivo, onlar artan ve lif yolları azalan müdahalesi olmadan çalışmak zordur, çünkü sunulan model propriyospinal bağlantıları incelemek için yararlı bir araç olabilir. İki omurilik dilim eş kültür zarif bu sorunu aşmak olabilir. Kültürler sıkı kontrol ve kolayca manipüle edilebilir bir mikro sağlamak. Öte yandan, Supraspinal ve duyusal giriş eksik tabii ki. Buna ek olarak, kültür hazırlama süreci CNS hasar durumu temsil etmektedir. Astrositler ve mikroglia gibi glial hücreler, bu nedenle artan proliferasyon ve lezyonlarda yanıt bilinmektedir, doku yeniden bir ölçüde olduğunu. Sunulan moda İlişkinmekanik lezyonlar gerçekleştirdikten sonra l glial skar oluşumu gözlenmemiştir. Bir açıklama astrositlerden adaptif mekanizmalar zaten hazırlık sürecinde tetiklenen olduğunu ve kültürlerin lezyonları daha da tepkiye neden olmadığını olabilir. Ayrıca, myelin ilişkili inhibitörlerinin katılımı için, örneğin herhangi bir kanıt yoktur., Nogo-A, eski bir yaşta lezyonlu kültürlerin düşük rejenerasyon potansiyeli. Bununla birlikte, Rolipram, dilim 10 arasında 23 DIV artar fonksiyonel rejenerasyon lezyon gerçekleştirdikten sonra, başlangıçtan fosfodiesteraz 4 inhibitörü ile muamelenin gördü. Bu sonuçlar, fonksiyonel iyileşme eski kültürlerde artabilir göstermektedir. Lezyon sitesini kapısı akson sayısını sayarken Gözle, genç yaşta Lezyonlu kültürler ve eski bir yaşta lezyonlu kültürler arasında hiçbir fark tespit edilmiştir. Bu bulgular aksonal rejenerasyon bu eksikliği en önemli nedeni f değil önermekveya bu nedenle kültür geç lezyonlardan sonra iyileşme kaybı ve yenilenme fonksiyonel analiz sağlayan bir model için gerekliliğini vurgulamaktadır. Sinaptik oluşumu ve sinaptik plastisite kurtarma işlemi 10 önemli bir rol oynayabilir. Bu mekanizmalar son yıllarda çok ilgi kazandı ve günümüzde yaygın olarak onlar omurilik hasarı sonrası sonucun üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, izolasyon ve çok detaylı bu süreçleri araştırmak için kararlı şartları sağlayan bir model kesinlikle omurilik fonksiyonel dönüşüm konusunda fikir edinmek için yardımcı olabilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
- Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
- Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures. Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).
- Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits. Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).
- Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture. J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).
- Hanson, M. G., Landmesser, L. T. Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules). Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).
- Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model. Neuroscience. 262, 40-52 (2014).
- Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).
- Tsuji, S., et al. Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures. J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).
- Magloire, V., Streit, J. Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).
- Mentis, G., et al. Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS. Brain Res. 861 (45–58), (2000).
