Summary
Hier presenteren we een protocol dat is gebaseerd op gekweekt ruggemerg segmenten op multi-elektrode arrays functionele regeneratie van propriospinal verbindingen in vitro bestuderen.
Introduction
Organotypische slice cultures van het centrale zenuwstelsel (CNS) zijn uitgebreid gebruikt voor diverse fysiologische en pathologische fenomenen bereiken van neuronale ontwikkeling tot neurodegeneratie. Vergeleken met gedissocieerde celkweken, organotypische plakken het voordeel meer complexiteit met een intacte cytoarchitecture en lokale synaptische circuits. Tegelijkertijd kan het weefsel op een geïsoleerde wijze geanalyseerd zonder dat de complexiteit van de hele impliceren in vivo context. Verder is gemakkelijk en herhaalde toegang tot de cellen van keuze waarborgt de extracellulaire omgeving kan nauwkeurig worden geregeld en meestal in vitro modellen zijn minder kostbaar dan hun tegenhangers in vivo. De laatste jaren diverse studies die opvallende gelijkenissen tussen de ontwikkelingsprofielen van kweken op lange termijn versus de overeenkomstige levende dieren 1,2. Het is aangetoond dat neuronale circuits van verschillende CNS regions uiten spontaan netwerk activiteit tijdens de ontwikkeling en dat organotypische plakjes dit fenomeen 3 -7 gedeeltelijk te handhaven. Geïsoleerde ruggenmerg preparaten zijn bijzonder genoemd ritme opwekking 6 en de vorming van neuronale circuits 1 te onderzoeken.
Een manier om de spontane activiteit van organotypische plakjes opnemen is cultuur deze naar multielektroden (MEA). Deze apparaten bevatten meerdere elektroden die de extracellulaire potentialen gegenereerd door actiepotentialen van talrijke cellen tegelijk (multi-unit opname) kan controleren. De hoge tijdsresolutie van de MEA opnamen kan worden gebruikt om de precieze activiteit dynamiek binnen een bepaalde neuronale circuit reconstrueren. Bovendien, in tegenstelling tot patch-klemmen van de techniek is niet-invasief, waarbij langetermijnmetingen en resultaten maakt het feit dat de neuronen niet worden aangetast in hun gedrag.
Fof het doel van deze studie was de combinatie van organotypische ruggenmerg co-kweken en multisite opnames werd gebruikt om functionele regeneratie in het ruggenmerg te onderzoeken. Sinds volwassen hogere gewervelden hebben beperkte mogelijkheden om te herstellen van schade aan het ruggenmerg, zijn verschillende strategieën bestudeerd om de regeneratie na een dwarslaesie te promoten. Tot nu toe heeft de corticospinale darmkanaal meestal al het modelsysteem van de keuze voor dergelijke onderzoeken. Deze experimenten zijn meestal tijdrovend, kostbaar en vereisen grote dierlijke cohorten door hoge variabiliteit tussen enkele groepen. Bovendien zijn er aanwijzingen dat propriospinal aansluitingen (neuronen die volledig worden opgesloten in het ruggenmerg) een centrale rol in het herstelproces volgende ruggenmergletsels 8 kan spelen. Deze vezels zijn moeilijk te bestuderen in vivo zonder tussenkomst van stijgende en dalende fiber traktaten. Bonnici en Kapfhammer 9 gebruikte longitudinale ruggenmergslice culturen van postnatale muizen als alternatieve benadering. Na het uitvoeren van mechanische laesies geanalyseerd ze semi-kwantitatief de morfologische regeneratie van axonen tussen ruggenmerg segmenten. Zij merkten minder, maar niet niemand axonen oversteken van de laesie site in culturen gesneden op een volwassen leeftijd. Daarentegen kweken die werden laesie op jongere stadium vertoonden een hoog gehalte van axonale regeneratie 5 - 7 dagen na de beschadiging. Echter, het bewijs voor functionele verbindingen werd niet gepresenteerd.
Daarom kan de ontwikkeling van een representatief in vitro model van propriospinal vezels die het onderzoek naar functionele regeneratie kan een waardevol instrument om onze kennis op gebied van regeneratieve processen in het ruggenmerg.
Protocol
Dierlijke zorg was in overeenstemming met de richtlijnen die door de Zwitserse lokale overheden (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, goedkeuring Nrs. 52/11 en 35/14) is goedgekeurd. Deze richtlijnen zijn in overeenstemming met de Europese Gemeenschap Richtlijn 2010/63 / EU.
Opmerking: Werk in een laminaire stroming kap met steriele instrumenten en oplossingen voor alle stappen 1-5 inclusief sub-stappen.
1. Bereiding van MEA
Opmerking: MEA bestaan uit een glassubstraat, micro-metaal elektroden en een SU-8 polymere isolatielaag (zie ook Tscherter et al. 3). Ten behoeve van deze studie werden commercieel verkrijgbaar MEA besteld met een aangepaste elektrode-reeks layout (Figuur 1 A en B). De elektroden 68 zijn opgesteld in een rechthoekig raster dat is verdeeld in twee zones door een 300 urn brede gleuf zonder elektroden, elektrical leads en isolatie. Elke elektrode is 40 x 40 urn groot en ze uit elkaar gescheiden door 200 urn van centrum tot centrum. Vier grote gemalen elektroden worden gepositioneerd rond de opname plaats. Ze verschillen van de andere in de handel verkrijgbare standaard MMO's in hun grootte (21 mm x 21 mm) en ze hebben geen vaste opname kamer.
- Voor desinfecteren spoelen MEA in 100% ethanol (2x), 70% ethanol (1x) en gedestilleerd water (2x) ten minste 30 sec per. Laten drogen. Zet 10-12 MEA in een schone glazen petrischaal (150 mm x 25 mm) en sluit het deksel.
- MMO autoclaaf gedurende 20 minuten bij 120 ° C. Slaan bij RT.
- Bereid de bekledingsoplossing (zie lijst materiaal) voor MEA en bewaar monsters bij -20 ° C.
- Zet elke MEA in een individuele steriele petrischaal (35 mm x 10 mm).
- Gebruik een afgekoelde pipet 150 ul gekoelde bekledingsoplossing bovenop de elektrodes te zetten en sluit het deksel van de petrischaal. Na ongeveer 10 minuten, controleer luchtbellen bovenopde elektroden en verwijder voorzichtig ze met een rubberen spatel indien nodig. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur rusten.
- Zuig coating oplossing residuen, wassen 1x met medium geoptimaliseerd voor prenatale en embryonale neuronen en 2x met gedestilleerd, steriel water. Als MEA niet worden gebruikt tot de volgende dag, houden in gedestilleerd, steriel water bij 37 ° C in de incubator O / N. Anders, laat direct drogen bij kamertemperatuur.
2. ingrediënten die nodig zijn voor de voorbereiding en de groei van organotypische Culturen
- Bereid calciumvrije wasoplossing (zie lijst materialen).
- Reconstitueren kip plasma in wasoplossing (1: 1, schud voorzichtig vorming van luchtbellen te vermijden), centrifugeer bij 3000 xg gedurende 20 minuten en decanteer het heldere inhoud in een steriele buis. Aliquot 200 ul in cryotubes en bewaar bij -20 ° C.
- Reconstrueren trombine van runderen plasma dienovereenkomstig (200 U / ml) en steriele filter (0,2 pm porie filter). Aliquot 200 ul in crytotubes en bewaar bij -20 ° C.
- 30 culturen te bereiden 100 ml voedingsbodem (zie lijst materialen).
3. ruggenmergweefsel Dissection
Opmerking: Procedure opbrengsten, afhankelijk van het aantal embryo, ruggemerg segmenten ongeveer 25 - 35 co-kweken en wordt bereid in een laminaire stroming kap onder steriele omstandigheden.
- Breng een dodelijke dosis pentobarbital (0,4 ml) aan het moederdier intramusculaire injectie. Bevestig diepe anesthesie door het controleren van het pedaal terugtrekking reflex. Leveren E14 rat embryo's door keizersnede en opoffering door onthoofding.
- Breng de organen van het embryo in een petrischaal gevuld met steriele, gekoeld wasoplossing.
- Voer een volledige transversale snijden met een scalpel boven de achterpoten en één boven de voorpoten en verwijder de ledematen van het lichaam. Volgende, maak een snede in het frontale vlak om ingewanden te scheiden van het achterpand met de spinale cord.
- Voor snijden, breng de achterpanden met het ruggenmerg een voor een op een montageschijf en gesneden op een dikte van 225 - 250 urn met een tissue chopper. Doe een druppel wasoplossing op de gehakte tissue en breng plakjes met een spatel in 35 mm x 10 mm petrischalen gevuld met steriele, gekoeld, wasoplossing.
- Voor elk segment afzonderlijk, ontleden ruggenmerg uit de buurt van de resterende weefsel. Verlaat achterwortelganglia bevestigd.
- Laat de plakken rusten 1 uur bij 4 ° C.
4. Montage ruggenmergweefsel Slices op MEA
- Warmen steriel voedingsbodem in de incubator (37 ° C, licht losgeschroefd deksel voor zuurstof).
- Positie MEA met steriel pincet met rubber beklede tips bij RT in de petrischaal onder een stereo-microscoop met de elektrode-array in focus. Centreren een 6 ul druppel kip plasma op de schone, stofvrije en steriele elektrode-array. Met behulp van een kleine spatel, schuiftwee ruggenmerg secties met ventrale zijde naar elkaar toe in het plasma druppel. Raak de elektroden niet aan met de spatel.
- Voeg 8 ul trombine rond de kip plasma druppel. Met behulp van de trombine pipetpunt, zorgvuldig mengen en verspreiden de kip plasma / trombine mengsel rond de twee plakjes. Nogmaals, niet het broze elektrodebundel direct raken. Net vóór de stremming, zuig overtollige kip plasma / trombine.
- Cap de petrischaal met een hoge vochtigheidsgraad te behouden terwijl de MEA / kweek samenstel zit gedurende 1 uur in een bevochtigde kamer in de incubator bij 37 ° C.
- Voeg voorzichtig 10 pl medium om de kweekkamer, cap de petrischaal en teruggeplaatst in de incubator gedurende 30 minuten.
- Plaats elke MEA / cultuur montage met steriel, rubber beklede tips in een roller buis, voeg 3 ml van de voedingsbodem en strak sluit het deksel. Plaats de rolas in de wals trommel roteert met 1 - 2 min in de incubator in een 5% CO
- Verander de helft van het voedingsmedium na 7 dagen in vitro (DIV) en daarna 1 - 2 keer per week.
5. Mechanische laesies
- Neem de MEA / cultuur montage met steriel, rubber beklede tips uit de roller buis en in een petrischaal zonder voedingsbodem onder een stereo-microscoop met het weefsel in focus. Visueel te controleren of de twee schijfjes zijn gesmolten.
- Houd de MEA / cultuur montage stabiel door het plaatsen van een pincet met rubber beklede tips over de MEA.
- Plaats een scalpel in de groef van de MEA nabij de weefselplakjes. Houd de scalpel in plaats van horizontaal.
- Til de scalpel hendel omhoog, maar laat de scalpel te verblijven in de groef van de MEA op een zodanige wijze dat het blad "rollen" van de basis tot de punt en daarmee snijdt door het weefsel voor de groove.
- Ernstige eventueel resterende verbindingen weefsel met een 25 G naald als necessAry. Werkt alleen in het gebied binnen de groef en doen de aanbesteding randen niet aan.
- Zet de MEA / cultuur assemblage terug in de rol buis. Geef 3 ml vers voedingsmedium aan de kweken en weer terugplaatsen in de trommel roller in de incubator.
6. elektrofysiologische Opnamen van spontane activiteit
- Functionele regeneratie tussen de twee ruggenmerg plakken na de gekozen aantal DIV onderzoeken, monteer de MEA / cultuur montage in een opname kamer op een microscoop en toe te passen ongeveer 500 ul extracellulaire oplossing (zie lijst materialen).
- Wacht 10 minuten vóór de eerste opname om het systeem te stabiliseren.
- Neem basis- spontane activiteit 2x gedurende ongeveer 10 minuten van elkaar activiteit detectieelektrode van het MEA bij KT.
- Om ervoor te zorgen stabiele extracellulaire omstandigheden wisselen extracellulaire oplossing na elke opname sessie.
- Om het netwerk disinhibit, gelden extracellulaire oplossing containing strychnine (1 uM) en gabazine (10 uM). Wacht minstens 2 minuten voordat de opname.
7. Data Analysis
Opmerking: Voor de detectie van extracellulair opgenomen actiepotentialen gebruiken voor elke elektrode een detector op basis van standaardafwijkingen en een daaropvolgende discriminator. Deze procedure wordt in detail beschreven in Tscherter et al. 3.
- Laat de gedetecteerde neuronale activiteit van elke elektrode in een raster plot volgens standaardprocedures 3 (Figuur 1F).
- Bepaal en toont de totale netwerk activiteit voor elk segment door het optellen van het aantal gebeurtenissen in de volgens kanalen binnen een schuifraam van 10 msec, verschoven met 1 msec stappen (figuur 1G en zie Tscherter et al. 3).
- Detecteren in elk plakje individuele uitbarstingen (clusters van activiteiten die op verschillende elektroden verschijnen). DaaromStel een minimale piekactiviteit drempel in de overeenkomstige totale netwerkactiviteit en definieert elke burst start en barstte het einde. Bijvoorbeeld, een geschikte drempel 25% van de gemiddelde burst amplitude en een burst start kan worden bepaald door als eerste gebeurtenis in een tijdvenster van ten minste 5 msec, een burst uiteinde door als laatste gebeurtenis in een tijdvenster van ten minimaal 25 msec (zie Heidemann et al. 10).
- Te kwantificeren functionele regeneratie bereken het percentage van gesynchroniseerde uitbarstingen tussen de twee plakjes. Om dit te doen, het berekenen van de vertraging tussen een uitbarsting in één stuk en de volgende uitbarsting in de andere slice.
Opmerking: Een burst pair wordt "synchroon" als de latentie kleiner is dan de gemiddelde salvolengte. Vooral bij co-kweken met veel activiteit, bestaat de mogelijkheid dat beide zijden toevallig initiëren een burst van de gekozen latentie venster. Dit feit heeft de kwantificering van het percentage sy rekening wordt gehoudennchronized bursts. Voor een uitgebreide beschrijving van de berekening zien Heidemann et al. 10.
8. Bevestiging van de culturen en Immunohistochemie
- Voor alle stappen die wassen of incubatie onder meer zorg ervoor dat de culturen op een kantelbare tafel om een goede verspreiding van de oplossing door het weefsel te garanderen.
- Direct na de opnamesessie voltooid is neemt u de MEA / cultuur montage uit de setup, zet het in een petrischaal (35 mm x 10 mm) en voeg ongeveer 2 ml van extracellulaire oplossing.
- Om de plakken te scheiden van de omringende cellagen dat gedurende de tijd in vitro zijn gevormd, wordt 10 ul pipetpunt en omcirkelen de plakjes. Let niet aan de culturen beschadigen. Het is mogelijk deze stap overslaan maar inbedding later gemakkelijker wanneer deze wordt uitgevoerd.
- Gebruik een niet-metalen dunne naald (zie materialen lijst) in combinatie met een 1 ml injectiespuit gevuld met extracellulaire solutiop om voorzichtig te blazen van de cultuur van de MEA.
- Verwijder de punt van een Pasteur pipet en past de rubberen bol op het geschaafde einde. Met de achterkant naar de kweek zetten in fixatief (4% paraformaldehyde met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 0,1 M)). Mis standaard tip van de pasteurpipet niet voor overdracht omdat het te klein en de kweken worden gevouwen en waarschijnlijk beschadigd. Oplossing voor 1 - 2 uur bij 4 ° C. Spoel de MEA met gedestilleerd water en verwijder weefsel resten met de vingertoppen, maar geen krassen met de nagel. Store MEA in gedestilleerd water bij 4 ° C
- Was de kweken 3x in PBS gedurende ten minste 10 minuten elk. Bewaar in PBS bij 4 ° C of direct beginnen met de kleuringsprocedure.
- Incubeer de kweken gedurende ten minste 90 min in blokkeeroplossing (5% geitenserum, 1% runderserumalbumine, 0,3% detergent in PBS).
- Voeg het eerste antilichaam verdund in blokkerende oplossing en incubeer gedurende 3 nachten bij 4 ° C.
- Was 3x in PBS gedurende least 30 min elk.
- Voeg het tweede antilichaam verdund in PBS gedurende 2 uur bij KT.
- Was 3x in PBS gedurende ten minste 30 minuten elk.
- Breng de plakjes met een Pasteur pipet met verwijderde tip op een object dia. Verwijder overtollige PBS en insluiten met montage medium.
Representative Results
Om de kans op functioneel herstel van het co-kweken afgeleid van het ruggenmerg van de rat E14 embryo's te onderzoeken, werden lesies in een tijdsinterval van 8 tot 28 DIV. 2-3 weken later werd de spontane neuronale activiteit die met de MEA (Figuur 1 C & D). De extracellulair opgenomen actiepotentialen werden offline die voor elke afzonderlijke elektrode (figuur 1E). Uit deze gegevens raster plots werden gegenereerd (Figuur 1F), gevolgd door netwerkactiviteit percelen de totale activiteit afzonderlijk zichtbaar per zijde (figuur 1G). In elke plak de spontane activiteit die vaak in bursts. Indien de schijfjes functioneel zijn verbonden, kunnen deze uitbarstingen propageren van het ene segment naar het andere. Daarom is de hoeveelheid gesynchroniseerde bursts tussen de twee plakken berekend kwantitatief meten functionele regeneratie. Voor een gedetailleerde beschrijving van de transformatie into de verschillende percelen wordt uitgevoerd en hoe de formule voor de berekening van het percentage van gesynchroniseerde activiteit werd afgeleid, zie Heidemann et al. 10.
In alle experimenten werd de activiteit eerst opgenomen onder standaardomstandigheden. In een tweede stap werd synaptische remming geblokkeerd door toevoegen strychnine (1 uM) en gabazine (10 uM) aan het extracellulaire badoplossing. Deze disinhibition leidt meestal tot een regelmatiger activiteitenpatroon bij langdurige barst en barsten intervallen, waarbij de definitie van barst en derhalve de bepaling van burst synchronisatie tussen de segmenten vergemakkelijkt.
Cultures laesie op jonge leeftijd (7-9 DIV) vertoonde een grote hoeveelheid gesynchroniseerde werking 2-3 weken na het letsel dat culturen laesie in latere stadia (> 19 DIV) vertoonden een duidelijke vermindering van het vermogen om te regenereren (Figuur 2 A - F). Deze bevindingen geven aan dat het regeneratievermogenfunctionele verbindingen in het ruggenmerg slice culturen afneemt van een hoog niveau, die de embryonale toestand in vivo, naar een laag niveau, die de verdere ontwikkelde staat in vivo, binnen drie weken in de cultuur.
Welke soorten aansluitingen zijn eigenlijk betrokken bij barsten synchronisatie tussen de twee plakken? Daarnaast propriospinal verbindingen kunnen de vezels ook voortvloeien uit motoneuronen of dorsale wortel ganglion neuronen. Eerder is aangetoond dat de dorsale wortel ganglion neuronen zijn niet relevant voor de functionele verbinding tussen het ruggenmerg 10 snijdt. Echter, de betrokkenheid van motoneuronen bleef een mogelijkheid. Aangezien motoneuronen is bekend cholinergische verbindingen ruggenmerg neuronen met nicotinereceptoren 13 vormen, werd de activiteit van ruggenmerg co-cultuur opgenomen in 8 DIV, nu de culturen zeer vertonen synchroon activiteit 10 en de nicotine-antagonist Mecamylamine (MEC, 100 uM) werd toegevoegd aan het extracellulaire badoplossing. Een deelname van motorneuronen in de verbinding tussen de twee segmenten zou leiden tot een verminderde percentage van gesynchroniseerde activiteit. Maar dit was niet het geval (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; controle: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p> 0,05, Wilcoxon gepaarde test). Deze resultaten suggereren dat cholinerge synapsen niet bijdragen aan de functionele verbinding tussen segmenten. Aangezien motoneuronen zijn ook aangetoond vrij glutamaat bij synapsen in het CZS 11, 15, deze experimenten niet geheel uitgesloten hun betrokkenheid.
Om motoneuronen identificeren immunohistochemische kleuringen tegen het niet-gefosforyleerde neurofilament H met SMI-32 werden uitgevoerd. Het bleek dat verscheidene gemerkte grote cellichamen typisch motoneuronen, verdeeld over de segmenten (Figuur 3A). De SMI-32 antilichaam is gerapporteerd dat de cellichamen van motoneuro labelns 12 en deze bevinding geldt ook voor de gebruikte culturen 13. Ook kleuringen van neuronale cellichamen in het algemeen, bijvoorbeeld, tegen B-III-tubuline of Neun evenals gliacel lichamen, bijv., Astrocyten met GFAP antilichaam zijn in lijn met andere rapporten en overeenkomen met de morfologische beschrijvingen van deze celtypen ( Figuur 3 B - D). Toch is de etikettering van axonen met de SMI-32 antilichaam wordt met betrekking tot (figuur 3E). Tegen de verwachtingen, een enorm netwerk van vezels, verschijnt bij het gebruik van dit antilichaam en het lijkt op de SMI-31 kleuring die gefosforyleerd neurofilament H (figuur 3F) etiketten. Een interpretatie van dit resultaat kan zijn dat de ontwikkelingsregulatie neurofilament fosforylatie / defosforylatie niet zo strak in de gebruikte kweken vergeleken met de in vivo situatie. Een gemengde aanwezigheid van gefosforyleerd en niet-gefosforyleerd neurofilamenten dezelfde axon kan Explain deze bevinding. Een andere mogelijkheid is dat de SMI-32 gelabelde axonen ontstaan door projectie neuronen. Tsang en collega's 16 hebben aangetoond dat bijvoorbeeld zijn Clark kolom en intermediolateralis cel kolom neuronen gekleurd door SMI-32 naast motoneuronen. Uitgesproken neuriet proliferatie van dergelijke neuronen zou ook de overvloed aan SMI-32 positieve vezels uit te leggen.
Figuur 1. Weergave en analyse van spontane activiteit. (A) Schematische weergave van een MEA. De platina-beklede elektroden zijn afgebeeld in zwart, de transparante draden rood en de groef in het midden van de MEA in geel. (B) Close-up van de elektrode-reeks in het centrum van de MEA. De diagrammen worden vriendelijk verschaft door Dr. M. Heuschkel. Bright-veld beeld van een 8 DIV oude cul (C)e. De plakjes zijn gegroeid en gesmolten langs de zijkanten tegenover elkaar. De gele balk vertegenwoordigt de electrode- en isolatie vrij groef van de MEA. Schaal bar = 400 pm (D) Chronologie van experimenten. Twee ruggenmerg plakken van E14 rat embryo's worden geplaatst naast elkaar op MMO's. Binnen enkele dagen, de plakjes groeien en zekering langs de zijkanten tegenover elkaar. In een tijdsbestek van 8 - 28 DIV worden complete lesies door de fusieplaats. Twee tot drie weken later de spontane activiteit geregistreerd en de kweken worden vastgesteld voor immunohistochemische kleuringen. (E) spontane activiteit sporen van elke afzonderlijke elektrode van een 23 DIV oude cultuur. Voor duidelijkere visualisatie, wordt slechts elke tweede spoor afgebeeld. Oranje sporen verbeelden activiteit die is opgenomen van het segment aan de rechter kant, blauwe sporen uit de linkerkant. De meeste bursts gesynchroniseerd tussen de twee. De pijl wijst naar een burst optreedt in het linker segment dat slechts partially doorgegeven aan de juiste slice. De activiteit in de juiste segment echter niet de gekozen drempel van ten minste 25% van de gemiddelde maximale piek-activiteit van de volgens kant te bereiken en daarom niet wordt gedetecteerd als een burst. Vergrotingen aan de rechterkant tonen de laatste gesynchroniseerde burst paar. (F) Raster plot van de in (E) activiteit. (G) Netwerk activiteit perceel met gedefinieerde uitbarstingen (balken onder baseline) van de in (E) activiteit. Aangepast van Heidemann et al. 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Synchroon versus niet gesynchroniseerd activiteit. (A, B) Raster percelen van culturen Lesioned op jonge leeftijd (bij 7-9 DIV), met gesynchroniseerde activiteit onder standaard condities (A) en onder disinhibition (B). (C, D) Raster percelen kweken gelaedeerde op hoge leeftijd (at> 19 DIV), waaruit niet gesynchroniseerd activiteit onder standaard condities (C) en onder disinhibition (D). (E, F) Gemiddeld percentage van gesynchroniseerde activiteit uitgezet voor elke laesie dag geregistreerd onder standaardomstandigheden (E) onder disinhibition (F). Opnames werden genomen 2-3 weken na de dag van de laesie. Aangepast van Heidemann et al. 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
FIGUUR 3. Immunohistochemische karakterisering. (A) kleuring van motoneuronal cellichamen met SMI-32. (B) β-III tubuline etikettering van volwassen neuronale cellichamen en hun processen. (C) Identificatie van astrocyten met GFAP. (D) Etikettering van volwassen neuronale cel lichaam met Neun. (E) SMI-32 kleuring van niet-gefosforyleerd neurofilament H. (F) Gefosforyleerd neurofilament H geïdentificeerd door SMI-31. Aangepast van Heidemann et al. 10. Merk op dat beide, SMI-31 en SMI-32, een groot netwerk van vezels is zichtbaar in de kweken. Bars AD = 20 urn, H & F = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Verschillende elementen in de gepresenteerde procedure zijn van fundamenteel belang voor de verwezenlijking van nauwkeurige en reproduceerbare experimenten. Alle stappen tijdens de bereiding van de MEA, oplossingen en de productie van de slice cultures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. Antibiotica worden niet toegepast op het voedingsmedium omdat de spontane activiteit 14 kan beïnvloeden. Tijdens de MEA coating, het belangrijkste deel is ervoor te zorgen dat de extracellulaire matrix geloplossing koud blijft te allen tijde. Dooi in de koelkast en houdt het op ijs gedurende de gehele procedure een maximale temperatuur dichtbij 0 ° C te garanderen. Tijdens de voorbereiding van de plakjes snelle isolatie en snijden, alsmede aandacht voor een lage temperatuur met ijskoude dissectie buffers verhoogt het percentage gezonde culturen. Bovendien is de plasma / trombine coagulatie is een van de meest kritische stappen. Zorg er eerst voor dat het plasma is goed mixed met trombine. Tweede, bijzondere aandacht besteden aan het verwijderen van zo veel residu mogelijk om een goede bevestiging van de plakjes op de MEA waarborgen. Deze stap is zeer tijdgevoelige; als de tijd te kort, te veel van het plasma / trombine mengsel wordt verwijderd. Als de tijd te lang is, coagulatie al gebeurd, waardoor het risico van het verwijderen van de plakken met de overgebleven plasma / trombine.
Als mechanische laesies gepland, is het belangrijk om MEA te gebruiken met een nauwkeurige vormgeving. Het gebied waar de laesie bestemd moet vrij elektroden, draden en isolatie zijn. Anders, de elektra van de MEA zullen worden beschadigd en daarom kunnen er geen opnames meer worden uitgevoerd.
Een andere cruciale stap betreft de grootte van de laesie. Het is eerder aangetoond dat het opnieuw aansluiten van twee jonge plakken na laesie duurt ongeveer twee dagen 10. Voor alle experimenten, de vuistregel werd gebruikt dat de ruimte between de plakken na laesie mag niet groter zijn dan de breedte van de MEA groef (300 pm) zijn. Een grotere laesie grootte kan resulteren in een langere termijn voor heraansluiting of, als het letsel is te groot, geen heraansluiting helemaal. Annoteren, vroegere experimenten bleek dat een eerste plaatsing van de twee plakken verder dan 1 mm resulteert in een zeer lage verbindingssnelheid.
Voor de start van de opnamen, een aanpassing van ten minste 10 min tot kamertemperatuur in plaats van 37 ° C incubator, en de extracellulaire oplossing, in plaats van het voedings- medium wordt aanbevolen. Nauwkeurige observatie van de activiteit patroon tijdens deze eerste minuten zorgt ervoor dat de meetgegevens vertegenwoordigen het uiteenspatten patroon van de cultuur op de juiste wijze na de opname werd gestart.
Voor de detectie van de activiteit, data acquisitie en verdere verwerking, zelfgemaakte hardware (opname kamer, leidingen naar de versterkers en versterkers), programma's LabVIEW, C ++ en IgorPro gebruikt. Commerciële MEA setups en andere software pakketten zijn ook geschikt voor deze operaties. Hier zijn de signalen gezien door de elektroden worden versterkt 1001 keer, en vervolgens gedigitaliseerd met een frequentie van 6 kHz.
De gepresenteerde model kan een nuttig hulpmiddel voor propriospinal verbindingen te onderzoeken omdat in vivo, zijn ze moeilijk te bestuderen zonder tussenkomst van stijgende en dalende zenuwbanen. De co-kweken van twee ruggenmerg plakken kan dit probleem elegant omzeilen. De kweken leveren een micro die strak gecontroleerd en gemakkelijk gemanipuleerd kunnen. Anderzijds, supraspinale en sensorische input natuurlijk ontbreekt. Bovendien is de werkwijze van de kweek preparaat geeft een situatie van CNS-letsel. Gliale cellen zoals astrocyten en microglia zijn bekend reageren letsels met verhoogde proliferatie en derhalve het weefsel zekere mate gereorganiseerd. Betreffende de gepresenteerde model de vorming van een gliale litteken na het uitvoeren van mechanische laesies niet waargenomen. Een verklaring zou kunnen zijn dat aanpassingsmechanismen van astrocyten reeds werden geactiveerd tijdens het bereidingsproces en laesies van de kweken niet tot een verdere reactie. Ook is er geen bewijs voor de betrokkenheid van myeline geassocieerde remmers, bijv., Nogo-A, de lage regeneratiepotentieel van culturen gelaedeerde op hoge leeftijd. Er werd aangetoond dat behandeling met de fosfodiesterase 4 inhibitor Rolipram direct begint na het uitvoeren van laesies 23 DIV verhogingen functionele regeneratie tussen de segmenten 10. Deze resultaten demonstreren dat functioneel herstel in oude culturen worden verhoogd. Merkbaar, bij het tellen van het aantal axonen oversteken van de laesie site, geen verschil tussen culturen laesie op jonge leeftijd en culturen laesie op een oude leeftijd werd ontdekt. Deze bevindingen suggereren dat het ontbreken van axonale regeneratie is niet de belangrijkste reden fof het verlies van herstel na late laesies in de cultuur en daarom benadrukken de noodzaak van een model dat de functionele analyse van de wedergeboorte maakt. Synaptische vorming en de synaptische plasticiteit kan een belangrijke rol in het herstelproces 10 spelen. Deze mechanismen kreeg veel aandacht in de afgelopen jaren en het wordt tegenwoordig algemeen aanvaard dat ze een grote invloed op de uitkomst na dwarslaesie. Daarom kan een model dat stabiele gebied zorgt deze processen afzonderlijk en in detail te onderzoeken zeker helpen inzicht functionele regeneratie in het ruggenmerg te verkrijgen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
- Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
- Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures. Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).
- Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits. Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).
- Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture. J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).
- Hanson, M. G., Landmesser, L. T. Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules). Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).
- Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model. Neuroscience. 262, 40-52 (2014).
- Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).
- Tsuji, S., et al. Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures. J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).
- Magloire, V., Streit, J. Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).
- Mentis, G., et al. Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS. Brain Res. 861 (45–58), (2000).
