Summary
Qui vi presentiamo un protocollo che si basa su fette midollo spinale coltivate su array multi-elettrodo per studiare la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali in vitro.
Introduction
Culture fetta organotipiche del sistema nervoso centrale (SNC) sono stati ampiamente utilizzati per studiare diversi fenomeni fisiologici e patologici che raggiungono dallo sviluppo neuronale alla neurodegenerazione. Rispetto a colture di cellule dissociate, fette organotipiche offrono il vantaggio di una maggiore complessità con citoarchitettura intatta e circuiteria sinaptica locale. Allo stesso tempo, il tessuto può essere analizzato in modo isolato, senza la necessità di coinvolgere la complessità del tutto in contesto vivo. Inoltre, l'accesso facile e ripetuto alle cellule di scelta è giustificata, l'ambiente extracellulare può essere controllata con precisione e di solito, modelli in vitro sono meno costosi rispetto alle loro controparti in vivo. Negli ultimi anni, diversi studi presentati somiglianze tra i profili di sviluppo delle culture a lungo termine contro gli animali corrispondenti che vivono 1,2. E 'stato dimostrato che i circuiti neuronali di varia CNS regions esprimono l'attività di rete spontanea durante lo sviluppo e che le fette organotipiche parzialmente mantenere questo fenomeno 3 -7. Isolato preparazioni midollo spinale sono stati particolarmente utilizzato per indagare generazione ritmo 6 e la formazione di circuiti neuronali 1.
Un modo per registrare l'attività spontanea di fette organotipiche è loro coltura in cima array multi-elettrodo (MEA). Questi dispositivi contengono elettrodi multipli in grado di monitorare i potenziali extracellulari generati dai potenziali d'azione da numerose celle contemporaneamente (registrazione multi-unità). La risoluzione temporale elevata delle registrazioni MEA può essere utilizzato per ricostruire la dinamica precisa attività di un dato circuito neuronale. Inoltre, a differenza di patch-bloccaggio la tecnica è non invasiva, che consente misurazioni a lungo termine e comporta il fatto che i neuroni non sono interessati nel loro comportamento.
Fo lo scopo di questo studio, la combinazione di midollo spinale co-colture organotipiche e registrazioni multisito stato usato per studiare la rigenerazione funzionale all'interno del midollo spinale. Dal adulti vertebrati superiori sono potenzialmente in grado di recuperare dai danni del midollo spinale limitato, diverse strategie sono state studiate per promuovere la rigenerazione dopo una lesione del midollo spinale. Finora, il tratto corticospinale è stato in genere il sistema di modello di scelta per tali indagini. Questi esperimenti sono in genere in termini di tempo, costosi e richiedono grandi coorti di animali a causa dell'elevata variabilità all'interno di singoli gruppi. Inoltre, l'evidenza suggerisce che le connessioni propriospinali (neuroni che sono interamente trovino all'interno del midollo spinale) possono svolgere un ruolo centrale nel processo di recupero a seguito di lesioni del midollo spinale 8. Queste fibre sono difficili da studiare in vivo, senza l'interferenza di ascendente e discendente tratti di fibre. Bonnici e Kapfhammer 9 utilizzati longitudinale midollo spinaleculture fetta di topi postnatali, come un approccio alternativo. Dopo l'esecuzione di lesioni meccaniche hanno analizzato semi-quantitativamente la rigenerazione degli assoni morfologica tra segmenti del midollo spinale. Essi hanno osservato meno, ma non nessuno assoni che attraversano il sito della lesione nelle culture tagliato in età matura. Al contrario, le culture che sono stati lesionati in una fase più giovane visualizzate una quantità elevata di rigenerazione assonale 5 - 7 giorni dopo il danno. Tuttavia, la prova per connessioni funzionali non è stato presentato.
Pertanto, lo sviluppo di un rappresentante modello in vitro di fibre propriospinali che permette la ricerca di rigenerazione funzionale può essere un valido strumento per estendere la nostra conoscenza dei processi rigenerativi del midollo spinale.
Protocol
Cura degli animali era in conformità alle linee guida approvate dalle autorità locali svizzere (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, Nrs approvazione. 52/11 e 35/14). Queste linee guida sono in accordo con la Direttiva della Comunità Europea 2010/63 / UE.
Nota: Il lavoro in una cappa a flusso laminare con strumenti e soluzioni sterili per tutti i passaggi 1 - 5 compresi sottofasi.
1. Preparazione di MEA
Nota: MEA sono composti da un substrato di vetro, elettrodi metallici micro-fabbricate e uno strato SU-8 isolamento polimero (vedi anche Tscherter et al. 3). Per lo scopo di questo studio, MEA disponibili in commercio sono stati ordinati con un layout personalizzato array di elettrodi (Figura 1 A e B). Gli elettrodi 68 sono disposti in una griglia rettangolare che è diviso in due zone da una 300 micron scanalatura larga senza elettrodi, elettrcavi iCal e isolamento. Ciascun elettrodo è di 40 x 40 micron di dimensioni e sono distanziate di 200 micron da centro a centro. Quattro grandi elettrodi di massa sono posizionati intorno al sito di registrazione. Si differenziano da altri MEA standard disponibili in commercio nelle loro dimensioni (21 millimetri x 21 mm) e non hanno alcuna camera di registrazione fissa.
- Per la disinfezione MEA risciacquo a 100% di etanolo (2x), il 70% di etanolo (1x) e acqua distillata (2x) per almeno 30 secondi ciascuno. Lasciate asciugare. Mettere 10 - 12 MEA in una capsula di Petri di vetro pulito (150 mm x 25 mm) e chiudere il coperchio.
- MEA autoclave per 20 minuti a 120 ° C. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di rivestimento (vedi elenco dei materiali) per i MEA e memorizzare aliquote a -20 ° C.
- Mettere ogni MEA in una piastra di Petri sterile individuale (35 mm x 10 mm).
- Utilizzare una pipetta raffreddata a mettere 150 microlitri soluzione di rivestimento raffreddata sopra degli elettrodi e chiudere il coperchio della capsula di Petri. Dopo circa 10 minuti, verificare la presenza di bolle d'aria sulla parte superiore delgli elettrodi e rimuovere delicatamente con una spatola di gomma coperto se necessario. Lasciare riposare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Aspirare i residui di soluzione di rivestimento, lavare 1x con il mezzo ottimizzata per prenatale e neuroni embrionali e 2x con acqua distillata, acqua sterile. Se MEA non vengono utilizzati fino al giorno successivo, tenerli in distillata, acqua sterile a 37 ° C in incubatore O / N. In caso contrario, lasciare direttamente asciugare a temperatura ambiente.
2. ingredienti necessari per la preparazione e la crescita di colture organotipiche
- Preparare soluzione di lavaggio priva di calcio (vedi elenco dei materiali).
- Ricostituire il plasma pollo in soluzione di lavaggio (1: 1, scuotere delicatamente, evitare la formazione di bolle), centrifugare a 3000 xg per circa 20 minuti e decantare il contenuto chiaro in una provetta sterile. Aliquotare 200 ml in cryotubes e conservare a -20 ° C.
- Ricostituire trombina da plasma bovino conseguenza (200 U / ml) e sterile filtro (filtro da 0,2 micron pori). Aliquota 200 ml in crytotubes e conservare a -20 ° C.
- Per 30 culture preparare 100 ml di mezzo nutriente (vedi elenco dei materiali).
3. midollo spinale tessuto Dissection
Nota: i rendimenti procedura, in funzione del numero di embrioni, fette midollo spinale per circa 25 - 35 co-culture e viene preparata all'interno di una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Applicare una dose letale di pentobarbital (0,4 ml) alla madre animale mediante iniezione intramuscolare. Confermare anestesia profonda controllando il riflesso di ritiro pedale. Consegnare E14 embrioni di ratto con taglio cesareo e il sacrificio per decapitazione.
- Trasferire i corpi degli embrioni in una piastra di Petri piena di sterili, refrigerati, soluzione di lavaggio.
- Effettuare un taglio trasversale completo con un bisturi sopra le zampe posteriori e un altro sopra gli arti anteriori e rimuovere gli arti dal corpo. Successivamente, fare un taglio nel piano frontale per separare visceri dal pezzo posteriore contenente il co spinalerd.
- Per affettare, trasferire i pezzi posteriori contenenti il midollo spinale, uno alla volta su un disco di montaggio e tagliato con uno spessore di 225 - 250 micron con un chopper tessuto. Mettere una goccia di soluzione di lavaggio sul tessuto tritato e trasferire fette con una spatola in 35 mm x 10 mm con piastre di Petri sterili riempiti, refrigerati, soluzione di lavaggio.
- Per ogni fetta separatamente, sezionare midollo spinale di distanza dal tessuto rimanente. Lascia gangli spinali allegato.
- Lasciate le fette riposare per 1 ora a 4 ° C.
4. Montaggio spinali Fette cavo tessuto su MEA
- Warm up mezzo nutriente sterile in incubatrice (37 ° C, leggermente svitato il coperchio per l'ossigenazione).
- Posizione MEA con una pinzetta sterile con punte ricoperte di gomma a temperatura ambiente nella capsula di Petri in un microscopio stereo con la matrice di elettrodi a fuoco. Centrare una goccia 6 ml di plasma pollo sulla matrice di elettrodi pulito, privo di polvere, e sterile. Usando una piccola spatola, con attenzione scorreredue sezioni del midollo spinale con lati ventrali fronte all'altra nella gocciolina plasma. Non toccare gli elettrodi con la spatola.
- Aggiungere 8 ml di trombina in giro per goccia di plasma pollo. Utilizzando la punta della pipetta trombina, mescolare con cura e diffondere la miscela di pollo al plasma / trombina intorno alle due fette. Anche in questo caso, non toccare direttamente la matrice di elettrodi fragile. Appena prima della coagulazione, aspirare eccesso pollo al plasma / trombina.
- Chiudere la capsula di Petri di trattenere umidità elevata mentre l'assemblaggio MEA / cultura siede per circa 1 ora in una camera umidificata all'interno incubatore a 37 ° C.
- Aggiungere con cautela 10 ml di mezzo nutriente per la camera di cultura, tappare la capsula di Petri e rimesso in incubatrice per circa 30 min.
- Posizionare ogni assemblea MEA / cultura, consigli coperte di gomma sterile in un tubo del rullo, aggiungere 3 ml di mezzo nutriente e chiudere ermeticamente il coperchio. Posizionare il rullo avvolgitore nel tamburo rullo ruotante a 1 - 2 rpm in incubatrice in 5% CO
- Modificare la metà del terreno di coltura dopo 7 giorni in vitro (DIV) e successivamente 1 - 2 volte a settimana.
5. lesioni meccaniche
- Prendere il gruppo MEA / cultura con punte sterili, coperte di gomma fuori dal tubo rullo e posto in una capsula di Petri senza mezzo nutritivo sotto un microscopio stereo con il tessuto a fuoco. Visivamente verificare che le due fette sono fusi.
- Tenere il MEA / cultura assemblea costante mettendo pinzette con punte rivestito in gomma sulla MEA.
- Collocare un bisturi nella scanalatura del MEA vicino alle fette di tessuto. Tenere il bisturi piuttosto in senso orizzontale.
- Sollevare il bisturi gestire fino ma lasciare che il bisturi rimanere nella scanalatura della MEA in modo tale che la lama "rotoli" dalla base alla punta e quindi tagli attraverso il tessuto che copre la scanalatura.
- Gravi i collegamenti tessuto residuo con una punta di 25 ago G se necessary. Lavorare solo nella zona all'interno del solco e non toccare i bordi di gara.
- Mettere il MEA / assieme cultura nel tubo del rullo. Fornire 3 ml di mezzo nutriente fresco alle culture e ricollocarle nel tamburo rullo nell'incubatrice.
6. Le registrazioni elettrofisiologiche di spontanea attività
- Per indagare la rigenerazione funzionale tra le due fette del midollo spinale dopo il numero scelto di DIV, montare il gruppo MEA / cultura in una camera di registrazione su un microscopio e applicare circa 500 microlitri soluzione extracellulare (vedi elenco dei materiali).
- Attendere 10 minuti prima della prima registrazione per consentire al sistema di stabilizzarsi.
- Record di base 2x attività spontanea per circa 10 minuti da ciascun elettrodo attività di rilevamento del MEA a temperatura ambiente.
- Per garantire condizioni stabili extracellulari, scambiare soluzione extracellulare dopo ogni sessione di registrazione.
- Per disinibire la rete, applicare extracellulare soluzione containing stricnina (1 micron) e gabazine (10 micron). Attendere almeno 2 minuti prima di iniziare la registrazione.
Analisi 7. I dati
Nota: Per la rilevazione dei potenziali d'azione extracellulare registrate utilizzare per ciascun elettrodo un rivelatore basato su deviazioni standard e una successiva discriminatore. Questa procedura è descritta in dettaglio in Tscherter et al. 3.
- Visualizzare l'attività neuronale rilevata di ogni elettrodo in una trama raster secondo le procedure standard 3 (Figura 1F).
- Determinare e visualizzare l'attività di rete totale per ogni fetta sommando il numero di eventi nei canali secondo all'interno di una finestra scorrevole di 10 msec, spostato da passi di 1 msec (Figura 1G e vedere Tscherter et al. 3).
- Rileva in ogni fetta esplosioni individuali (cluster di attività che appaiono su più elettrodi). Dunque, Impostare un minimo di soglia picco di attività nel corrispondente attività di rete totale e definire ogni inizio e fine scoppiare scoppiare. Ad esempio, una soglia appropriata è del 25% dell'ampiezza media di scoppio e un inizio raffica può essere definito per essere il primo evento in una finestra temporale di almeno 5 msec, un'estremità scoppio essendo l'ultimo evento in una finestra temporale di almeno 25 msec (vedere Heidemann et al. 10).
- Per quantificare la rigenerazione funzionale calcolare la percentuale di raffiche sincronizzati tra le due sezioni. Per fare questo, calcolare la latenza tra uno scoppio in una fetta e la seguente scoppio in altra fetta.
Nota: Una coppia di burst viene definito "sincronizzato" quando la latenza è minore della lunghezza media burst. Specialmente in co-colture con un sacco di attività, esiste la possibilità che entrambe le parti coincidenza avviare un burst nella finestra latenza prescelto. Questo fatto deve essere preso in considerazione nella quantificazione della percentuale di syscoppia nchronized. Per una descrizione dettagliata dei calcoli vedere Heidemann et al. 10.
8. Fissazione delle Culture e immunoistochimica
- Per tutte le fasi che includono il lavaggio o l'incubazione assicuratevi di mettere le culture su un tavolo ribaltabile per garantire la corretta diffusione della soluzione attraverso il tessuto.
- Subito dopo la sessione di registrazione è terminata prendere il gruppo MEA / cultura fuori il setup, mettetelo in una capsula di Petri (35 mm x 10 mm) e aggiungere circa 2 ml di soluzione extracellulare.
- Per separare le fette dagli strati di cellule circostanti che si sono formati durante il tempo in vitro, prendere una punta pipetta 10 microlitri e cerchiare le fette. Fare attenzione a non danneggiare le culture. E 'possibile omettere questo passo ma incorporamento seguito è più facile quando viene eseguita.
- Utilizzare un sottile ago da siringa non metallico (vedi elenco) materiali in combinazione con una siringa da 1 ml piena di soluti extracellularea soffiare delicatamente la cultura fuori dal MEA.
- Rimuovere la punta di una pipetta Pasteur e montare il bulbo di gomma sulla fine scaglie. Utilizzare il back-end per trasferire la cultura in fissativo (paraformaldeide al 4% con tampone fosfato (PBS, 0,1 M)). Non utilizzare la punta standard della pipetta Pasteur per il trasferimento perché è troppo piccola e le culture sarebbe piegata e probabilmente danneggiato. Fix per 1-2 ore a 4 ° C. Risciacquare MEA con acqua distillata e rimuovere i residui di tessuto con le dita, ma non graffiare con l'unghia. Conservare MEA in acqua distillata a 4 ° C
- Lavare le culture 3x in PBS per almeno 10 minuti ciascuno. Conservare in PBS a 4 ° C o iniziare direttamente con la procedura di colorazione.
- Incubare le culture per almeno 90 min in una soluzione bloccante (siero di capra 5%, 1% di albumina di siero bovino, 0,3% di detergente in PBS).
- Aggiungere il primo anticorpo diluito in soluzione di bloccaggio e incubare per 3 notti a 4 ° C.
- Lavare 3x in PBS per a lest 30 minuti ciascuno.
- Aggiungere il secondo anticorpo diluito in PBS per 2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare 3x in PBS per almeno 30 minuti ciascuna.
- Trasferire le fettine con una pipetta Pasteur con la punta rimosso su uno scivolo oggetto. Rimuovere l'eccesso di PBS e incorporare con mezzo di montaggio.
Representative Results
Per studiare il potenziale di recupero funzionale dei co-colture derivate dal midollo spinale di E14 embrioni di ratto, le lesioni sono state eseguite in una finestra temporale da 8 a 28 DIV. 2 a 3 settimane più tardi, l'attività neuronale spontanea è stata registrata con i MEA (Figura 1 C & D). I potenziali d'azione extracellulare registrati sono stati identificati non in linea per ogni singolo elettrodo (Figura 1E). Da questi dati sono stati generati grafici raster (Figura 1F), seguita da trame attività di rete di visualizzare l'attività totale separatamente per lato (Figura 1G). In ogni sezione l'attività spontanea di solito è organizzato in modo discontinuo. Se le fette sono funzionalmente collegati, questi lampi possono propagarsi da una fetta all'altra. Pertanto, la quantità di esplosioni sincronizzate tra i due fette è stato calcolato per misurare quantitativamente la rigenerazione funzionale. Per una descrizione dettagliata di come la trasformazione into le diverse trame viene eseguito e in che modo è stata derivata la formula per il calcolo della percentuale di attività sincronizzata, vedere Heidemann et al. 10.
In tutti gli esperimenti, l'attività è stata registrata prima sotto condizioni standard. In una seconda fase, l'inibizione sinaptica è stata bloccata con l'aggiunta di stricnina (1 pM) e gabazine (10 pM) per la soluzione del bagno extracellulare. Questo disinhibition solito porta ad un modello un'attività più regolare con raffiche prolungate ed intervalli di scoppio, che facilita la definizione di burst e quindi la determinazione della sincronizzazione raffica tra le fette.
Culture lesionati in giovane età (7 - 9 DIV) mostravano una elevata quantità di attività sincronizzata 2-3 settimane dopo lesione che culture lesione delle nelle fasi successive (> 19 DIV) ha mostrato una netta riduzione nella capacità di rigenerare (Figura 2 A - F). Questi risultati indicano che la capacità di rigenerazionedelle connessioni funzionali in culture fetta midollo spinale diminuisce da un livello elevato, che rappresenta lo stato embrionale in vivo, ad un livello basso, che rappresenta lo stato ulteriormente sviluppato in vivo, entro tre settimane in coltura.
Quali tipi di connessioni sono effettivamente coinvolti nella sincronizzazione scoppiato tra le due fette? Oltre ai collegamenti propriospinali, le fibre potrebbero anche derivare da motoneuroni o dorsali radice gangliari neuroni. È stato precedentemente dimostrato che i neuroni dorsali radice gangliari non sono rilevanti per la connettività funzionale tra il midollo spinale fette 10. Tuttavia, il coinvolgimento dei motoneuroni è rimasta una possibilità. Poiché motoneuroni sono noti per formare connessioni colinergici a neuroni del midollo spinale attraverso recettori nicotinici 13, l'attività del midollo spinale co-colture è stato registrato a 8 DIV, un momento in cui le culture mostrano altamente sincronizzati attività 10, e l'antagonista nicotinico MECAMylamine (MEC, 100 mM) è stato aggiunto alla soluzione del bagno extracellulare. Una partecipazione dei motoneuroni nella connessione tra i due fette comporterebbe una percentuale ridotta di attività sincronizzate. Tuttavia, questo non era il caso (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; controllo: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p> 0,05, Wilcoxon abbinato prova coppie). Questi risultati suggeriscono che le sinapsi colinergiche non contribuiscono al collegamento funzionale tra fette. Tuttavia, poiché i motoneuroni hanno anche dimostrato di rilasciare glutammato alle sinapsi nel SNC 11, 15, questi esperimenti non escludono del tutto il loro coinvolgimento.
Per identificare motoneuroni colorazioni immunoistochimica contro il neurofilament non fosforilata H con SMI-32 sono state eseguite. Hanno rivelato diversi enti etichettati grandi cellule tipiche per motoneuroni, distribuite sopra le fette (Figura 3A). L'anticorpo SMI-32 è stato segnalato per etichettare i corpi cellulari dei motoneurons 12 e questa constatazione vale per le colture usate 13 anche. Inoltre, colorazioni di corpi cellulari neuronali in generale, ad esempio, contro b-III-tubulina o NeuN così come corpi cellulari gliali, ad es., Gli astrociti con anticorpi GFAP sono in linea con le altre relazioni e corrispondono alle descrizioni morfologiche di questi tipi di cellule ( Figura 3 B - D). Tuttavia, l'etichettatura degli assoni con l'anticorpo SMI-32 è relativa (Figura 3E). Contro le aspettative, una grande rete di fibre appare quando si usa questo anticorpo e sembra simile alla colorazione SMI-31 che le etichette fosforilata neurofilamenti H (Figura 3F). Una interpretazione di questo risultato potrebbe essere che la regolazione dello sviluppo di neurofilament fosforilazione / defosforilazione non è così stretto nelle culture utilizzati rispetto alla situazione in vivo. Un verificarsi misto di neurofilamenti fosforilati e non fosforilati nella stessa assone potrebbe Explain questo risultato. Un'altra possibilità è che le SMI-32 assoni etichettati derivano dai neuroni di proiezione. Tsang e colleghi 16 hanno dimostrato che ad esempio, colonna e colonna cella intermediolaterale neuroni di Clark sono macchiati da SMI-32, oltre motoneuroni. Neurite proliferazione pronunciato di tali neuroni potrebbe anche spiegare l'abbondanza di SMI-32 fibre positive.
Figura 1. Visualizzazione e analisi di attività spontanea. (A) Schema di una MEA. Gli elettrodi di platino coperto sono raffigurati in nero, i fili trasparenti in rosso e la scanalatura al centro della MEA in giallo. (B) Primo piano della matrice di elettrodi situato nel centro del MEA. I diagrammi sono gentilmente forniti dal Dr. M. Heuschkel. (C) Immagine chiara campo di un 8 DIV vecchio culture. Le fette sono cresciuti e fuso lungo i lati di fronte all'altro. La barra gialla rappresenta il solco electrode- e senza isolamento del MEA. Scala bar = 400 micron (D) Timeline di esperimenti. Due fette del midollo spinale di E14 embrioni di ratto sono posti uno accanto all'altro su MEA. Nel giro di pochi giorni, le fette crescono e fusibile lungo i lati di fronte all'altro. In un lasso di tempo di 8-28 DIV, lesioni complete sono effettuati attraverso il sito di fusione. Due o tre settimane dopo l'attività spontanea è registrata e le culture sono fissati per colorazioni immunoistochimica. (E) spontanee tracce di attività di ogni singolo elettrodo di un 23 DIV vecchia cultura. Per la visualizzazione più chiara, solo ogni due traccia è illustrata. Tracce arancioni raffigurano attività che è stata registrata dalla fetta sul lato destro, tracce blu dal lato sinistro. La maggior parte dei burst sono sincronizzati tra i due. La freccia indica una raffica che si verificano nella fetta di sinistra che solo partially propagate al fetta destra. L'attività nella fetta destra tuttavia non ha raggiunto la soglia scelta di almeno il 25% dell'attività picco massimo medio della rispettiva fiancata secondo e, pertanto, non viene rilevato come un burst. Ingrandimenti a destra raffigurano l'ultima coppia scoppio sincronizzato. (F) Raster trama attività mostrato in (E). (G) trama di attività di rete con scoppi definite (barre sotto della linea di base) dell'attività mostrato in (E). Adattato da Heidemann et al. 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sincronizzato contro Attività Non Sincronizzato. (A, B) trame raster di culture lesioned in giovane età (a 7 - 9 DIV), mostrando attività sincronizzata in condizioni standard (A) e sotto disinhibition (B). (C, D) trame raster di culture lesionati in età avanzata (a> 19 DIV), che mostra l'attività non sincronizzate in condizioni standard (C) e sotto disinibizione (D). (E, F) Percentuale media di attività sincronizzata tracciata per ogni singolo giorno lesione registrato in condizioni standard (E) e sotto disinhibition (F). Le registrazioni sono state prese 2 - 3 settimane dopo il giorno di lesione. Adattato da Heidemann et al. 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
FIGURA 3. Caratterizzazione immunoistochimica. (A) La colorazione di corpi cellulari motoneuronale con SMI-32. (B) l'etichettatura tubulina β-III di corpi cellulari dei neuroni maturi e loro processi. (C) Identificazione di astrociti con GFAP. (D) Etichettatura di maturo corpo delle cellule neuronali con NeuN. (E) SMI-32 colorazione di non fosforilata neurofilament H. (F) neurofilamento Phosphorylated H identificato da SMI-31. Adattato da Heidemann et al. 10. Si noti che con entrambi, SMI-31 e SMI-32, una grande rete di fibre è visibile nelle culture. Bar AD = 20 micron, H & F = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Diversi elementi della procedura presentata sono fondamentali per la realizzazione di esperimenti accurati e riproducibili. Tutte le fasi durante la preparazione dei MEA, soluzioni e la produzione delle culture fetta sono eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Gli antibiotici non sono applicati al terreno nutritivo perché possono influenzare l'attività spontanea 14. Durante il rivestimento MEA, la parte più importante è assicurarsi che la soluzione di gel matrice extracellulare rimane freddo in ogni momento. Scongelare in frigorifero e tenerlo in ghiaccio per tutta la procedura al fine di garantire una temperatura massima prossima a 0 ° C. Durante la preparazione del isolamento rapido fette e sezionamento, nonché facendo attenzione a bassa temperatura utilizzando ghiaccio buffer dissezione a freddo aumenta la percentuale di colture sane. Inoltre, il plasma / trombina coagulazione è una delle fasi più critiche. Per prima cosa, assicurarsi che il plasma è propriamente mixed con la trombina. In secondo luogo, prestare particolare attenzione a rimuovere il più residui possibile per garantire il corretto fissaggio delle fette ai MEA. Questo passo è estremamente sensibili al fattore tempo; se l'intervallo di tempo è troppo breve, troppo della miscela plasma / trombina viene rimosso. Se l'intervallo di tempo è troppo lungo, coagulazione già avvenuto, aumentando il rischio di rimuovere le fette insieme al residuo plasma / trombina.
Se sono previsti lesioni meccaniche, è importante utilizzare MEA con una accurata progettazione. La zona in cui è destinata la lesione deve essere privo di elettrodi, fili e isolamento. In caso contrario, l'impianto elettrico del MEA stanno per essere danneggiate e di conseguenza, non possono essere eseguite le registrazioni più.
Un altro passo cruciale riguarda la dimensione della lesione. E 'stato dimostrato in precedenza che ricollegare due giovani fette dopo lesione richiede circa due giorni 10. Per tutti gli esperimenti, la regola generale è stato utilizzato che lo spazio between le fette dopo lesione non dovrebbe essere più grande della larghezza del MEA scanalatura (300 micron). Una dimensione della lesione più grande potrebbe provocare un arco di tempo più lungo per la riconnessione o, se la lesione è troppo grande, nessuna riconnessione a tutti. Per annotare, ex esperimenti hanno rivelato che una collocazione iniziale delle due fette più lontano di 1 mm risultati in un tasso di connessione è molto modesto.
Prima dell'inizio delle registrazioni, un tempo regolazione di almeno 10 minuti a RT, invece di 37 ° C dell'incubatrice, e alla soluzione extracellulare, invece del mezzo nutrizione è raccomandato. Un'attenta osservazione del pattern attività durante questi primi minuti assicura che i dati misurati rappresentano il pattern scoppio della coltura appropriato dopo la registrazione è stata avviata.
Per la rilevazione dell'attività, acquisizione dati e l'ulteriore elaborazione, hardware casalingo (registrazione camera, collegamenti agli amplificatori e amplificatori), programmi nel laboratorioVISTA, sono utilizzati C ++ e IgorPro. Configurazioni MEA commerciali e altri pacchetti software sono adatti anche per tali operazioni. Qui, i segnali vista dagli elettrodi vengono amplificate 1001 volte, e poi digitalizzato ad una velocità di 6 kHz.
Il modello presentato può essere uno strumento utile per esaminare le connessioni propriospinali perché in vivo, sono difficili da studiare senza l'interferenza di ascendente e discendente tratti di fibre. Il co-coltura di due fette del midollo spinale può elegantemente aggirare questo problema. Le colture forniscono un microambiente che può essere strettamente controllata e facilmente manipolabili. D'altra parte, ingresso sovraspinale e sensoriale è mancante naturalmente. Inoltre, il processo di preparazione della cultura rappresenta una situazione di danno al SNC. Le cellule gliali come astrociti e microglia sono noti per rispondere alle lesioni con aumento della proliferazione e di conseguenza, il tessuto è in una certa misura riorganizzata. Relativamente alla modalità presentatol la formazione di una cicatrice gliale dopo aver eseguito lesioni meccaniche non è stata osservata. Una spiegazione potrebbe essere che meccanismi adattativi di astrociti sono stati già attivati durante il processo di preparazione e che le lesioni delle culture non producono ulteriori risposta. Inoltre, non ci sono prove del coinvolgimento di inibitori associati mielina, ad es., Nogo-A, nel potenziale rigenerazione basso di culture lesionati in età avanzata. Tuttavia, è stato dimostrato che il trattamento con l'inibitore della fosfodiesterasi 4 Rolipram, partendo direttamente dopo aver eseguito lesioni a 23 DIV aumenta la rigenerazione funzionale tra le fette 10. Questi risultati dimostrano che il recupero funzionale può essere aumentata in vecchie culture. Notevolmente, quando il conteggio del numero di assoni che attraversano il sito della lesione, nessuna differenza tra le culture lesionati in giovane età e culture lesionati in età avanzata è stato scoperto. Questi risultati suggeriscono che la mancanza di rigenerazione assonale non è la ragione principale fo la perdita di recupero dopo lesioni tardivi in cultura e quindi sottolineano l'esigenza di un modello che permette l'analisi funzionale della rigenerazione. Formazione sinaptica e la plasticità sinaptica potrebbero svolgere un ruolo importante nel processo di recupero 10. Questi meccanismi hanno guadagnato molta attenzione negli ultimi anni ed è ormai ampiamente accettato che essi hanno un impatto importante sul risultato dopo una lesione del midollo spinale. Pertanto, un modello che offre le condizioni stabili per indagare questi processi in isolamento e in grande dettaglio può certamente aiutare ad ottenere comprensione circa la rigenerazione funzionale nel midollo spinale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
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