Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Culturas organotípicas de fatias do sistema nervoso central (SNC) tem sido amplamente utilizado para estudar vários fenómenos fisiológicos e patológicos que vão desde o desenvolvimento neuronal a neurodegeneração. Em comparação com culturas de células dissociadas, fatias organotípicas oferecem a vantagem de uma maior complexidade com um citoarquitetura intacta e circuitos sináptica local. Ao mesmo tempo, o tecido pode ser analisada de uma maneira isolada, sem a necessidade de comprometer a complexidade do conjunto no contexto in vivo. Além disso, o acesso fácil e repetido para as células de escolha é justificada, o ambiente extracelular pode ser controlada com precisão e, geralmente, em modelos in vitro são menos onerosos do que os seus homólogos in vivo. Nos últimos anos, vários estudos apresentados semelhanças notáveis entre os perfis de desenvolvimento de culturas de longo prazo contra os animais que vivem correspondente 1,2. Demonstrou-se que os circuitos neuronais do CNS vários Regions expressar atividade de rede espontânea durante o desenvolvimento e que fatias organotípicas manter parcialmente este fenómeno 3 -7. Isolado preparações da medula espinal têm sido especialmente usados para investigar geração ritmo 6 e a formação de circuitos neuronais 1.
Uma maneira de gravar a atividade espontânea de fatias organotípicas é a cultura deles em cima de arrays multi-eletrodo (AMA). Estes dispositivos contêm múltiplos eletrodos que podem monitorar os potenciais extracelulares geradas por potenciais de ação de numerosas células simultaneamente (gravação multi-unidade). A alta resolução temporal das gravações MEA pode ser usado para reconstruir a dinâmica atividade precisa dentro de um dado circuito neuronal. Além disso, em contraste com o remendo de fixação da técnica é não-invasiva, que permite medições de longo prazo e que resulta no fato de que os neurónios não são afectados no seu comportamento.
Fou o propósito deste estudo, a combinação de organotípicas espinal medula co-culturas e gravações multisite foi utilizado para investigar a regeneração funcional no interior da medula espinal. Desde adultos vertebrados superiores têm potencial para recuperar de danos da espinal medula limitado, diferentes estratégias têm sido estudados para promover a regeneração após a lesão da medula espinal. Até agora, o trato corticoespinhal geralmente tem sido o sistema de modelo de escolha para tais investigações. Estas experiências são geralmente demorado, caro e exige grandes grupos de animais, devido à alta variabilidade dentro dos grupos individuais. Além disso, as evidências sugerem que as conexões propriospinal (neurônios que são totalmente confinados dentro da medula espinhal) pode desempenhar um papel fundamental no processo de recuperação após lesões da medula espinhal 8. Estas fibras são difíceis de estudar in vivo sem a interferência de ascendentes e descendentes tratos de fibras. Bonnici Kapfhammer e 9 utilizada medula espinhal longitudinalculturas fatia de ratos pós-natais como uma abordagem alternativa. Após a realização de lesões mecânicas eles analisaram semi-quantitativamente a regeneração morfológica de axônios entre segmentos da medula espinhal. Eles observaram menos, mas não nenhum axônios que cruzam o local da lesão em culturas cortadas em uma idade madura. Em contraste, as culturas que foram lesionados numa fase mais jovem exibido uma elevada quantidade de regeneração axonal 5 – 7 dias após o dano. No entanto, a prova para conexões funcionais não foi apresentada.
Por conseguinte, o desenvolvimento de um modelo in vitro representativo de fibras propriospinal que permite a investigação de regeneração funcional pode ser uma ferramenta valiosa para estender o nosso conhecimento sobre os processos de regeneração da medula espinhal.
Vários elementos do processo apresentados são fundamentais para a realização de experimentos precisos e reprodutíveis. Todos os passos durante a preparação das soluções e meas, a produção das culturas de fatias são realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. Os antibióticos não são aplicados ao meio nutriente, pois podem afectar a actividade espontânea 14. Durante o revestimento MEA, a parte mais importante é certificar-se que a solução de gel matriz extracelular permanece frio em todos os momentos. Descongele na geladeira e mantê-lo em gelo durante todo o procedimento para garantir uma temperatura máxima próxima de 0 ° C. Durante a preparação do fatias rápido isolamento e corte, bem como prestar atenção a uma baixa temperatura, utilizando gelo buffers dissecção fria aumenta a porcentagem de culturas saudáveis. Além disso, o / trombina coagulação do plasma é um dos passos mais críticos. Primeiro, certifique-se de que o plasma é adequadamente mixed com a trombina. Em segundo lugar, prestar especial atenção à remoção de resíduos tanto quanto possível para assegurar a fixação adequada das fatias para os acordos ambientais multilaterais. Este passo é extremamente sensível ao tempo; Se o intervalo de tempo for demasiado curto, o excesso da mistura de plasma / trombina é removido. Se o intervalo de tempo for demasiado longo, já ocorreu coagulação, aumentando o risco de a remoção das fatias, juntamente com o resíduo de plasma / trombina.
Se as lesões mecânicas são planejadas, é importante a utilização de acordos ambientais multilaterais, com um planeamento cuidadoso. A área onde a lesão se destina precisa estar livre de eletrodos, fios e isolamento. Caso contrário, o sistema eléctrico do MEA vão ser danificado e, portanto, não há gravações pode mais ser executada.
Um outro passo crucial diz respeito ao tamanho da lesão. Foi demonstrado anteriormente que a reconexão duas pequenas fatias após lesão leva cerca de dois dias a 10. Para todos os experimentos, a regra de ouro foi usado que o espaço betwebr as fatias após lesão não deve ser maior do que a largura da ranhura de MEA (300 uM). Um tamanho maior lesão pode resultar em um prazo mais longo para a reconexão ou, se a lesão é muito grande, não reconexão em tudo. Para anotar, ex experiências revelaram que uma colocação inicial das duas fatias mais longe do que 1 mm resultados em uma taxa de ligação muito reduzida.
Antes do início da gravação, um tempo de ajuste de pelo menos 10 min à temperatura ambiente, em vez de 37 ° C da incubadora, e à solução extracelular, em vez do meio de nutrição é recomendado. Fechar observação do padrão de atividade durante esses minutos iniciais garante que os dados medidos representam o padrão estouro da cultura de forma adequada após a gravação foi iniciada.
Para a detecção da actividade, aquisição de dados e posterior processamento, hardware caseiro (câmara de gravação, ligações para os amplificadores e amplificadores), programas em laboratórioVIEW, C ++ e IgorPro são usados. Setups MEA comerciais e outros pacotes de software são adequados, bem como para estas operações. Aqui, os sinais observados pelos eléctrodos são amplificados de 1001 vezes e, em seguida digitalizou a uma taxa de 6 kHz.
O modelo apresentado pode ser uma ferramenta útil para examinar as conexões propriospinal porque in vivo, eles são difíceis de estudar sem a interferência do ascendente e descendente feixes de fibras. O co-cultura das duas fatias de medula espinhal pode elegantemente contornar este problema. As culturas proporcionar um microambiente que pode ser rigorosamente controlado e manipulado facilmente. Por outro lado, a entrada sensorial e supraespinal é falta de curso. Além disso, o processo da preparação de cultura representa uma situação de lesão do SNC. As células da glia como microglia e astrócitos são conhecidos por responder à lesão com o aumento da proliferação e, portanto, o tecido é, em certa medida reorganizado. Relativa ao modo apresentadol a formação de uma cicatriz glial após a realização de lesões mecânicas não foi observado. Uma explicação pode ser que os mecanismos adaptativos de astrócitos já foram desencadeadas durante o processo de preparação e que as lesões das culturas não resultou em uma resposta ainda mais. Além disso, não há evidências para o envolvimento de inibidores associados mielina, por exemplo., Nogo-A, em baixo potencial de regeneração de culturas lesionados em idade avançada. No entanto, foi demonstrado que o tratamento com o inibidor da fosfodiesterase 4 Rolipram, começando imediatamente após a realização de lesões em 23 DIV aumenta a regeneração funcional entre as fatias 10. Estes resultados demonstram que a recuperação funcional pode ser aumentado em culturas velhas. Visivelmente, quando a contagem do número de axônios que cruzam o local da lesão, não houve diferença entre as culturas lesionados em uma idade jovem e culturas lesionados em uma idade avançada foi descoberto. Estes resultados sugerem que a falta de regeneração axonal não é a razão principal fou a perda de recuperação após lesões tardias na cultura e, portanto, enfatizam a necessidade de um modelo que permite a análise funcional da regeneração. Formação sináptica e plasticidade sináptica poderia desempenhar um papel importante no processo de recuperação 10. Estes mecanismos ganhou muita atenção nos últimos anos e é hoje amplamente aceito que eles têm um grande impacto sobre o resultado após a lesão medular. Portanto, um modelo que proporciona condições estáveis para a investigação dos processos em isolamento e em grande detalhe pode certamente ajudar a obter uma visão sobre a regeneração funcional na medula espinhal.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |