Aquí se presenta un protocolo que se basa en rebanadas de la médula espinal cultivadas en matrices de electrodos múltiples para estudiar la regeneración funcional de conexiones propioespinal in vitro.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Cultivos de cortes organotípicos del sistema nervioso central (SNC) se han utilizado ampliamente para estudiar diversos fenómenos fisiológicos y patológicos que llegan desde el desarrollo neuronal a la neurodegeneración. En comparación con los cultivos de células disociadas, rebanadas organotípicos ofrecen la ventaja de una mayor complejidad con una citoarquitectura intacto y circuitos sinápticos local. Al mismo tiempo, el tejido puede ser analizada de forma aislada sin la necesidad de implicar a la complejidad de la totalidad en contexto vivo. Por otra parte, el acceso fácil y repetida a las células de elección se justifica, el medio extracelular se puede controlar con precisión y por lo general, los modelos in vitro son menos costosos que sus homólogos en vivo. En los últimos años, diversos estudios presentan similitudes sorprendentes entre los perfiles de desarrollo de los cultivos a largo plazo en comparación con los animales correspondientes viven 1,2. Se ha demostrado que los circuitos neuronales del CNS diferentes regions expresan actividad de la red espontánea durante el desarrollo y que las rebanadas organotípicos mantienen parcialmente este fenómeno 3 -7. Preparaciones aisladas de la médula espinal se han utilizado particularmente para investigar la generación de ritmo 6 y la formación de circuitos neuronales 1.
Una manera de registrar la actividad espontánea de las rebanadas organotípicos es a la cultura en la parte superior de las matrices multi-electrodo (MEA). Estos dispositivos contienen múltiples electrodos que pueden monitorear los potenciales extracelulares generados por potenciales de acción de numerosas células de forma simultánea (grabación multi-unidad). La alta resolución temporal de las grabaciones de MEA se puede utilizar para reconstruir la dinámica de actividad precisas dentro de un circuito neuronal dado. Además, en contraste con parche de sujeción de la técnica es no invasiva, que permite mediciones y resultados a largo plazo en el hecho de que las neuronas no se ven afectados en su comportamiento.
Fo el propósito de este estudio, se utilizó la combinación de la médula espinal co-cultivos organotípicos y grabaciones de múltiples sitios para investigar la regeneración funcional dentro de la médula espinal. Desde adultos vertebrados superiores han potencial para recuperarse del daño de la médula espinal limitado, diferentes estrategias han sido estudiados para promover la regeneración después de lesión de la médula espinal. Hasta el momento, el tracto corticoespinal ha sido por lo general el modelo de sistema de elección para este tipo de investigaciones. Estos experimentos son típicamente mucho tiempo, costoso y requieren grandes cohortes de animales debido a la alta variabilidad dentro de los grupos individuales. Por otra parte, la evidencia sugiere que las conexiones propioespinal (neuronas que están limitados en su totalidad dentro de la médula espinal) pueden jugar un papel fundamental en el proceso de recuperación después de las lesiones de la médula espinal 8. Estas fibras son difíciles de estudiar in vivo sin la interferencia de ascenso y descenso tractos de fibras. Bonnici y Kapfhammer 9 utilizan longitudinal de la médula espinalcultivos de cortes de ratones postnatales como un enfoque alternativo. Después de realizar las lesiones mecánicas analizaron semi-cuantitativamente la regeneración de los axones morfológica entre los segmentos de la médula espinal. Observaron menos pero no axones ninguno que cruzan el sitio de la lesión en las culturas de corte a una edad madura. En contraste, las culturas que fueron lesionadas en una etapa más joven muestran una alta cantidad de regeneración axonal 5 – 7 días después de los daños. Sin embargo, no se presentó prueba para las conexiones funcionales.
Por lo tanto, el desarrollo de un representante en el modelo in vitro de fibras propioespinal que permite la investigación de la regeneración funcional puede ser una herramienta valiosa para ampliar nuestros conocimientos acerca de los procesos regenerativos en la médula espinal.
Varios elementos en el procedimiento presentado son fundamentales para la realización de experimentos precisos y reproducibles. Todas las etapas durante la preparación de los AMMA, soluciones y la producción de los cultivos de cortes se realizan bajo condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Los antibióticos no se aplican al medio nutriente, ya que pueden afectar a la actividad espontánea 14. Durante el recubrimiento MEA, la parte más importante es asegurarse de que la solución de gel de matriz extracelular se mantiene fría en todo momento. Descongelar en la nevera y mantenerlo en hielo durante todo el procedimiento para asegurar una temperatura máxima cercana a 0 ° C. Durante la preparación de la rebanadas aislamiento rápido y seccionamiento, así como prestar atención a una baja temperatura mediante el uso de hielo buffers de disección en frío aumenta el porcentaje de cultivos sanos. Por otra parte, el plasma / trombina coagulación es uno de los pasos más críticos. En primer lugar, asegúrese de que el plasma es propiamente mixed con la trombina. En segundo lugar, prestar especial atención a la eliminación de la mayor cantidad de residuos posible para asegurar la fijación correcta de los cortes a los acuerdos ambientales multilaterales. Este paso es muy sensible al tiempo; si el plazo es demasiado corto, demasiado de la mezcla de plasma / trombina se retira. Si el marco de tiempo es demasiado largo, la coagulación ya ha ocurrido, aumentando el riesgo de la eliminación de las rodajas junto con el plasma residual / trombina.
Si se han previsto las lesiones mecánicas, es importante utilizar MEAs con un diseño preciso. La zona donde se pretende la lesión tiene que estar libre de electrodos, cables y aislamiento. De lo contrario, el sistema eléctrico de la MEA van a ser dañado y por lo tanto, no hay grabaciones se pueden realizar más.
Otro paso crucial se refiere el tamaño de la lesión. Se ha demostrado previamente que volver a conectar dos rebanadas jóvenes después de la lesión toma alrededor de dos día 10. Para todos los experimentos, se utilizó la regla de oro que el betwe espacioen las rodajas después de la lesión no debe ser más grande que la anchura de la ranura MEA (300 micras). Un tamaño de la lesión más grande podría dar lugar a un plazo más largo para la reconexión o, si la lesión es demasiado grande, sin reconexión en absoluto. Para anotar, ex experimentos revelaron que una colocación inicial de las dos rebanadas más lejos que los resultados de 1 mm en una velocidad de conexión muy bajo.
Antes del inicio de las grabaciones, un tiempo de ajuste de al menos 10 min a RT, en lugar de 37 ° C de la incubadora, y a la solución extracelular, en lugar del medio de nutrición se recomienda. Cerrar la observación del patrón de actividad durante estos minutos iniciales se asegura de que los datos medidos representan el patrón de estallido de la cultura apropiadamente después de que se inició la grabación.
Para la detección de la actividad, adquisición de datos y procesamiento adicional, hardware casera (cámara de grabación, las conexiones a los amplificadores y amplificadores), los programas en LabVISTA, se utilizan C ++ y IgorPro. Configuraciones MEA comerciales y otros paquetes de software son adecuados también para estas operaciones. Aquí, las señales vistas por los electrodos se amplifican 1001 veces y, a continuación, digitalizaron a una velocidad de 6 kHz.
El modelo presentado puede ser una herramienta útil para examinar las conexiones propioespinal porque in vivo, que son difíciles de estudiar sin la interferencia de ascenso y descenso tractos de fibras. El co-cultivo de dos rebanadas de la médula espinal puede eludir elegantemente este problema. Los cultivos proporcionan un microambiente que puede ser estrechamente controlada y manipulada fácilmente. Por otro lado, la entrada sensorial y supraespinal es, por supuesto faltante. Además, el proceso de la preparación de cultivo representa una situación de daño en el SNC. Las células gliales como astrocitos y microglia son conocidos para responder a lesiones con aumento de la proliferación y, por tanto, el tejido es hasta cierto punto reorganizado. En relación con el modo presentadol la formación de una cicatriz glial después de realizar las lesiones mecánicas no se observó. Una explicación podría ser que los mecanismos de adaptación de los astrocitos que ya se activaron durante el proceso de preparación y que las lesiones de las culturas no dio lugar a una respuesta aún más. Además, no hay pruebas de la participación de los inhibidores de mielina asociados, por ejemplo., Nogo-A, en el bajo potencial de regeneración de las culturas lesionadas a una edad avanzada. Sin embargo, se demostró que el tratamiento con el inhibidor de la fosfodiesterasa 4 Rolipram, empezando directamente después de la realización de las lesiones a los 23 DIV aumenta la regeneración funcional entre las lonchas 10. Estos resultados demuestran que la recuperación funcional se puede aumentar en las culturas antiguas. Notablemente, al contar el número de axones que cruzan el sitio de la lesión, se descubrió ninguna diferencia entre las culturas lesionadas a una edad temprana y culturas lesionadas a una edad avanzada. Estos hallazgos sugieren que la falta de regeneración axonal no es la razón principal fo la pérdida de la recuperación después de las lesiones tardías en la cultura y, por tanto, hacen hincapié en la necesidad de un modelo que permite el análisis funcional de la regeneración. Formación sináptica y la plasticidad sináptica podrían desempeñar un papel importante en el proceso de recuperación 10. Estos mecanismos ganaron mucha atención durante los últimos años y hoy en día es ampliamente aceptado que tienen un impacto importante en el resultado después de la lesión de la médula espinal. Por lo tanto, un modelo que proporciona condiciones estables para investigar estos procesos en aislamiento y en gran detalle sin duda puede ayudar a obtener una visión acerca de la regeneración funcional en la médula espinal.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |