Här presenterar vi ett protokoll som bygger på ryggmärgsskivor odlade på flera elektrodanordningar för att studera funktionell regenerering av propriospinal anslutningar in vitro.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Organotypic slice kulturer i det centrala nervsystemet (CNS) har använts i stor utsträckning för att studera olika fysiologiska och patologiska fenomen som sträcker sig från neuronal utveckling till neurodegeneration. Jämfört med dissocierade cellkulturer, organotypic skivor erbjuder fördelen med mer komplexitet med en intakt cytoarchitecture och lokal synaptiska kretsar. Samtidigt, kan vävnaden analyseras i ett isolerat sätt utan behov av att blanda in intrikat av hela in vivo sammanhang. Dessutom är enkel och upprepad tillgång till cellerna av val motiverat, den extracellulära miljön kan styras exakt och vanligtvis, in vitro-modeller är mindre kostsamma än deras in vivo motsvarigheter. Under de senaste åren, olika studier presenteras slående likheter mellan de utvecklings profilerna för långtidskulturer jämfört med motsvarande levande djur 1,2. Det har visats att neuronala kretsar av olika CNS-regions uttrycker spontan nätverksaktivitet under utveckling och att organotypic skivor delvis behålla detta fenomen 3 -7. Isolerade ryggmärgs preparat har speciellt använts för att undersöka rytmgenerering 6 och bildandet av neuronala kretsar 1.
Ett sätt att spela den spontana aktiviteten hos organotypiska skivor är att kultur dem ovanpå multi-elektrod arrayer (MEA). Dessa enheter innehåller flera elektroder som kan övervaka extracellulära potentialer som genereras av aktionspotentialer från många celler samtidigt (multi-enhet inspelning). Den höga tidsupplösning av MEA inspelningar kan användas för att rekonstruera de exakta aktivitets dynamiken inom en given neuronal krets. Dessutom,-kläm patch tekniken står i kontrast till icke-invasiv, vilket möjliggör långtidsmätningar och resultat i det faktum att nervceller inte påverkas i sitt beteende.
Feller syftet med denna studie var kombinationen av organotypic ryggmärgs samkulturer och flera platser inspelningar som används för att undersöka funktionell förnyelse inom ryggmärgen. Eftersom vuxna högre ryggradsdjur har begränsad potential att återhämta sig från skador på ryggmärgen, har olika strategier studerats för att främja regenerering efter ryggmärgsskada. Hittills har kortikospinala vägarna oftast stått modell valfrihetssystem för sådana undersökningar. Dessa experiment är typiskt tidsödande, kostsamma och kräver stora djur kohorter på grund av hög variabilitet inom enskilda grupper. Dessutom tyder allt på att propriospinal anslutningar (neuroner som helt är begränsade i ryggmärgen) kan spela en central roll i återhämtningsprocessen efter ryggmärgsskador 8. Dessa fibrer är svåra att studera in vivo utan inblandning av stigande och fallande fiber skrifter. Bonnici och Kapfhammer 9 används längsgående ryggmärgenslice kulturer av postnatal möss som ett alternativt tillvägagångssätt. Efter att ha utfört mekaniska skador de analyserade halv kvantitativt morfologiska regenerering av axoner mellan ryggmärgssegmenten. De observerade mindre men inte ingen axoner korsar lesionsstället i kulturer skurna på en mogen ålder. Däremot kulturer som skadade vid en yngre skede visade en stor mängd av axonal regeneration 5 – 7 dagar efter skadan. Men bevis för funktionella anslutningar presenterades inte.
Därför kan utvecklingen av en representant i modell av propriospinal fibrer vitro som gör utredningen av funktionell regenerering vara ett värdefullt verktyg för att utöka vår kunskap om regenerativa processer i ryggmärgen.
Flera inslag i den presenterade förfarandet är grundläggande för att utföra exakta och reproducerbara experiment. Alla steg under framställningen av MEA, lösningar och produktionen av de slice kulturer utförs under sterila förhållanden i ett dragskåp med laminärt flöde. Antibiotika tillämpas inte på näringsmediet, eftersom de kan påverka den spontana aktivitet 14. Under MEA beläggningen är den viktigaste delen för att se till att den extracellulära matrisen gellösningen förblir kallt hela tiden. Tina den i kylskåpet och hålla den på is för hela förfarandet för att säkerställa en maximal temperatur nära 0 ° C. Under beredningen av skivor snabb isolering och sektionering, samt att uppmärksamma en låg temperatur med hjälp av iskalla dissektion buffertar ökar andelen friska kulturer. Dessutom är plasma / trombin koagulation en av de mest kritiska stegen. Se först till att plasma är korrekt mixed med trombin. För det andra, ägna särskild uppmärksamhet åt att ta bort så mycket återstod som möjligt för att säkerställa korrekt fastsättning av skivorna till MEA. Detta steg är extremt tidskänsliga; om tidsramen är för kort, för mycket av plasmat / trombin blandningen avlägsnas. Om tidsramen är för lång, koagulation redan skett, vilket ökar risken för att ta bort skivorna tillsammans med den kvarvarande plasma / trombin.
Om mekaniska skador planeras, är det viktigt att använda MEA med en noggrann design. Området där lesionen är avsett måste vara fria från elektroder, trådar och isolering. Annars är el av MEA kommer att vara skadad och därför kan inga inspelningar utföras längre.
En annan avgörande steg avser storleken av lesionen. Det har visats att återansluta två unga skivor efter lesionen tar ungefär två dagar 10 tidigare. För alla experiment tumregeln används att utrymmet betwesv skivorna efter lesionen bör inte vara större än bredden hos MEA spåret (300 | im). En större lesionsstorlek kan resultera i ett längre tidsperspektiv för återanslutning eller om skadan är för stor, ingen återkoppling alls. För att kommentera, avslöjade tidigare experiment som ett första utsläppandet av de två skivor längre bort än 1 mm resulterar i en mycket låg anslutningshastighet.
Innan starten av inspelningarna, en justering av åtminstone 10 minuter till RT, i stället för 37 ° C i inkubatorn, och till den extracellulära lösningen, i stället för den nutrition medium rekommenderas. Noggrann observation av aktivitetsmönstret under dessa initiala minuter säkerställer att de uppmätta data representerar bristningsmönstret av kulturen på lämpligt sätt efter inspelningen påbörjades.
För detektion av aktiviteten, datainsamling och vidareförädling, hemlagad hårdvara (inspelning kammare, anslutningar till förstärkare och förstärkare), program i LabVIEW, C ++ och IgorPro används. Kommersiella MEA uppställningar och andra mjukvarupaket lämpar sig även för dessa operationer. Här är signalerna ses av elektrod amplifierade 1001 gånger, och digitaliseras sedan med en hastighet av 6 kHz.
Den presenterade modellen kan vara ett användbart verktyg för att undersöka propriospinal anslutningar eftersom in vivo, de är svåra att studera utan inblandning av stigande och fallande fiber skrifter. Samtidig odling av två ryggmärgsskivor kan elegant kringgå denna fråga. Kulturerna ger en mikromiljö som kan vara hårt kontrollerad och lättmanipulerade. Å andra sidan, är supraspinala och sinnesintryck naturligtvis saknas. Dessutom representerar förfarandet enligt odlings beredningen en situation av CNS-skada. Gliaceller som astrocyter och mikroglia är kända för att svara på lesioner med ökad proliferation och därför är vävnaden i viss utsträckning omorganiseras. Avseende den presenterade lägetl bildandet av en gliaceller ärr efter att ha utfört mekaniska skador observerades inte. En förklaring kan vara att adaptiva mekanismer för astrocyter redan utlöstes under förberedelsearbetet och att skador på kulturerna inte resultera i en ytterligare svar. Dessutom finns det inga bevis för att involvera myelin tillhörande hämmare, t ex., Nogo-A, i det låga regenereringspotential kulturer skadade vid en hög ålder. Men visade det sig att behandling med fosfodiesteras 4-hämmare Rolipram, startar direkt efter att ha utfört skador på 23 DIV ökar funktionell regenerering mellan skivorna 10. Dessa resultat visar att funktionell återhämtning kan ökas i gamla kulturer. Märkbart, när man räknar antalet axoner korsar lesionsstället, ingen skillnad mellan kulturer skadade vid en ung ålder och kulturer skadade vid en ålder upptäcktes. Dessa fynd tyder på att bristen på axonal regenerering är inte den största anledningen feller förlust av återhämtning efter sena skador i kultur och därför understryka behovet av en modell som gör det möjligt för funktionell analys av förnyelse. Synaptic bildning och synaptisk plasticitet skulle kunna spela en viktig roll i återhämtningsprocessen 10. Dessa mekanismer fått en hel del uppmärksamhet under de senaste åren och det är numera allmänt accepterat att de har en stor inverkan på resultatet efter ryggmärgsskada. Därför kan en modell som ger stabila förutsättningar för att undersöka dessa processer i isolering och i detalj säkert bidra till att få insikt om funktionell förnyelse i ryggmärgen.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |