Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tyde og Imaging Patogenese og snor av Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

Mycobacterium abscessus er en ny patogen som forårsaker et vidt spektrum av kliniske syndromer hos mennesker. Disse inkluderer kutane infeksjoner samt alvorlige kroniske lungeinfeksjoner, for det meste møtt i immunsvikt og pasienter med cystisk fibrose 1,2,3,4. M. abscessus regnes også som en stor raskt voksende mykobakterielle arter som er ansvarlige for nosokomiale og iatrogenic infeksjoner hos mennesker. Dessuten flere siste rapportene fremhevet muligheten for at M. abscessus kan krysse blod-hjerne-barrieren og induserer viktige lesjoner i sentralnervesystemet (CNS) 5,6. Til tross for at en rask dyrker, M. abscessus utstillinger også flere sykdomsfremkallende funksjoner som er relatert til de av Mycobacterium tuberculosis, inkludert evnen til å tie for år innenfor granulomatøs strukturer og å generere caseous lesjoner i lungene 7. Mer alarmerende er den lave sensensitivitet på M. abscessus mot antibiotika, gjengi disse infeksjonene ekstremt vanskelige å behandle fører til en betydelig terapeutisk strykprosent 8,9. Den viktigste trusselen av denne arten er i hovedsak sin iboende motstand mot antibiotika, som er av stor bekymring i offentlige helseinstitusjoner 10 og en kontraindikasjon for lungetransplantasjon 11.

M. abscessus skjermer glatte (S) eller grov (R) koloni morfotyper som fører til forskjellige kliniske utfall. I motsetning til den S-stammen, R bakterier har en tendens til å vokse ende til ende, noe som fører til et tau eller snor-lignende struktur 12,13. Flere uavhengige studier basert på enten mobil eller dyremodeller avslørte hyper-virulens fenotype av R morphotype 14,15. Fra epidemiologiske studier, de mest alvorlige tilfeller av M. abscessus lungeinfeksjoner synes å være assosiert med R-variantene 16 som er den eneste varianten somhar blitt sett å vedvare i mange år i en infisert vert tre. Den morphotype Forskjellen er avhengig av tilstedeværelse (i S) eller tap (i R) av overflate forbundet glycopeptidolipids (GPL) 12. Men på grunn av de iboende begrensninger av de tilgjengelige cellulære / dyremodeller som brukes til å studere M. abscessus infeksjon, vår kunnskap om patofysiologiske hendelsene i de R eller S varianter er fortsatt uklar. Infeksjon av immuno-kompetente mus via intravenøse eller spray ruter fører til forbigående kolonisering, som hindrer bruk av mus for å studere vedvarende infeksjoner og for in vivo resistenstesting 17. Derfor er utviklingen av dyremodeller mottagelig for manipulering av vertsrespons er en stor utfordring. I denne sammenheng har ikke-pattedyr-modeller av infeksjon nylig utviklet, herunder Drosophila melanogaster 18 som har flere fordeler, slik som pris, hastighet og etisk aksept over musemodell. Sebrafisk (Danio rerio) modell for infeksjon har også blitt undersøkt for å visualisere, av ikke-invasiv bildediagnostikk, progresjon og kronologi av M. abscessus infeksjon i et levende dyr 19. Viktigere, et bevis på konseptet ble også etablert for å demonstrere sin egnethet for in vivo antibiotika vurderingene mot M. abscessus 17,20.

Sebrafisk har blitt mye brukt i løpet av de siste to tiårene for å studere samspillet mellom ulike patogener og vertens immunsystemet 21. Den økende suksess med dette alternativet virveldyr modellen baserer seg på store og unike muligheter som motiverte og godkjente bruken for en bedre forståelse av en rekke virus og bakterieinfeksjoner 19,22,23,24,25,26,27,28,29. I motsetning til de fleste andre dyremodeller, sebrafisk embryo er optisk transparent, slik at ikke-invasiv fluorescens bildebehandling 30. Dette HAs ledet til å studere M. abscessus smittet sebrafisk embryo med enestående detaljer, som kulminerte med beskrivelsen av ekstracellulære snor, som representerer et eksempel på bakteriell morfologisk plastisitet. Kordeller representerer en ny mekanisme for undergraving av immunsystemet, og en nøkkelmekanisme fremme patogenese av akutt M. abscessus infeksjon 19.

Denne rapporten beskriver nye verktøy og metoder ved hjelp av sebrafisk embryo å tyde patofysiologiske trekk av M. abscessus smitte og å studere de intime samspillet mellom basiller og det medfødte immunsystemet. Først en detaljert mikroinjeksjon protokoll som omfatter behandling av bakteriepodestoff, embryo forberedelse, og infeksjoner per se, er presentert. Metoder spesielt tilpasset for å vurdere M. abscessus virulens ved å måle ulike parametre, som vert overlevelse og bakteriemengden, blir presentert. Spesiell fokus er gitt på hvordanfor å overvåke, ved et nivå i tid og rom, skjebnen og progresjon av infeksjonen og vertens immunrespons mot M. abscessus bruker videomikroskopi. Videre å undersøke bidrag og rolle makrofager under M. abscessus infeksjon, metoder generere makrofager-utarmet embryoer (ved hjelp av enten genetically- eller kjemisk-baserte tilnærminger) er beskrevet. Til slutt, for å protokoller visualisere de spesifikke interaksjoner med makrofager eller nøytrofile bruker enten fast eller levende embryoer er dokumentert.

Målet med denne rapporten er å stimulere videre studier for å kaste nytt lys inn M. abscessus virulensmekanismer og særlig rolle snor i etableringen av en akutt infeksjon og ukontrollert prosess.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sebrafisk eksperimentelle prosedyrer må være i samsvar med relevante institusjonelle og statlige forskrifter. For denne studien, ble sebrafisk eksperimenter utført ved universitetet i Montpellier, i henhold til EUs retningslinjer for håndtering av forsøksdyr (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) og godkjent under henvisning CEEA-LR-13007.

1. Utarbeidelse av reagenser og Mikroinjeksjon Utstyr

  1. Tilberede fisk vann ved å oppløse 0,06 g Instant Ocean Sea salt i en L destillert vann 31, deretter autoklav å sterilisere (120 ° C i 20 min) og oppbevar ved 28,5 ° C i opptil en måned.
  2. Forbered metylenblått-løsning ved å oppløse 1 g metylenblått i 1 l destillert vann. Legg 300 ul metylenblått løsning i en L fiskevann for å få blå fisk vann, deretter autoklav å sterilisere og oppbevar ved 28,5 ° C i opptil en måned.
    MERK: additipå av metylenblått i fisk vann hindrer muggvekst.
  3. Fremstilling av fosfatbufret saltvann (PBS)
    1. Fremstille en 10 x PBS stamløsningen ved å oppløse 5,696 g Na HPO 2 4, 680 mg KH 2PO 4, 969 mg KCl og 78,894 g NaCl i 1 liter destillert vann, og justere pH til 7,0 med HCl. For å oppnå en X PBS, fortynnes 100 ml av 10 x PBS-oppløsning i 900 ml destillert vann og autoklaven i løpet av 20 minutter ved 120 ° C for å sterilisere.
    2. Legg 0,05% Tween 80 for å få en X PBST og oppbevares ved romtemperatur i opptil ett år.
  4. Forbered Oljesyre Dekstrose Catalase (OADC) anrikning ved oppløsning av 8,5 g NaCl, 50 g bovint serumalbumin, 20 g D-glukose, 40 mg Katalase fra okselever og 0,5 g oljesyre i 1 liter destillert vann, filtrer deretter sterilisere løsningen og lagre den ved 4 ° C i inntil 6 måneder.
  5. Forbered 100 ml etyl-3-aminobenzoat metansulfonsyre (Tricaine) stamoppløsning ved å oppløse 400 mg tricaine pulver i 97,9 ml destillert vann. Legg 2,1 ml av 1 M Tris (pH 9) for å justere pH-verdien på 7,0, og oppløsningen oppbevares ved -20 ° C.
  6. Forbered microcapillary kanyler ved å trekke borsilikatglass kapillærer (1 mm OD X 0,78 mm ID) ved hjelp av en mikropipette avtrekker enhet med følgende innstillinger: Lufttrykk 650; Varm 999; Trekk 50; Velocity 80; Tid 200.
  7. Forbered en 1,5% agar løsning i blå fisk vann og hell 25 ml smeltet agar i 100 mm petriskåler. På toppen av smeltet agar, plasserer hjemmelagde formene for å innprente bestemte kanaler. "V" -formede kanaler er brukt for å posisjons embryoer, mens den "U" -formet anvendes for egg (figur 1) 31. Når stivnet, fjerner nøye forlaget.
    MERK: Dekk agar med blå fisk vann for å unngå dehydrering og oppbevares ved 4 ° C i opptil 2 måneder.

Figur 1 Figur 1. Posisjonering kamre for sebrafisk injeksjoner. (A) U-formede kanaler for egg (venstre panel) og V-formede kanaler for embryoer (høyre panel). Sebrafisk egg / embryo er lagt i kanaler og justert langs samme akse. (B) Vise kamre for mikroskopisk observasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Utarbeidelse og oppbevaring av M. abscessus Inokulum

  1. M. abscessus vekstvilkår
    1. Plate ut M. abscessus fra en -80 ° C glyserol lager på en Middlebrook 7H10 agar inneholdende 10% av OADC og 0,5% glycerol (7H10 OADC) og supplert med det passende antibiotikum avhengig av resistensmarkør som bæres av vektoren som koder for det fluorescerende protein. Inkuber plateneved 30 ° C i 4-5 dager.
    2. Plukke opp en fluorescens-positive mykobakteriell koloni og inokulere 1 ml Middlebrook 7H9 buljong supplert med OADC, 0.2% glyserol, 0.05% Tween 80 (Brook 7H9 OADC / T) med den nødvendige antibiotikum i et 15 ml sterilt plastrør. Inkuber ved 30 ° C i 1 uke uten risting.
      MERK: Tween 80 begrenser klumper og bakteriell aggregering.
    3. Resuspender pre-kulturen erholdt i 2.1.2 i 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T i 150 cm2 vevskulturflasker til en slutt 0,1 OD 600 (svarende til rundt 5,10 7 bakterier / ml) og inkuberes videre ved 30 ° C i 4 dag for å oppnå en eksponentielt voksende kultur (OD 600 = 0,6 til 0,8).
      MERK: For å minimere klumper, spesielt av den grove varianten, bør inkubasjon ikke overstige 5 dager. Både glatte og grove varianter vise en tilsvarende vekst.
  2. Fremstilling av M. abscessus inocula60;
    MERK: På grunn av høy tilbøyelighet til grov M. abscessus til å danne store aggregater og å produsere ledninger, er en spesifikk behandling er nødvendig for å generere homogen og kvantitativt kontrollert inokula før microinjections i embryoene. Denne behandlingen er også anvendes til å glatte bakterier som produserer aggregater, om enn i mindre grad enn den harde belastning.
    1. Avling eksponentielt voksende kulturer fra 150 cm2 vevskulturkolber ved sentrifugering ved 4 000 x g i 15 minutter ved romtemperatur i et 50 ml sterilt plastrør og resuspender pelleten i en bakteriell ml Brook 7H9 OADC / T. Alikvoter 200 mL av bakteriesuspensjoner i 1,5 ml mikrosentrifugerør.
      MERK: Arbeide med små volumer i 1 ml sprøyter er nødvendig for å oppnå svært homogene suspensjoner.
    2. Homogenbakteriesuspensjoner med en 26-G kanyle (15 up-and-down-sekvenser), sonicate tre ganger i 10 sek (med 10 sek pauser mellom hver lydbehandling sekvens) ved hjelp av et vannbad sonikator. Tilsett 1 ml Brook 7H9 OADC / T og vortex kort. Sentrifuger i 3 minutter ved 100 x g.
    3. Nøye samle mykobakterier holdige Supernatantene å unngå klumper og bassenget på homogene suspensjoner i en 50 ml sterilt plastrør.
    4. Sjekk visuelt for tilstedeværelse av eventuelle gjenværende bakterielle aggregater.
      MERK: Dersom aggregater fremdeles er tilstede, fortsette til et ytterligere sentrifugeringstrinn ved 100 xg i 2 min, og samle supernatanten.
    5. Sentrifuger suspensjonen ved 4000 xg i 5 min, resuspender pelleten i 200 pl Brook 7H9 OADC / T og videre til injisering.
    6. Vurdere sluttbakteriekonsentrasjon ved utsåing av seriefortynninger (1 x PBST) på 7H10 OADC agar og telling kolonidannende enheter (CFU) etter 4 dagers inkubering ved 30 ° C. CFU bør bestemmes for hver ny batch.
    7. Forberede frosne Inokula aksjer ved å lagre 5 pl prøver ved -80 & #176; C.
      MERK: CFU vurdering av -80 ° C frosne porsjoner er en forutsetning for å fastslå det nøyaktige antallet levedyktige bakterier som fryse / tining kan påvirke bakteriell levedyktighet pode. Disse frosne inokula er klar til å brukes for etterfølgende injeksjoner. Ettersom alle alikvoter inneholder det samme antall CFU, de tillater injisering av bakterier i en reproduserbar måte fra ett forsøk til et annet.
  3. Inoculum kvalitetskontroll
    MERK: Ziehl-Neelsen farging (som er spesifikk for mykobakterier) kan brukes for å sammenligne kvaliteten av de bakterielle suspensjoner før og etter homogenisering prosedyrer som er beskrevet i 2.2.
    1. Spot og spre ut en dråpe av den homogenis bakteriell suspensjon på en glassplate og la det tørke helt, fikse smøre i minst 30 min på en varm plate satt til 65-70 o C og beis bruker en Ziehl-Neelsen farging protokollen .
    2. Observer bakterieprøve med et mikroskop ved hjelp av en 100X objektiv og sammenligne med en flekk av en ikke-behandlet bakteriell suspensjon (figur 2).

Figur 2
Figur 2. Fremstilling av dispergert M. abscessus inocula. Ziehl-Neelsen farging av R- eller S-varianter dyrkes i medium medium før noen behandling (øvre panel) eller etter behandling (nedre paneler) for å redusere størrelsen og antallet av mykobakterielle aggregater (suksessive trinn av syringing, sonikering og dekantering) . Bakterier ble observert ved bruk av et mikroskop med 100 X APO olje 1,4 NA objektiv). Skala barer:. 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Klarsebrafisk embryoer

  1. Gyting og samle sebrafisk egg
    1. Dagen før spawning, rase voksen sebrafisk ved å plassere 2 hanner og en hunn (vanligvis en 2: 1-forhold tillater optimal gjødsling rate) til en ynglekammer, som består av et eget akvarium med et egg samling kurv 31.
      MERK: Egg samling kurver brukes til å beskytte eggene fra å bli spist av foreldrene og legge til rette egg høsting.
    2. På en HPF, høste egg og bare skikkelig utviklet embryo i en 100 mm petriskål fylt med 25 ml blå fisk vann (maks 100 embryoer per parabol) og holde dem på 28,5 ° C. Non-befruktede egg blir forkastet.
  2. Utarbeidelse av sebrafisk embryoer for injeksjoner
    1. På ca 24 timer etter befruktning (HPF), dechorionate embryoene med fin pinsett i en 100 mm petriskål og holde dem på 28,5 ° C.
    2. Samle 30-48 HPF embryoer ved hjelp av en pipette og overføre dem til en "V" -formet posisjonering kammer fylt med 25 ml av fisk vann som inneholder 270 mg / L Tricaine.Lå embryoene riktig i de kanaler som bruker en hjemmelaget microloader tips verktøy (hjemmelaget klippet micro loader tip) optimalisert for en enklere mikro-manipulasjon.
      MERK: Orientere dorsalsiden nedover for intravenøse injeksjoner i kaudalvenen eller dorsalsiden oppover for halen muskel injeksjoner.

4. Micro-injeksjon Prosedyre

MERK: mikroinjeksjonsprosedyren for M. abscessus er lik den som tidligere beskrevet for M. marinum injeksjoner 32. For å vurdere kronologien i M. abscessus infeksjon (overlevelse, bakterielle belastning, kinetisk og karakteristika for infeksjon), er injeksjon i halevenen til 30 HPF embryoer foretrukket. Å visual rekruttering av immunceller, er injeksjoner gjort i lokaliserte nettsteder som er i hale muskler i 48 HPF embryo.

  1. Fortynn mycobakterielt inokulum i en X PBST (avhengig av antall CFU tiladministreres som bestemt i trinn 2.2.6), inneholdende 10% rød fenol for å kontrollere riktig injeksjon.
  2. Legg i en microcapillary kanyle med 5-10 mL av bakterieinokulum bruker en microloader tips, koble mikroinjeksjon nålen inn innehaveren av den tredimensjonale micromanipulator koblet til injektoren og bryte av toppen av nålen med fine pinsett for å oppnå en åpningsdiameter på 5-10 um.
  3. Kalibrere injeksjonsvolum ved å justere mikroinjeksjon trykk (20-50 hPa) og tid (0,2 sek).
    NB: Det nødvendige injeksjonsvolumet er kalibrert ved visuell bestemmelse av diameteren av en dråpe støtt ut i eggeplomme av et embryo.
  4. For kaudalvenen injeksjon, plasserer embryo med ventral siden vendt nålen (som beskrevet i avsnitt 3.2.2) og plasser nålespissen nær urogenitale åpning, målretting kaudalvenen, og trykk forsiktig tuppen av nålen inn i embryo inntil det bare skjærer caudal vene regionen. Levere ønsket volum av bakteriell forberedelse, vanligvis 1-3 nl inneholder rundt 100 CFU / nl.
  5. For intramuskulær injeksjon, plasserer embryo med ryggsiden mot nålen (som i avsnitt 3.2.2), plasserer nålen over en somitt og injisere et lite volum (en nl) inokulum.
    MERK: Som for kaudalvenen injeksjoner, intramuskulære infeksjoner er også utfordrende å utføre. Hensyn må tas for å unngå en overbelastning som kan skade omkringliggende vev.
  6. Ved slutten av injeksjonsprosedyren, kontrollere størrelsen av inokulum ved å injisere det samme volum av bakteriesuspensjonen i en dråpe steril PBST, etterfulgt av utsåing på 7H10 OADC og telling av CFU. Rundt 100 embryoer kan injiseres med en nål.
    MERK: Fordi grov M. abscessus kan fortsette å danne aggregater i nålen, injeksjoner må skje umiddelbart etter fremstilling av podestoff.
  7. Overfør den infiserte fish individuelt i 24-brønners plater inneholdende 2 ml / brønn fisk vann og inkuber ved 28,5 ° C. Embryoer injisert med 1-3 nl 1 X PBST kan brukes som kontroller.
  8. Riktig infeksjon av fluorescerende bakterier i embryoer blir overvåket ved bruk av et fluorescens mikroskop.

5. generasjon Makrofage-utarmet Embryoet

MERK: Selektiv utarming av makrofager fra vev blir brukt til å undersøke deres bidrag og rolle under infeksjon. For å visualisere skikkelig uttømming av makrofager, anbefales det å bruke en transgen linje med fluorescerende makrofager, hvor mCherry er spesifikt uttrykt under kontroll av makrofagen bestemt MPEG1 promoter 19.

  1. Lipo-klodronats-basert prosedyre
    MERK: lipo-klodronats prosedyre tillater en selektiv utarming av makrofager fra vev (men ingen nøytrofile) 19. Denne forbindelsen gjør verken endre overlevelse av embryo eller affect integriteten av bakterier. En detaljert protokoll for å fremstille liposom-innkapslet klodronat er tidligere 33 blitt rapportert.
    1. Ved 24 HPF, dechorionate embryoene, og overføre dem til et "V" -formet injeksjon tallerken fylt med fisk vann tilsatt for å opprettholde Tricaine embryoene i en bedøvet tilstand inntil slutten av injeksjonsprosedyren, som beskrevet i 3.2.2. Orientere den dorsale side nedover.
    2. Legg i en microcapillary kanyle med liposominnkapslet klodronats (lipo-klodronat), koble mikroinjeksjon nålen inn innehaveren av den tredimensjonale micromanipulator og bryte av toppen av nålen med fine pinsett for å få et tips åpning diameter på 10 mikrometer.
    3. For å kalibrere injeksjonsvolum, justere mikroinjeksjon trykket til 20 hPa og injeksjon tid til 0,2 sek. Plasser nålespissen nær urogenitale åpning, målretting kaudalvenen, og trykk forsiktig tuppen av nålen inn iembryo inntil den bare skjærer halevenen regionen og levere det ønskede volum av løsningen (2-3 nl, 3 ganger).
      MERK: lipo-klodronats suspensjon er veldig klissete og bør vortexet før injeksjon for å unngå blokkering karsystemet og drap av embryo. Det er viktig å fortsette til flere suksessive injeksjoner av små volumer.
    4. Overfør embryoene i 100 mm petriskåler med fisk vann og holde dem på 28,5 ° C til infeksjon.
    5. Kontrollere riktig uttømming av makrofager med fluorescerende mikroskopi.
      MERK: Komplett makrofag uttømming er effektivt for 4 dager etter lipo-clodoronate administrasjon.
  2. Morfolino--basert prosedyre
    1. Dagen før gyting, rase voksen sebrafisk ved å plassere 2 hanner og en hunn adskilt av en plastbarriere i en ynglekammeret.
    2. Neste dag, ≈ 30 min etter at lyset slås på i sebrafisk anlegget, fjerne barrieren skillemenn og kvinner. Vent i ca 20 min etter begynnelsen av gyte å optimalisere befruktning rate. Høste egg og forsinke deres utvikling ved å overføre dem i en 100 mm petriskål fylt med kaldt blue fish vann (4 ° C).
      MERK: Kontroll av gyte er avgjørende for de morpholinos baserte eksperimenter. Morpholinos bare kan injiseres i eggene opp til fire cellestadiet.
    3. Samle eggene ved hjelp av en pipette og avsette egg ned i "U" -formet sprøytekammer fylt med kaldt vann og blå fisk blokkere egg i kanalene ved hjelp av et hjemmelaget microloader spiss verktøyet.
    4. Klargjør pu.1 morpholino oppløsning inneholdende 10% av rød fenol, som tidligere beskrevet 19. Legg i en microcapillary kanyle med morfolino- forberedelse og koble mikroinjeksjon nålen inn innehaveren av den tredimensjonale micromanipulator, deretter bryte av tuppen av nålen med fine pinsett til obtaina tips åpning diameter på 5-10 mikrometer.
    5. For å kalibrere injeksjonsvolum, justere mikroinjeksjon press til 20-50 hPa og injeksjon tid til 0,2 sek. Plasser nålespissen nær egg og trykk forsiktig tuppen av nålen gjennom chorion inn i egget og levere morpholino løsning volum ønskelig, typisk 3-5 nl.
    6. Etter mikro-injeksjon, overføre eggene i en 100 mm petriskål i fisk vann og inkuberes ved 28,5 ° C till infeksjonen prosedyren starter.
    7. Analyser riktig (komplett) utarming av makrofager i pu.1 morphants av fluorescerende mikroskopi på 30 til 48 HPF..
      MERK: Avhengig av konsentrasjonen injisert, kan p U.1 morpholinos også påvirke antall tidlige nøytrofile. For å bekrefte riktig uttømming av makrofager uten å endre antall nøytrofile, anbefales det å bruke en dobbel transgen sebrafisk tråd med fluorescerende makrofager og nøytrofile (med GFPuttrykk spesielt drevet av mpx promoter) 19.

6. Bakteriell Burden Kvantifisering

  1. Fastsettelse av CFU opplisting
    1. Ved ønsket tidspunkt, samler grupper av infiserte embryo (5 per forhold) i 1,5 ml mikrosentrifugerør (1 embryo / rør), cryo-bedøve embryoene ved inkubasjon på is i 10 min og avlive ved hjelp av en overdose av Tricaine (300- 500 mg / L)
    2. Vask embryoene med sterilt vann to ganger, og utlevere dem i et nytt rør, lyse hver embryo med 2% Triton X-100 fortynnet i PBST en X ved anvendelse av en 26 G-nål og homogenisere suspensjonen inntil fullstendig lysis. Sentrifuger suspensjonen og resuspender pelleten i en X PBST med 0,05% Tween 80. Serielle fortynninger av homogenatet blir sådd ut på Middlebrook 7H10 OADC og supplert med BBL MGIT PANTA, som anbefalt av leverandøren.
      MERK: M. abscessus å være mer utsatt for NaOH behandlingert enn M. marinum, dekontaminering av fiskelysatene uten å påvirke M. abscessus vekst kan lykkes oppnådd ved hjelp av BBL MGIT PANTA antibiotika cocktail.
    3. Platene inkuberes i 4 dager ved 30 ° C og telle koloniene.
  2. Fastsettelse av fluorescens Pixel Count (FPC) målinger i levende embryoer
    MERK: For å bestemme bakterie laster via fluorescensemisjonsmaksimum, er seriebilder av infiserte embryoer kjøpt og fluorescens intensitet målt ved FPC (identifisering av bakterier ved partikkel analyse) ved hjelp av en hjemmelaget makro utviklet for ImageJ freeware. En partikkel analyse krever en binær svart-hvitt bilde som er avhengig av en terskel rekkevidde som gjør det mulig å skille ut den fluorescerende signal om interesse fra bakgrunnen.
    1. På ønsket tidspunkt, tricain-bedøve infiserte embryoer (5-10 per tilstand) i 35 mm petriskåler som beskrevet i 3.2.2.
    2. Fjerne vann og submerge embryoene og hele skåloverflaten med 1% lavt smeltepunkt agarose i fiskevann, og jevn sideveis embryoene. Dekk størknet agarose med fisk vann som inneholder Tricaine.
    3. Tilegne fluorescens bilder av hele embryo ved hjelp av en epifluorescence mikroskop med en 10 X objektiv.
      MERK: fluorescens bilde oppkjøpet er et kritisk punkt av FPC målinger prosedyren. Det er viktig å bruke en kalibrert monitor med en fargekalibrering probe. Justering av optimale eksponeringstiden for å få en minimal bakgrunns under innhenting hindrer metning av signalet. Bildene må være i en 8-bits tiff-format. Identiske innstillinger holdes under hele forsøket for kvantitative formål.
    4. Fjern forsiktig agarosen fra embryoene med en hjemmelaget microloader tips verktøyet. Disse embryoene kan brukes for senere analyser om nødvendig. Forut for kvantifisering av den bakterielle belastningen skal hvert bilde blir kvalitetssikret. Til ennalyze bildene og konvertere fluorescens intensitet inn FPC per fisk, åpner ImageJ freeware.
      MERK: FPC verdi reflekterer bakteriemengden som vist tidligere bruker M. marinum 34.
    5. Bestemme den nødvendige terskel for bildeanalyse ved anvendelse av et bilde av en frisk embryo (flere kontrollembryoer kan brukes for å oppnå en gjennomsnittlig terskel). Gå til Image → Juster → Threshold og deretter flytte den nederste glidebryteren i terskelen vinduet til høyre til bakgrunnen blir helt svart (dvs. å få en bakgrunn bør være null). Spill den tilsvarende verdi.
    6. Innenfor Bilde J, åpner FPC makro (tilleggs fil) og følg instruksjonene: finne mappen med bilder som skal måles og angi terskelen som tidligere bestemt og klikk på "OK".
      MERK: Makro trekker bakgrunnen automatisk. En terskel blir så påført. Fluorescerende signaler er identifisertfisert etter partikkelanalyse.
    7. Kopier og lim inn data fra sammendraget vinduet til ønsket programvare for dataanalyse.
      MERK: I motsetning til CFU besluttsomhet metoden, er den FPC metoden ikke-invasiv og tillater gjenbruk embryoene for senere analyser, og enda viktigere, overvåking dynamikken / kinetikk av bakteriemengden på individuell basis. Det derfor gjør det mulig å betydelig redusere antall dyr, i samråd med etiske regler.

7. Imaging M. abscessus- infiserte Embryoet

  1. Live-avbildning av M. abscessus infeksjon
    1. Mount Tricaine-bedøvet embryoer (se 3.2.2) i 1% agarose med lavt smeltepunkt i en 35 mm petriskål før epifluorescens mikros observasjoner. Bruk en glassbunn parabolen for invertert konfokalmikroskopi eller i en enkelt hulrom depresjon lysbilde for stående konfokalmikroskopi. Orientere embryoet til ønsket stilling og dekseletstørknet agarose med fisk vann som inneholder Tricaine.
    2. Bruk en epifluorescence mikroskop med en 10 X objektiv for sekvensielle fluorescens oppkjøps- og transmisjons bilder av hele embryo. Alternativt kan du bruke en konfokal mikroskop med 40X eller 63X mål å visualisere aktiviteten til immunceller etter en infeksjon.
  2. Imaging fast M. abscessus smittet embryoer
    1. Avlive embryoene som beskrevet i 6.1.1 og overføre dem til 1,5 ml mikro-sentrifugerør og fikse embryoene i 4% paraformaldehyde i en X PBST for 2 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C. Fjern paraformaldehyd ved vasking av embryoene to ganger med 1 X PBST i 10 min.
      MERK: For å bevare fluorescens, må faste embryoer beskyttes mot lys.
    2. For å bevare integriteten av vev og fluorescens, er embryo inkuberes i suksessivt økende glycerol konsentrasjons oppløsninger (10, 20, 30, 40 og 50% fortynnet i en X PBST), for10 min per tilstand.
      MERK: Fast embryo kan lagres i flere måneder i 50% glyserol ved 4 ° C.
    3. Lå embryoet innleiret i 50% glycerol i en visnings kammer (figur 1B) 31.
    4. Bilde ved hjelp 40X eller 63X mål på et konfokal mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Selv om ulike anatomiske områder kan injiseres 32, er kaudalvenen injeksjoner ofte brukes til å generere systemisk infeksjon for senere analyser inkludert overlevelse eksperimenter, bakteriemengden besluttsomhet, fagocytose aktivitet eller ledningen formasjon. Injeksjoner i halen musklene brukes til å vurdere rekruttering av makrofager på injeksjonsstedet (figur 3A). Å undersøke og sammenligne virulens for R og S varianter av M. abscessus, blir fluorescerende bakteriesuspensjoner injisert i halevenen til 30 HPF embryoer (figur 3a) 19. I motsetning til den S-varianten, induserer R morphotype en mer robust og dødelig infeksjon i sebrafisk embryoer (figur 3B), karakterisert ved den raske utviklingen av bakterielle abscesser i sentralnervesystemet (CNS) (figur 3C). Systemiske injeksjoner med både R og S varianter føre til CNS infeksjoner og forskjell ide patologi og virulens fenotyper kan kvantifiseres enten ved fluorescens mikroskopi observasjon (Figur 3C), ved opplisting CFU per fisk (Figur 3D) eller ved å bestemme FPC av ervervede bilder (Figur 3E). Viktigere, CFU og FPC besluttsomhet er korrelert og peke ut til større bakterie belastninger for R belastning enn S belastningen på 3 og 5 dpi. Samlet viser disse resultater sterkt støtte sebrafisk som et relevant og ikke-invasiv modell av smitte for å studere den kronologisk av infeksjonen prosessen.

Kanskje en av de mest spektakulære funksjoner ble avslørt av video-mikroskopi som gjør det mulig å visualisere serpentin ledninger innen CNS embryoer infisert med R-varianten (figur 4). Takket være den optiske transparens av embryoene, kan den kinetiske av R-ledningen dannelse overvåkes og avbildes på en ikke-invasiv måte, som illustrerer den høye tilbøyelighet til R varianten å replikere extracellularly. Dette ukontrollert replikering hastighet, i kombinasjon med cellulær / ødeleggelse av vev fører til hurtig utvikling av svulster, og til slutt larve død.

Makrofager er kjent for å spille en viktig rolle under mykobakteriell infeksjon, og spesielt ved kjøring i 35 dannelse av arrvev. To komplementære strategier kan anvendes for å studere M. abscessus vekst / virulens i makro utarmet embryo: den lipo-clodronate- og morfolino baserte prosedyrer (figur 5A). Infeksjon av makro utarmet embryoer med R varianten fører til en massiv økning i bakterie belastninger og ledningen produksjon som avslørt av video-mikroskopi (Figur 5B), som fører til ekstremt rask død (100% døde embryoer på tre dpi; figur 5C) . Dette indikerer klart at makrofager er pålagt å kontrollere M. abscessus infeksjon.

For ytterligere å undersøke rollen til makrofagerunder infeksjon, bestemte transgene embryoer skjuler røde fluorescerende makrofager (MPEG1: mCherry) kan brukes 19. Injeksjon av M. abscessus uttrykker Wasabi i halemuskelen eller i halevenen induserer en markert rekruttering av myeloide celler, hovedsakelig makrofager, i stedet for infeksjon. Dette rekruttering fører til effektiv fagocytose av enkelte bakterier (figur 6A-6B). Til tross for tilstedeværelsen av makrofager, avslører konfokal mikroskopi fremkomsten av store bakterielle ledninger som makrofager ikke kan phagocytize (figur 6C). Samlet utgjør disse funnene markere en ny mekanisme for immununndragelser basert på rollen som snor i å forebygge mycobacterial fagocytose.

Figur 3
Figur 3. M. abscessus infeksjon i sebrafisk embryoer. (A) (Top panel) Intravenøs infeksjon utføres ved å injisere fluorescerende M. abscessus (vist i hvitt) i halevenen (pil 1), posterior til den urogenitale åpningen, i 30 HPF embryoer. (Nedre panel) intramuskulær infeksjon utføres ved å injisere fluorescerende mykobakterier (vist i hvitt) i halemuskelen over en somitt (pil 2), i 48 HPF embryoer. (BE) 30 HPF embryoer intravenøst ​​infisert med M. tdTomato- abscessus (R- og S-varianter). (B) Overlevelseskurver av embryoer infisert med ≈ 300 CFU enten R- eller S-varianter eller PBS injisert kontroller (n = 20). Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist. (C) Spatiotemporal visualisering av enten R eller S variant uttrykker tdTomato (hvit) på ulike tider påpeker post-infeksjon utført av fluorescens levende avbildning. For hver stamme, er en representant fluorescens og overføring overlay av hele infiserte embryoer sho wn. De samme embryoer ble fotografert ved 3 og 5 dpi. (DE) Bakteriegods i embryoer som er infisert med enten R- eller S-varianter (≈ 200 CFU) bestemt ved CFU telling (D) eller FPC-målinger (E). (D) CFU fra lysat av individuelle embryo på ulike tidspunkter etter infeksjon bestemmes av platekledning på Middle 7H10 OADC supplert med BBL MGIT PANTA. Resultatene er uttrykt som logaritmisk ± SD (vannrette streker) CFU per embryo fra tre uavhengige forsøk (n = 5). (E) FPC målinger fra individuelle levende embryoer ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon basert på partikkel analyse ved hjelp ImageJ. Resultater er uttrykt som midlere log ± SD (horisontale stenger) FPC per embryo fra tre uavhengige eksperimenter (n = 5). Alle bilder ble oppnådd med en epifluorescens mikroskop utstyrt med et digitalt fargekamera. t = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. In vivo kordeller av R-variant. 30 HPF embryoer infisert intravenøst ​​med R variant av M. abscessus og avbildes ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon for å visualisere utviklingen av ledningen formasjonen. Den røde pilen er brukt som et fast referansepunkt for å følge spatiotemporal utviklingen av ledningen. DIC bilder av en del av restinneholdende den voksende serpentin ledningen er innrammet (mikroskop utstyrt med et fargekamera). Skala barer:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

0 / 53130fig5.jpg "/>
Figur 5. Nedbryting av makrofager fører til økt ledningen spredning. (A) Embryoet er oppbrukt bruker lipo-klodronatet-basert prosedyre eller morfolino--basert prosedyre. (Top panel) klodronats-innkapslet liposomer (lipo-klodronats) injiseres intravenøst ​​i 24 HPF Tg (MPEG1: mCherry) embryoer. Innenfor sirkulasjon, er lipo-klodronats raskt oppslukt av makrofager som gjennomgår påfølgende apoptose. (Venstre nedre panel) Injeksjon av morpholino forberedelse til knock-down uttrykk for pu.1 genet inn befruktet Tg (MPEG1: mCherry) sebrafisk egg. (Høyre-down panel) Riktig uttømming av makrofager i embryoer blir sjekket av fluorescens mikroskopi (BC) 30 HPF makrofag holdig (+) eller makrofattig. (-) Embryoer (etter lipo-klodronats behandling) er smittet med M. abscessus R uttrykker tdTomato (vist i hvitt). (B) (C) Overlevelses kurver av makro inneholder eller makrofattig embryoer infisert med ≈300 CFU M. abscessus R (n = 20). Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Alle bildene ble kjøpt med et mikroskop koblet til en fargekamera. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Behavior av makrofager i embryoer infiserte enten lokalt eller systemisk med M. abscessus (A) 48 HPF Tg (MPEG1: mCherry). sebrafisk embryo er smittet intramuskulært med Wasabi-uttrykke M. abscessus R. Levende imaging ved hjelp av et konfokalt mikroskop for å visualisere rekrutterte makrofager phagocytizing individuelle mykobakterier (i minutter etter infeksjon, MPI). Maksimal intensitet projeksjon viser en intens rekruttering av makrofager (røde) til injeksjonsstedet (konfokalmikroskop med 40X APO vann 0,8 NA objektiv). Skala: 20 mikrometer (BC) 48 HPF Tg (MPEG1: mCherry). Embryoer intravenøst ​​smittet med M. abscessus R uttrykker Wasabi ble fikset og avbildes ved konfokalmikroskopi (40X) ved 4 HPI (B) og 3 dpi (C). (B) Maksimal intensitet projeksjon av makrofag (rød) eller andre myeloide celler, formodentlig nøytrofiler (piler), som inneholder isolerte mykobakterier (grønt) nær injeksjonsstedet (konfokalmikroskop med 63X APO olje 1,33 NA objektiv). Scale bar: 10 mikrometer (C) Maksimal intensitet projeksjon som viser en makrofag (rød) klarer å phagocytize en snor (grønn) (konfokalmikroskop med 63X APO olje 1,33 NA objektiv)..Skala:. 5 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sebrafisk har nylig dukket opp som en utmerket virveldyr modellsystem for å studere dynamikken i bakterieinfeksjon ved hjelp av bredt felt og confocal bildebehandling i sanntid 36. Kombinasjonen av dispergert mykobakterielle suspensjoner (protokoll 2.2) sammen med mikroinjeksjonsmetoder (protokoll 4) tillater reproduserbare systemiske infeksjoner, og etterfølgende overvåking og visualisering av progresjon av infeksjon med et spesielt fokus på de bakterielle interaksjoner med vertsmakrofager. Virulens av M. abscessus in vivo kan undersøkes takket være bruken av villtype gylden sebrafisk 37. Å studere samspillet mellom M. abscessus og vert myeloide celler, kan flere transgene sebrafisk linjer brukes som Tg (MPEG1: mCherry) for å visualisere makrofager 19. Andre transgene reporter linjer som den som Tg (MPX: GFP) 38 eller Tg (lyz: DsRed) 39 wed enten grønn røde neutrofiler, henholdsvis, kan også brukes til å adressere den spesifikke rollen til disse granulocytter som reaksjon på infeksjon.

M. abscessus, og spesielt R-variant, oppviser en naturlig tilbøyelighet til å danne massive bakterielle aggregater 19, og dermed hindrer reproduserbar mikro-injeksjon. Dessuten utelukker det faktum at R-variantformer mye større klumper enn den S-varianten også potensialet sammenligning av virulens fenotyper for de to isogene varianter. Protokollen er beskrevet i kapittel 2 kan skaffe homogen og spredt M. abscessus suspensjoner for mikro-injeksjon i embryoer. Dette preparat kan anvendes til andre mykobakterielle arter eller mutant-stammer som viser overdreven aggregerende egenskaper. Siden sonikeringstrinn kan endre ytterste mycobakteriell celleveggen lag, bør man sørge for å vurdere effekten av denne fysiske behandling på bakteriell levedyktighet for eACH ny stamme.

Bestemmelse av bakterielle byrder avhengig rutinemessig på CFU telling etter plating lyserte embryoer på selektiv agar medium ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon, som beskrevet i protokollen 6,1. Denne fremgangsmåte omfatter flere begrensninger: siden dyr avlives, kan hver embryo (eller gruppe av embryoer) benyttes for bestemmelse av et enkelt tidspunkt. I tillegg er denne fremgangsmåten unøyaktig på grunn av en stor andel av bakterier som er drept og / eller går tapt under etterfølgende lysis, serielle fortynninger, eller hovedsakelig av klumper. Telle CFU er også en arbeidskrevende oppgave. Som et alternativ kan 6,2-protokollen beskriver en effektiv metode for å kvantifisere M. abscessus byrde som inkluderer begrensede håndteringsmåten, basert på analyse av fluorescerende bilder av infiserte embryoer med pixel kvantifisering, som opprinnelig utviklet for M. marinum 40,41. Denne FPC metode basert på partikkelanalyse, viser en god korrelasjon with de CFU tellinger. På samme måte, ved å kombinere fluorescens mikroskopi og kvantifisering, relative endringer i medfødte immuncelleantall pr embryo kan kvantifiseres ved bildeanalyse ved hjelp av egnede transgene linjer.

Sebrafisk embryo kan brukes for å vurdere betydningen av immunceller i løpet av infeksjon og makrofag-uttømming ble funnet å påvirke overlevelsen vert som respons på M. abscessus infeksjon. Spesifikk makrofag uttømming effektivt kan genereres ved hjelp av lipo-klodronat-basert prosedyre (protokoll 5,1) eller morfolino-basert prosedyre (protokoll 5,2). Likevel, siden nærværet av makrofager er avgjørende for etablering og opprettholdelse av det vaskulære system og for korrekt embryoutvikling, er det anbefalt å ablate makrofag-produksjon ved 24 HPF ved hjelp av lipo-klodronat.

Sebrafisk embryo ser ut som en unik modell for å studere M. abscessus infeksjoner og rollen extracellular snor som et immunsystem undergraving strategi. Hvis determinants kontrollerende snor i M. abscessus kan identifiseres, kan de føre til utvikling av innovative terapeutiske alternativer. Knytte bruken av sebrafisk sammen med innovative høy gjennomstrømning teknologier 42 åpner også felt til medisiner og nye farmakologiske tilnærminger mot denne resistent patogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for K. Kissa for nyttige diskusjoner og for å gi lipo-klodronat og L. Ramakrishnan for den generøse gaven av pTEC27 og pTEC15 som tillater uttrykk for tdTomato og Wasabi, henholdsvis. Dette arbeidet er en del av prosjektene i den franske National Research Agency (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 og DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) og Det europeiske fellesskap sjuende rammeprogram (FP7-PEOPLE-2011-ITN) etter tilskuddsavtalen no. PITN-GA-2011-289209 for Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma. Vi ønsker også å takke Foreningen Gregory Lemarchal og Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) for å finansiere CM Dupont.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

Infeksjon , Sebrafisk infeksjon patogenese medfødt immunitet makrofag mikro-injeksjon fluorescens mikroskopi live bildebehandling snor.
Tyde og Imaging Patogenese og snor av<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; I sebrafisk embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet,… More

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter