Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

Mycobacterium abscessus insanlarda klinik sendromların çok geniş bir yelpaze neden olan bir yükselen bir patojendir. Bunlar deri enfeksiyonları gibi ciddi kronik akciğer enfeksiyonları, çoğunlukla bağışıklık sistemi baskılanmış ve kistik fibroz hastalarında 1,2,3,4 karşılaşılan sayılabilir. M. abscessus insanlarda da, hastane ve iatrojenik enfeksiyonlara yol açan önemli bir hızla büyüyen bir mikrobakteriyel tür olarak kabul edilir. Dahası, birçok yeni raporlar imkanı vurgulanan M. abscessus, kan-beyin bariyerini geçer ve merkezi sinir sistemi (MSS) 5,6 önemli lezyonlar tetikleyebilir. Hızlı bir yetiştiriciye, M. olmasına rağmen Ayrıca abscessus sergiler granülomatöz yapılar içinde yıllarca sessiz kalmayı ve akciğerlerde 7 kazeöz lezyonlar oluşturmak için kapasitesi de dahil olmak Mycobacterium tuberculosis olanlar ilişkili birkaç patojenik özellikleri. Daha endişe verici düşük sen olduğunuM. duyarlılık antibiyotiklere abscessus, önemli terapötik başarısızlık oranı 8,9 giden tedavisi son derece zordur bu enfeksiyonların render. Bu türün önemli bir tehdit esas önemli bir halk sağlığı kurumlarına 10 kaygı ve akciğer nakli 11 kontrendike biridir antibiyotik olan içsel direnç olduğunu.

M. abscessus görüntüler farklı klinik sonuçlara yol düz (S) veya pürüzlü (R) koloni morfotipler. S suşu aksine, R bakteriler bir ip ya da kordon benzeri yapı 12,13 giden, uçtan uca büyümesi için bir eğilim vardır. Hücresel veya hayvan ya modellere dayalı birkaç bağımsız çalışmalar R hiper-virülans fenotip 14,15 Morfotip saptandı. Epidemiyolojik çalışmaların, M. en şiddetli vakalarından abscessus akciğer enfeksiyonları R ile ilişkili olduğu görünen tek varyant olan 16 varyantları olduğunuenfekte olmuş bir konukçu 3 yıl için kalıcı olduğu görülmüştür. Morfotip farkı yüzeyi ile ilişkili glycopeptidolipids (GPL) 12 (S) varlığında veya (R) zarara dayanır. Ancak, mevcut hücresel / hayvan modellerinin doğal sınırlamalar nedeniyle M. incelemek için kullanılan abscessus enfeksiyon, R veya S varyantları patofizyolojik olaylarla ilgili bilgimiz belirsiz kalır. Intravenöz veya aerosol yollardan bağışıklık yetkili farelerin Enfeksiyon kalıcı enfeksiyonları ve in vivo ilaç duyarlılık testi 17 için çalışma farelerin kullanımını engelleyen, geçici kolonizasyon yol açar. Bu nedenle, konak yanıtının manipülasyon için uygun hayvan modelleri geliştirmek önemli bir sorundur. Bu bağlamda, enfeksiyonun memeli olmayan model, bu gibi maliyet, hız ve etik kabul edilebilirliği o gibi birçok avantaj sunar 18 melanogaster Drosophila da dahil olmak üzere, son zamanlarda geliştirilmiştirfare modelini VER. Enfeksiyon Zebra balığı (Danio rerio) modeli aynı zamanda non-invaziv görüntüleme, M. ilerlemesi ve kronolojisi tarafından, görselleştirmek için araştırılmaktadır Canlı bir hayvanda 19 abscessus enfeksiyon. Önemlisi, kavramın bir kanıtı da M. karşı in vivo antibiyotik değerlendirmeleri için uygunluğu göstermek için kurulmuştur 17,20 abscessus.

Zebra balığı çok çeşitli patojenler ve konak bağışıklık sistemi 21 arasındaki etkileşimleri incelemek için son yirmi yılda kullanılmaktadır. Bu alternatif omurgalı modelin artan başarısı motive ve çok sayıda viral ve bakteriyel enfeksiyonlar 19,22,23,24,25,26,27,28,29 daha iyi anlaşılması için kullanılmasını valide büyük ve eşsiz fırsatlar dayanır. Diğer birçok hayvan modellerinde farklı olarak, zebra balığı embriyolar invazif olmayan flüoresan görüntüleme 30. Bu ha sağlayan optik olarak saydamdır,M. çalışmaya yol açtı s abscessus bakteriyel morfolojik plastisite bir örnek temsil dışı Cording açıklaması ile sonuçlanan, görülmemiş detaylarla zebrafish embriyolar bulaşmış. Cording bağışıklık sisteminin devirmenin yeni bir mekanizma ve akut M. patogenezi teşvik eden bir kilit mekanizmasını temsil eder abscessus enfeksiyon 19.

Bu rapor M. patofizyolojik özellikleri deşifre Zebra balığı embriyo kullanarak yeni araçlar ve yöntemleri açıklar enfeksiyon abscessus ve basil ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasında yakın etkileşimleri çalışmak için. İlk olarak, haddi zatında bakteriyel inokulum, embriyo hazırlanması ve enfeksiyon işlenmesini içeren detaylı mikroenjeksiyon protokolü sunulmaktadır. Yöntem özellikle M. değerlendirmek üzere uyarlanmış Böyle ev sahibi hayatta kalma ve bakteriyel yükü gibi çeşitli parametreler, ölçerek abscessus virulans sunulmuştur. Özel odak nasıl verilirBir zamanmekansal düzeyde, kader ve ilerlemesini enfeksiyon ve M. konak immün yanıtı izlemek için Video mikroskopi kullanılarak abscessus. Dahası, M. sırasında katkı ve makrofajlar rolünü araştırmak için enfeksiyon abscessus, yöntem (Genetik olarak ya da kimyasal olarak tabanlı ya da yaklaşımlar kullanılarak) makrofajlar tükenmiş embriyolar açıklanmıştır üretir. Son olarak, protokoller sabit veya canlı embriyolar kullanarak makrofajlar veya nötrofiller belgelenmiştir belirli etkileşimleri görselleştirmek için.

Bu raporun amacı, M. yeni ışık tutacak ileri çalışmalar teşvik etmektir abscessus virülans mekanizmaları ve akut ve kontrolsüz enfeksiyon sürecinin kuruluşunda Cording özellikle rolü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebra balığı deneysel esaslar ilgili kurum ve devlet düzenlemelere uymak zorundadır. Mevcut çalışmada, zebrabalıkları deneyler laboratuar hayvanlarının kullanımı için, Avrupa Birliği kurallarına göre, Üniversite Montpellier (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) yapıldı ve referansı kapsamında onaylanan CEEA-LR-13007.

Reaktifler ve Mikroenjeksiyon Ekipman 1. Hazırlık

  1. Sonra yukarı 1 ay 28.5 ° C ve mağaza (20 dakika boyunca 120 ° C) sterilize otoklav, 1 L distile su 31 0.06 g Instant Ocean Deniz tuzu çözerek balık suyu hazırlayın.
  2. 1 L damıtılmış su içinde metilen mavisi 1 g çözülmesiyle metilen mavisi çözeltisi hazırlayın. Sonra yukarı 1 ay 28.5 ° C'de sterilize ve saklamak için otoklav, mavi balık suyu elde etmek için 1 L balık su içinde metilen mavisi çözeltisi 300 ul ekleyin.
    NOT: additiBalık suda metilen mavisi kalıp büyümesini engeller.
  3. Fosfat Tamponlu Salin hazırlanması (PBS)
    1. 5,696 g Na 2 HPO 4, 680 mg KH 2 PO 4, 969 mg KCl ve 78,894 g NaCI, 1 L damıtılmış suda eritilmesi ile 10 x PBS stok çözelti hazırlayın ve HCI ile 7.0'a pH ayarlamak. , 1 X PBS elde sterilize etmek için 120 ° C de 20 dakika boyunca su ve otoklav damıtılmış 900 ml 10 x PBS çözeltisi 100 ml seyreltik için.
    2. Kadar 1 yıl süreyle oda sıcaklığında 1 X PBST elde etmek için% 0.05 Tween 80 ekleyin ve saklayın.
  4. Daha sonra solüsyon sterilize filtre sığır karaciğer ve 1 L damıtılmış su içinde oleik asit, 0.5 g 8.5 g NaCl, 50 g sığır serum albumini, 20 g D-glikoz, 40 mg Katalaz çözülmesiyle oleik asit Dekstroz Katalaz (OADC) zenginleştirme hazırlanması ve en fazla 6 ay süreyle 4 ° C'de saklayın.
  5. 400 mg tricai çözülmesiyle etil 3-aminobenzoat metansülfonik asit (tricaine) stok çözeltisi, 100 ml hazırlayın97.9 ml ne toz distile su. 7.0 pH değerini ayarlamak ve -20 ° C'de çözelti depolamak için 1 M Tris (pH 9) ve 2,1 ml ilave edilir.
  6. Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirmenin cihazı kullanılarak borosilikat cam kılcal (1mm OD x 0.78 mm ID) çekerek microcapillary enjeksiyon iğneleri hazırlayın: Hava basıncı 650; 999 Isı; 50 çekin; Hız 80; Saat 200.
  7. Mavi balık su içinde% 1.5 agar çözeltisi hazırlayın ve 100 mm petri kaplarına eridi ağar 25 ml dökün. Erimiş agar üstünde, belirli kanallar diziye için ev yapımı kalıpları yerleştirin. "V" şeklinde kanal pozisyonu embriyolar için kullanılan yumurta (Şekil 1) 31 için kullanılan biçimli "U" ise. Katılaşmış sonra, dikkatlice damgasını çıkarın.
    NOT: en fazla 2 ay süreyle 4 ° C'de dehidratasyon ve mağaza önlemek için mavi balık su ile agar örtün.

Figür 1 Zebra balığı enjeksiyonlar için Şekil 1. Yerleştirme odaları. (A) yumurta (sol panel) ve embriyolar için V-şekilli kanalların (sağ panel), U-şekilli kanallar. Zebra balığı yumurta / embriyo kanallarında koydu ve aynı eksen boyunca hizalanır. (B) görüntüleme odaları mikroskobik gözlem için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Hazırlık ve M. Depolama abscessus Aşı

  1. M. abscessus büyüme koşulları
    1. M. dışarı Plakalı OADC% 10 ve% 0.5 gliserol (7H10 OADC) ve uygun antibiyotik floresan proteini kodlayan vektör tarafından taşınan direnç markörünün bağlı olarak takviye ihtiva eden bir Middlebrook 7H10 ağarı üzerine -80 ° C gliserol stokundan abscessus. Inkübe4-5 gün boyunca 30 ° C'de kanştınn.
    2. Bir floresan pozitif mikobakteriyel koloni al ve 15 ml'lik steril bir plastik tüp gerekli bir antibiyotik ile OADC ile desteklenmiş 1 mi Middlebrook 7H9 suyu,% 0.2 gliserol,% 0.05 Tween 80 (7H9 OADC / T) inoküle. Çalkalamadan 1 hafta boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
      Not: Tween 80 topaklanma ve bakteriyel agregasyonunu kısıtlar.
    3. (Yaklaşık 5,10 7 bakteri / ml karşılık gelen) son 0,1 OD 600, 150 cm 2 doku kültürü şişelerinde 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T 2.1.2 'de elde edilen ön-kültür yeniden süspanse edin ve 4 için 30 ° C de inkübe günde bir katlanarak büyüyen kültürün (OD 600 = 0,6 0,8) elde edilmiştir.
      NOT: topaklanma en aza indirmek için, özellikle de kaba varyant, inkübasyon 5 gün geçmemelidir. Hem pürüzsüz ve sert varyantları benzer büyüme gösterir.
  2. M. hazırlanması abscessus inokulumlar60;
    NOT: nedeniyle kaba M. yüksek eğilimine abscessus büyük topaklar oluşturmak ve radyaller için, belirli bir tedavi öncesi embriyolar microinjections homojen ve nicel olarak kontrol inokulum üretmek için gereklidir. Bu tedavi aynı zamanda sert ırkına göre daha az ölçüde olsa da, agrega üreten bakterilere düz uygulanır.
    1. Hasat 4 ° C'de santrifüj ile 150 cm2 doku kültürü şişeleri kültürleri katlanarak büyüyen 000 50 ml'lik steril bir plastik tüp, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca xg ve 1 ml 7H9 OADC / T bakteriyel pelletini. Kısım 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine bakteriyel süspansiyonlar 200 ul.
      NOT: 1 ml şırınga içinde, küçük hacim ile çalışma oldukça homojen bir süspansiyon elde etmek için gereklidir.
    2. Her Sonication se arasında 10 sn sonları ile (10 sn, (15 yukarı ve aşağı dizileri) sonikasyon üç kez 26-G iğne ile bakteriyel süspansiyonlar homojenizeBir su banyosu sonikatör kullanılarak sekans). Kısaca 7H9 OADC / T ve vorteks 1 ml ekleyin. 100 x g'de santrifüjleyin 3 dakika.
    3. Dikkatle kümeleri önlemek ve 50 ml'lik steril bir plastik tüp homojen süspansiyonların havuza mikobakteriler içeren süpernatantlar toplamak.
    4. Nihai kalan bakteriyel agregaların varlığı için görsel olarak kontrol edin.
      NOT: agregalar hala mevcutsa, 2 dakika boyunca 100 xg'de Ek bir santrifüj işleminin devam ve supernatant toplanır.
    5. Santrifüj Süspansiyon 5 dakika boyunca 4000 x g'de, 200 ul 7H9 OADC / T pelet tekrar süspansiyon ve enjeksiyon için devam edin.
    6. 7H10 OADC agar üzerinde (1 x PBST içinde) seri dilüsyonları kaplama ve 30 ° C de 4 gün inkübe edildikten sonra, koloni oluşturan birim (CFU) sayımı ile son bakteriyel konsantrasyon değerlendirin. CFU her yeni partisi için belirlenmelidir.
    7. -80 & # Az 5 ul alikotları saklayarak dondurulmuş inokulumlar stoklarını hazırlayın176 ° C.
      NOT: -80 ° C donmuş tümbölenini CFU değerlendirme dondurma / çözme inokulum bakteri canlılığını etkileyebilir olarak canlı bakteri kesin sayısını belirlemek için bir ön koşuldur. Bunlar donmuş inokulumlar sonraki enjeksiyonlar için kullanılmak üzere hazırdır. Tüm alikotları CFU aynı sayıda yana, başka bir deneyden elde edilen tekrarlanabilir bir şekilde bakteri enjekte sağlar.
  3. Aşı kalite kontrolü
    Not: (mikobakteriler özgü) Ziehl-fast boyama öncesi ve 2.2 tarif edilen homojenleştirme işlemlerinden sonra bakteriyel süspansiyonlar kalitesini karşılaştırmak için kullanılabilir.
    1. Nokta ve bir cam slayt homojenize bakteri süspansiyonu bir damlacık yaymak ve bu tamamen kurumasını 65-70 o C ve leke bir Ziehl-Neelsen boyama protokolü kullanılarak ayarlanmış bir sıcak plaka üzerinde en az 30 dakika süreyle smear düzeltmek için izin .
    2. Bir mikroskop, bir 100 kullanarak bakteriyel smear gözlemleyinX objektif ve olmayan işlenmiş bakteriyel süspansiyon bir karalama ile karşılaştırmak (Şekil 2).

Şekil 2,
Dağınık M. Şekil 2. Hazırlanması abscessus inokulumlar. R veya S Ziehl-fast boyama (üst paneller) Herhangi bir tedavi öncesinde sıvı ortamında yetiştirilen varyantları ya da tedavisi için (alt paneller) sonrasında, mikobakteriyel agrega büyüklüğü ve sayısı (şırınga, sonifikasyon ve dekantasyon ardışık aşama) azaltmak için . Bakteri 100 x APO yağı 1,4 NA objektif) bir mikroskop kullanılarak tespit edilmiştir. Ölçek çubukları:. 20 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Zebra balığı Embriyolar hazırlanması

  1. Zebra balığı yumurtaları yumurtlama ve toplama
    1. S gün öncepawning, 2 erkek ve 1 kadın koyarak cins yetişkin zebrabalıkları: bir yumurta toplama sepeti 31 ayrı akvaryum oluşan bir üreme odasına (genellikle 2 1 oranında optimum fertilizasyon oranını sağlar).
      NOT: Yumurta toplama sepetleri veliler tarafından yenen yumurta korumak ve yumurta hasat kolaylaştırmak için kullanılır.
    2. 28.5 ° C, 25 ml mavi balık su (maksimum 100 tabak başına embriyolar) ve onları tutmak ile dolu bir 100 mm Petri kabındaki 1 hpf, hasat yumurta ve sadece düzgün geliştirilen embriyoların at. Sigara döllenmiş yumurta atılır.
  2. Enjeksiyonlar için zebra balığı embriyo Hazırlık
    1. Yaklaşık 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf), 100 mm Petri kabındaki ince cımbız ile embriyo dechorionate ve 28.5 ° C'de saklayın.
    2. Bir pipet kullanılarak 30-48 HPF embriyolar toplayın ve balık 25 ml su 270 mg / L ihtiva eden tricaine ile dolu bir "V" şeklinde yerleştirme bölmesine transfer edin.Daha kolay bir mikro-manipülasyonu için optimize edilmiş bir ev yapımı Microloader ucu aracını (ev yapımı kısaltıldı mikro yükleyici ucu) kullanarak kanallar düzgün embriyoların yatırın.
      NOT: kaudal ven veya kuyruk kas enjeksiyonları için yukarı sırt tarafında intravenöz enjeksiyon için aşağıya dorsal yüzü yönlendirmek.

4. Mikro enjeksiyon Prosedürü

NOT: M. mikro-enjeksiyon prosedürü abscessus M. daha önce tarif edilen bir benzer marinum 32 enjeksiyonları. M. kronolojisini değerlendirmek için abscessus enfeksiyon (hayatta kalma, bakteri yükü, kinetik ve enfeksiyon özellikleri), 30 hpf embriyoların kaudal ven enjeksiyonları tercih edilmektedir. Bağışıklık hücresi alımı görselleştirmek için, enjeksiyon 48 hpf embriyo kuyruk kaslarında olduğu gibi, lokal bölgelerde yapılır.

  1. CFU sayısı bağlı olarak 1 x PBST (mikobakteriyel aşının seyreltinUygun enjeksiyon kontrol etmek için,% 10, kırmızı fenol ihtiva eden, Aşama 2.2.6) 'de belirlendiği üzere uygulanabilir.
  2. Bir Microloader ucu kullanarak bakteriyel inokulum 5-10 ul bir microcapillary enjeksiyon iğnesi yükleyin, enjektör bağlı üç boyutlu mikromanipülatör sahibinin içine mikroenjeksiyon iğne bağlamak ve bir elde etmek için ince cımbız ile iğne üst kesiyorum 5-10 mikron çapı açılması.
  3. Mikroenjeksiyon basıncı (20-50 hPa) ve saati (0.2 sn) ayarlayarak enjeksiyon hacmi kalibre edin.
    Not: gerekli enjeksiyon hacmi embriyonun yumurta sarısı içine atılır bir damlacık çapına görsel belirlenmesi ile kalibre edilir.
  4. Kaudal damar enjeksiyonu için (bölüm 3.2.2 açıklandığı gibi) iğne bakacak ventral yüzü embriyo yerleştirin ve kaudal ven hedefleyen ürogenital açılış iğne ucu yakın, koyun ve yavaşça embriyo içine iğne ucu itin Sadece Caud deler kadaral ven bölgesi. Genellikle yaklaşık 100 CFU / nl içeren 1-3 nl, bakteriyel hazırlık istenilen hacmi sunun.
  5. Kas içi enjeksiyon için, (bölüm 3.2.2 gibi) iğne bakacak dorsal yüzü embriyo yerleştirin tek hücre gruplarının üzerinde iğne yerleştirin ve inokulum küçük bir hacim (1 nl) enjekte edilir.
    NOT: kaudal ven enjeksiyonları gelince, kas içi enfeksiyonlar da gerçekleştirmek için zorlu. Bakım çevre dokulara zarar verebilir, bir aşırı yüklenmesini önlemek için alınmalıdır.
  6. Enjeksiyon işlemi sonunda, 7H10 OADC ile kaplama ve CFU saymak suretiyle steril PBST bir damla bakteri süspansiyonu aynı hacimde enjekte inokulum boyutunu kontrol eder. Yaklaşık 100 embriyolar bir iğne ile enjekte edilebilir.
    NOT: Çünkü kaba M. abscessus iğne agregatlar oluşturması için devam edebilir, enjeksiyonu inokulum hazırlanmasından hemen sonra yapılması gerekir.
  7. Enfekte fis aktarın2 ml / oyuk balık su ve 28,5 ° C'de inkübe içeren h bireysel olarak 24 oyuklu plakalar. 1-3 nl 1 x PBST ile enjekte edilen embriyolar kontrol olarak da kullanılabilir.
  8. Embriyolar floresan bakterilerin uygun enfeksiyonu, bir floresans mikroskobu kullanılarak izlenir.

Makrofaj-Tükenmiş Embriyolar 5. Nesil

NOT: dokulardan makrofajlar seçici tüketme enfeksiyonu sırasında katkılarını ve rolünü araştırmak için kullanılır. Makrofajlar uygun tükenmesi görselleştirmek için, MCherry özellikle makrofaj belirli bir MPEG1 promoterinin 19 kontrolü altında ifade edilir flüoresan makrofajlar ile bir transgenik hattı kullanmak tavsiye edilir.

  1. Lipo-klodronat bazlı prosedür
    NOT: lipo-klodronat prosedür dokulardan makrofajların seçici tükenmesi (ancak hiçbir nötrofiller) 19 verir. Bu bileşik, ne embriyoların ne af hayatta değiştirmez yokBakterilerin bütünlüğünü fect. Lipozomla kapsüllenmiş klodronat hazırlamak için ayrıntılı bir protokol daha önce 33 bildirilmiştir.
    1. 24 hpf, embriyolar dechorionate ve 3.2.2 de tarif edildiği gibi, püskürtme işleminin sonuna kadar anestezi altında halde embriyolar korumak için tricaine ile takviye edilmiş balık su ile dolu bir "V" şeklinde püskürtme kabı aktarın. Aşağıya doğru dorsal yüzü yönlendirmek.
    2. Lipozom kapsüllü klodronat (lipo-klodronat) ile microcapillary enjeksiyon iğnesi yükleyin, üç boyutlu mikromanipülatör sahibinin içine mikroenjeksiyon iğne bağlayın ve 10 um bir ucu açılış çapı elde etmek için ince cımbız ile iğne üst kesiyorum.
    3. Enjeksiyon hacmi kalibre etmek için, 20 hPa mikroenjeksiyon basıncı ve 0.2 sn enjeksiyon süresini ayarlayın. Kaudal ven hedefleyen, ürogenital açılış iğne ucu yakın yerleştirin ve yavaşça içine iğne ucu itinEmbriyo sadece kaudal ven bölgesini deler ve çözümün istenilen hacmi (2-3 nl, 3 kez) teslim kadar.
      NOT: lipo-klodronat süspansiyon çok yapışkan ve embriyonun damar sistemi ve öldürme engellenmesini önlemek için enjeksiyondan önce vortekslenmiş edilmelidir. Bu küçük hacimli birkaç ardışık enjeksiyonlar devam etmek çok önemlidir.
    4. Balık su içeren 100 mm petri kaplarına embriyo transferine ve enfeksiyon kadar 28.5 ° C saklayın.
    5. Floresan mikroskobu ile makrofajlar uygun tükenmesi kontrol edin.
      Not: Tam makrofaj tükenmesi lipo clodoronate uygulamadan sonra 4 gün süre ile etkilidir.
  2. Morfolino bazlı prosedür
    1. 2 erkek ve bir üreme odasında plastik bariyer ile ayrılmış 1 kadın koyarak yumurtlama, cins yetişkin zebrafish gün önce.
    2. Ertesi gün, ışık zebrabalıkları tesiste yanar sonra ≈ 30 dakika, ayırma bariyer kaldırmakkadın ve erkekler. Fertilizasyon hızını optimize etmek üzere yumurtlama başlangıcından sonra yaklaşık 20 dakika boyunca bekleyin. Yumurtaları hasat ve soğuk mavi balık su (4 ° C) ile dolu bir 100 mm petri aktararak onların gelişimini yavaşlatır.
      NOT: yumurtlama kontrolü morpholinos tabanlı deneyler için çok önemlidir. Morpholinos sadece dört hücre aşamasına kadar yumurta içine enjekte edilebilir.
    3. Bir pipet kullanarak yumurta toplamak ve soğuk mavi balık su dolu "U" şeklindeki enjeksiyon odasında yumurta aşağı yatırmak ve bir ev yapımı Microloader ucu aracını kullanarak kanallarında yumurta engeller.
    4. Daha önce tarif edildiği gibi 19, fenol kırmızısı% 10 ihtiva eden pu.1 morfolino çözeltisi hazırlayın. Morfolino hazırlık olan bir microcapillary enjeksiyon iğnesi yükleyin ve üç boyutlu mikromanipülatör sahibinin içine mikroenjeksiyon iğne bağlamak, sonra obtai ince cımbız ile iğne ucu koparak5-10 um na ucu açılış çapı.
    5. Enjeksiyon hacmi kalibre etmek için, 20-50 hPa mikroenjeksiyon basıncı ve 0.2 sn enjeksiyon süresini ayarlayın. Yumurta yakın iğne ucu yerleştirin ve yavaşça istenen morfolino çözüm hacmi, genellikle 3-5 nl yumurtanın içine koryon yoluyla iğne ucu itin ve teslim.
    6. Mikro-enjeksiyon sonra balık su içinde 100 mm petri çanağına yumurta transferi ve enfeksiyon işlemi başlar kadar 28.5 ° C 'de inkübe edilir.
    7. 30 48 hpf floresan mikroskobu ile pu.1 morphants makrofajların uygun (tam) tükenmesini analiz edin..
      Not: enjekte edilen konsantrasyona bağlı olarak, p u.1 morpholinos erken nötrofil sayısını etkileyebilir. Nötrofil sayısının değiştirmeden makrofajlar uygun tükenmesi onaylamak için, GFP ile (floresan makrofajlar ve nötrofiller ile çift transgenik zebrafish hattını kullanmanız tavsiye edilirözellikle Mpx promoteri tarafından tahrik edilen sentezleme) 19.

6. Bakteriyel Yükü Ölçümü

  1. CFU numaralandırma tarafından belirlenmesi
    1. Arzu edilen zaman noktasında, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde enfekte embriyo grupları (koşullarına göre 5) (1 embriyo / tüp), 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkalama ile embriyolar cryo-anestezisi ve tricaine bir doz aşımı ile ötenazi (300- toplamak 500 mg / L)
    2. Iki kez steril su ile embriyolar yıkayın ve yeni bir tüp içinde dağıtılması, lize her embriyo% 2 Triton X-100, bir 26-G iğne kullanılarak ve tam liziz kadar süspansiyon homojenize 1 x PBST içinde seyreltilmiştir. Süspansiyon santrifüj ve% 0.05 Tween homojenatlarının 80 seri seyreltileri Middlebrook 7H10 OADC üzerine kaplanmıştır ve üretici firmanın yönergelerine göre BBL MGIT PANTA ile takviye edilmektedir 1 x PBST pelletini.
      NOT: M. NaOH Terbiyede daha duyarlı olma abscessusM. den t M. etkilemeden balık lizatlarının marinum, dekontaminasyon abscessus büyüme başarıyla BBL MGIT PANTA antibiyotik kokteyli kullanılarak elde edilebilir.
    3. 30 ° C ve sayım koloni olacak şekilde, 4 gün boyunca inkübe edin.
  2. Floresan Pixel belirlenmesi canlı embriyolar (FPC) ölçümleri Sayısı
    NOT: floresan emisyon yoluyla bakteri yüklerini belirlemek için, enfekte embriyoların seri görüntüleri elde edilir ve FPC (partikül analizi ile bakterilerin tanımlanması) ile ölçülen floresan yoğunluğu ImageJ freeware için geliştirilmiş bir ev yapımı makro kullanarak. Bir parçacık analizi kökenli ilgi floresan sinyal ayırt olanak sağlayan bir eşik aralığına dayanan bir ikili siyah beyaz resmi gerektirir.
    1. 3.2.2 tarif edildiği gibi arzu edilen bir zaman noktasında, 35 mm Petri tabaklarda enfekte embriyolar (koşul başına 5-10) tricain-anestetize.
    2. Su ve subme kaldırrge embriyolar ve balık su içinde% 1 düşük erime noktası agaroz ile tüm çanak yüzeyi, daha sonra yanal embriyoların hizalayın. Balık suyu tricaine içeren katılaşmış agaroz örtün.
    3. 10 x hedefi ile bir Epifloresans mikroskop kullanılarak tüm embriyo floresan görüntüler elde.
      NOT: floresan görüntü alma FPC ölçümleri prosedürün kritik bir adımdır. Bir renk kalibrasyon prob ile kalibre edilmiş bir monitör kullanmak önemlidir. Iktisap sinyalinin doygunluk engeller sırasında maruz optimal süresi ayarlama minimal bir arka plan elde etmek. Görüntüler bir 8-bit tiff formatında olmalıdır. Özdeş ayarlar kantitatif amaçlar için bütün deney sırasında tutulur.
    4. Bir ev yapımı Microloader ucu aracı ile embriyolardan dikkatlice agaroz çıkarın. Gerekirse bu embriyolar, daha sonraki analizler için de kullanılabilir. Bakteri yükünün miktarının öncesinde her resim kalitesi kontrol edilir. Bir içingörüntüleri nalyze ve balık başına FPC içine floresan dönüştürmek, ImageJ freeware açın.
      NOT: FPC değeri bakteri yükünü yansıtan önceden M. kullanılarak gösterildiği gibi marinum 34.
    5. Bulaşmamış embriyo, bir görüntü kullanılarak görüntü analizi için gereken eşik belirleme (birkaç kontrol embriyoları ortalama eşiği elde etmek için kullanılabilir). → → Eşik ayarlayın ve sonra arka plan tamamen siyah oluncaya kadar (yani sıfır olmalı bir arka plan elde etmek için) sağa eşik penceresinde alt kaydırıcıyı Image gidin. İlgili değerini kaydedin.
    6. Görüntü J içinde, FPC makro (ek dosyası) açın ve yönergeleri izleyin: Görüntülerin klasörünün ölçülecek bulmak ve önceden belirlenen ve "Tamam" üzerine tıklayın olarak sonra eşiği girin.
      NOT: Makro otomatik arka plan çıkarır. Bir eşik daha sonra tatbik edilir. Floresan sinyalleri tanımladı vardırparçacık analizi aşağıdaki fied.
    7. Kopya veri analizi için istenen yazılıma özet penceresinden verileri yapıştırın ve.
      NOT: CFU belirlenmesi yöntemine aksine, FPC yöntemi non-invaziv ve dinamikleri izleme önemlisi, daha sonraki analizler için embriyolar yeniden kullanımı ve izin verir / bireysel olarak bakteri yükünün kinetiği. Bu nedenle, önemli ölçüde etik kurallara uyum içinde, hayvanların sayısını azaltarak sağlar.

7. Görüntüleme M. abscessus- enfekte Embriyolar

  1. M. Canlı görüntüleme abscessus enfeksiyon
    1. Montaj tricaine anestezi embriyolar (3.2.2) epifloresans mikroskobu gözlemler öncesinde 35 mm petri kabı içinde% 1 düşük erime noktalı agarozda. Ters konfokal mikroskobu veya dik konfokal mikroskobu için tek kavite depresyon slayt bir cam alt çanak kullanın. Istenen konuma ve kapağa embriyo yönlendirmekBalık suyu tricaine içeren katılaşmış agaroz.
    2. Tüm embriyonun sıralı floresan toplama ve iletim görüntüler için 10 x hedefi ile bir Epifloresans mikroskop kullanın. Alternatif olarak, bir enfeksiyon sonrası bağışıklık hücrelerinin aktivitesini görselleştirmek için 40X veya 63X hedefleri ile bir konfokal mikroskop kullanın.
  2. Görüntüleme M. Sabit abscessus enfekte embriyolar
    1. 6.1.1 tarif edildiği gibi embriyolar Euthanize 4 ° C'de oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat boyunca 1 x PBST içinde% 4 paraformaldehid içinde embriyolar 1.5 mi mikro santrifüj tüplerine transfer ve düzeltin. 10 dakika boyunca 1 x PBST ile iki kere embriyo yıkanmasıyla paraformaldehid çıkarın.
      NOT: floresan korumak için sabitlenmiş embriyolar ışıktan korunmalıdır.
    2. Doku ve floresan bütünlüğünü korumak için, embriyolar için, (1 x PBST içinde seyreltilmiş 10, 20, 30, 40 ve% 50), gliserol konsantrasyonu çözümleri artan art arda inkübe edilirKoşul başına 10 dak.
      Not: Sabit embriyolar 4 ° C'de% 50 gliserol içinde birkaç ay depolanabilir.
    3. Bir görüntüleme odası (Şekil 1B) 31,% 50 gliserol içinde gömülü embriyo yerleştirin.
    4. Konfokal mikroskop 40X veya 63X hedefleri kullanarak görüntü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Çeşitli anatomik yerler 32 enjekte edilebilir, ancak, kuyruk damarı enjeksiyonu genellikle sağkalım deneylerde bakteriyel yük belirleme, fagositoz aktivitesi veya kordon oluşumu da dahil olmak üzere daha sonraki analizler için sistemik bir enfeksiyon elde etmek için kullanılır. Kuyruk kaslarda Enjeksiyonlar Enjeksiyon (Şekil 3A) yerinde makrofajların işe değerlendirmek için kullanılır. Araştırmak ve M. R ve S varyantları virülansını karşılaştırmak abscessus, floresan bakteriyel süspansiyonlar 30 HPF embriyolar (Şekil 3A), 19 kaudal damarından enjekte edilir. S varyanta aksine, R morfotip Merkezi Sinir Sistemi (CNS) (Şekil 3C) içindeki bakteriyel abse süratle gelişmesi ile tanımlanır zebra balığı embriyolar (Şekil 3B), bir daha sağlam ve ölümcül enfeksiyona neden olur. R ve S varyantları hem sistemik enjeksiyonlar MSS enfeksiyonları ve fark nedenpatolojisi ve hastalık oluşturma fenotipleri floresan mikroskopi gözlem (Şekil 3C) tarafından, balık (Şekil 3D) başına CFU numaralandırma veya elde edilen görüntülerin FPC (Şekil 3E) belirlenmesi yoluyla ölçülebilir. Önemlisi, CFU ve FPC tayini korelasyon ve 3 ve 5 dpi S suşu daha R suşu için büyük bakteriyel yüklere işaret edilmektedir. Genel olarak, bu sonuçlar kuvvetle enfeksiyon sürecinin kronolojisini incelemek için enfeksiyon alakalı ve non-invaziv bir model olarak zebrafish desteklemektedir.

Belki de en muhteşem özelliklerinden biri R varyantı ile enfekte embriyoların MSS (Şekil 4) içindeki serpantin kabloları görselleştirme sağlar video mikroskobu ile ortaya çıktı. Embriyoların optik şeffaflık sayesinde, R-kord oluşumunun kinetik ext çoğaltmak için R varyantının yüksek eğilimi gösteren, invaziv olmayan bir şekilde izlenmesi ve görüntülü olabilirracellularly. Hücresel / doku bozulması ile birlikte bu kontrolsüz replikasyon oranı hızla apselere ve sonuçta larva ölüme yol açar.

Makrofajlar mikobakteriyel enfeksiyon sırasında ve özellikle de granuloma formasyonunu 35 sürerek önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. İki tamamlayıcı stratejiler M. incelemek için kullanılabilir makrofaj-tükenmiş embriyolar abscessus büyüme / virülans: lipo-clodronate- ve morfolino dayalı işlemler (Şekil 5A). Video-mikroskopi (Şekil 5B) ortaya koyduğu gibi R varyantı ile makrofaj tükenmiş embriyoların Enfeksiyon lider, bakteriyel yükler ve kord üretiminde büyük bir artışa yol açar son derece hızlı ölüm (% 100 ölü embriyolar 3 dpi Şekil 5C) . Bu açıkça makrofajlar M. kontrol etmek için gerekli olduğunu gösterir abscessus enfeksiyon.

Ayrıca makrofajlar rolünü araştırmak içinenfeksiyon sırasında, kırmızı floresan makrofajlar (MPEG1: mCherry) barındıran spesifik transgenik embriyo 19 kullanılabilir. M. enjeksiyonu Kuyruk kas içine ya da kuyruk ven Wasabi ifade abscessus enfeksiyon yerinde miyeloid hücreler, özellikle makrofaj belirgin bir işe indükler. Bu işe ayrı ayrı bakterilerin etkin fagositoz (Şekil 6A ve 6B,) neden olur. Makrofaj varlığına rağmen, konfokal mikroskopi makrofajlar (Şekil 6C) fagosite olmayan büyük bakteriyel kordların görünümünü göstermektedir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular mikobakteri fagositozunu önlemede Cording rolü dayalı bağışıklık kaçırma yeni bir mekanizma vurgulayın.

Şekil 3,
Şekil 3. M. zebra balığı embriyolar abscessus enfeksiyon. (A) (üst panel), floresan M. enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir intravenöz enfeksiyonu 30 hpf embriyolar kaudal ven (beyaz gösterilmiştir) abscessus (1 ok) ürogenital açılış, arka,. (Alt panel) flüoresan mikrobakterileri enjekte edilerek gerçekleştirilir İntramüsküler enfeksiyonu 48 HPF embriyolar, bir hücre gruplarının (ok 2) üzerinden kuyruk kasında (beyaz gösterilmiştir). 30 hpf embriyolar intravenöz tdTomato- M ile enfekte (BE) abscessus (R ve S varyantları). (B) embriyo hayatta kalma eğrileri ≈ 300 CFU R ya ile enfekte olmuş ya da S varyantları veya PBS (n = 20) kontrol enjekte edildi. Üç ayrı deneyden elde edilen sonuçlar Örnek gösterilmiştir. (C) R veya çeşitli zamanlarda tdTomato (beyaz) eksprese eden S varyantı ya da uzaysal görselleştirme floresans canlı görüntüleme tarafından gerçekleştirilen enfeksiyon sonrası işaret eder. Her bir suş için, bütün enfekte olmuş embriyo temsili bir floresans ve iletim katlamalı Sho olan wn. Aynı embriyolar 3 ve 5 dpi'de görüntülenmiştir. (DE) CFU sayımı (D) ya da FPC ölçümleri (E) ile tespit R ya da S, varyant (≈ 200 CFU) ile enfekte olan embriyolar bakteriyel yükleri. (D) lizattan CFU Çeşitli zaman noktalarında her bir embriyo, enfeksiyon sonrası BBL MGIT PANTA ile takviye Middlebrook 7H10 OADC üzerine kaplama ile belirlenir. Üç ayrı deneyden elde edilen embriyo başına SD (yatay çubuklar) CFU ± ortalama log olarak ifade edildi (n = 5). Çeşitli zaman ImageJ kullanılarak partikül analizine dayalı enfeksiyon sonrası işaret bireysel bir oturma embriyolardan (E) FPC ölçümleri. Üç bağımsız deneyler embriyo başına SD (yatay çubuklar) FPC'nin ± ortalama log olarak sonuçlar ifade edilmektedir (n = 5). Tüm görüntüler dijital renkli kamera ile donatılmış bir Epifloresans mikroskop ile elde edilmiştir. t = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
M. R varyantı ile intravenöz olarak enfekte R varyantının in vivo Cording Şekil 4.. 30 hpf embriyolar abscessus ve çeşitli anda görüntülü kord oluşumunun ilerlemesini görselleştirmek için post-enfeksiyon işaret ediyor. Kırmızı ok kablosunun zamanmekansal evrimini takip etmek için sabit bir referans noktası olarak kullanılır. Büyüyen serpantin kablosu içeren kuyruk kısmının DIC resimleri (renkli kamera ile donatılmış bir mikroskop) kutulu edilir. Ölçek çubukları:. 100 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

0 / 53130fig5.jpg "/>
Şekil makrofajlar 5. tükenmesi artan kordon çoğalmasına yol açar. (A) Embriyolar lipo-klodronat tabanlı yordamı veya morfolinodur tabanlı prosedür kullanılarak tükenmiş. Embriyoların: (Üst panel) clodronat kapsüllü lipozomlar (lipo-klodronat) 24 hpf Tg (mCherry MPEG1) damardan enjekte edilir. Dolaşım içinde, lipo-klodronat hızla müteakip apoptoza makrofajlar tarafından yuttu edilir. Morfolino hazırlık (Sol-alt panel) Enjeksiyon knock-aşağı pu.1 genin ifadesini döllenmiş Tg (MPEG1: mCherry) içine Zebra balığı yumurtaları. (-). (Sağ alt panelde) embriyo makrofajların doğru incelmesi (BC) 30 HPF makrofaj-ihtiva eden (+) ya da makrofaj tükenmiş floresan mikroskobu ile kontrol edilir (lipo klodronat işlemini takiben) embriyolar M. bulaşmış tdTomato ifade abscessus R (beyaz gösterilmiştir). (B) M. ile enfekte makrofaj içeren veya makrofaj tükenmiş embriyolar (C) sağkalım eğrileri abscessus R (n = 20). Üç ayrı deneyden elde edilen sonuçlar Örnek gösterilmiştir. Tüm görüntüler renkli kameraya bağlı bir mikroskop ile elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
M. ile lokal ya da sistemik enfekte embriyolar makrofajların Şekil 6. davranışı abscessus (A) 48 hpf Tg (MPEG1: mCherry). zebrafish embriyolar Wasabi-ifade M. ile kas içi enfekte abscessus R. Canlı IMAGIgörselleştirmek için bir konfokal mikroskop kullanılarak ng (dakika sonrası enfeksiyon, mpi olarak) bireysel mikrobakterileri fagosite makrofajlar işe. (40X APO su 0.8 NA amacı ile konfokal mikroskop) bir enjeksiyon sitesine makrofajlar (kırmızı) yoğun işe gösteren maksimum intensite projeksiyon. Ölçek çubuğu: 20 mikron (BC) 48 hpf Tg (MPEG1: mCherry). Embriyolar intravenöz M. ile enfekte Wasabi sabit ve 4 HPI (B) ve 3 dpi (C) konfokal mikroskopi (40X) ile görüntülendi ifade abscessus R. (B) makrofaj (kırmızı) ya da diğer miyeloid hücreler muhtemelen nötrofiller (oklar) maksimum yoğunluk projeksiyon içeren (63X APO yağı 1.33 NA amacı ile konfokal mikroskop) enjeksiyonu sahasına yakın izole mikobakteri (yeşil). Ölçek çubuğu: 10 mikron (C) Maksimum yoğunluk projeksiyonu bir kordon (yeşil) (63X APO yağı 1.33 NA amacı ile konfokal mikroskop) fagosite yapamaz tek makrofaj (kırmızı) gösteren..Ölçek çubuğu:. 5 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zebra balığı son gerçek zamanlı 36 geniş bir alan ve konfokal görüntüleme kullanılarak bakteriyel enfeksiyon dinamiklerini incelemek için mükemmel bir omurgalı bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Birlikte mikro-enjeksiyon yöntemleri (protokol 4) ile dağınık mikobakteriyel süspansiyonlar (protokol 2.2) kombinasyonu tekrarlanabilir sistemik enfeksiyonlar ve daha sonraki izleme ve ev sahibi makrofajlar ile bakteriyel etkileşimleri üzerine özel bir odaklanma ile enfeksiyonun ilerlemesi görselleştirme sağlar. M. Virulence in vivo abscessus doğal tipte altın zebrabalıkları 37 kullanımı sayesinde araştırılabilir. M. arasındaki etkileşimi incelemek makrofajlar 19 görselleştirmek için: abscessus ve miyeloid hücreler barındıran, transjenik bir kaç zebra balığı hatları Tg (MCherry MPEG1) gibi kullanılabilir. 38 ya da Tg (lyz: DsRed) 39 w gibi: Tg (GFP mpx) gibi ek transgenik muhabiri hatlarıi kırmızı ya nötrofil yeşil sırasıyla, aynı zamanda enfeksiyona yanıt olarak, bu granülositlerin belirli bir rol gidermek için kullanılabilir.

M. abscessus ve özellikle R varyantı, bu şekilde tekrarlanabilir mikro-enjeksiyon önlenmesi masif bakteriyel agregalar 19 oluşturulması için doğal bir eğilim sergiler. Buna ek olarak, S varyantı daha gerçeği R varyant formları çok daha büyük kümeleri de iki izojenik varyantlar için virülans fenotipleri potansiyel karşılaştırma engellemektedir. 2. Bölümde açıklanan protokol homojen alma ve M. dağınık sağlar embriyo mikro enjeksiyon için abscessus süspansiyonları içerir. Bu preparat, aşırı bir araya özellikler gösteren başka mikobakteriyel türler veya mutant uygulanabilir. Sonication adım dıştaki mikrobakteriyel hücre duvarı tabakası değiştirebilir yana, bakım e bakteriyel canlılığı bu fiziksel tedavinin etkisini değerlendirmek için alınması gerekenyeni bir gerginlik ach.

Bakteriyel yük belirlenmesi rutin protokolü 6,1 de tarif edildiği gibi, çeşitli zaman noktalarında enfeksiyon sonrası seçici agar ortamı üzerinde lize embriyolar kaplama sonrası sayımı CFU dayanır. Bu prosedür, bazı sınırlamaları içerir: hayvanlar öldürüldü, çünkü, her bir embriyonun (ya da embriyo grubu MI) tek bir zaman noktasında belirlenmesi için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem sayesinde lize öldürüldü ve / veya kayıp bakteriler, daha sonra seri seyreltilerinden büyük bir kısmı, ya da esas olarak topaklanma ile tutarlı olarak kalır. CFU Sayma da zahmetli bir iştir. Bir alternatif olarak, iletişim kuralı 6,2 M. ölçmek için etkili bir yöntem tarif eder M. başlangıçta geliştirilen, piksel ölçümü ile enfekte embriyoların floresan görüntüleri analizine dayalı, sınırlı kullanım aşamaları içerir abscessus yük marinum 40,41. Parçacık analizine dayalı bu FPC yöntemi, iyi bir korelasyon göstermektedir wCFU sayımlarında i. Benzer şekilde, mikroskopi ve flüoresans ölçümü birleştirerek, embriyo başına doğuştan gelen bağışıklık hücre sayıları göreceli değişiklikler yeterli transgenik çizgiler kullanılarak resim analizi ile tayin edilebilir.

Zebra balığı embriyolar olumsuz M. cevaben konak sağkalımı etkilediği saptanmıştır enfeksiyon ve makrofaj tükenmesi sırasında bağışıklık hücresi rolünü değerlendirmek için kullanılabilir abscessus enfeksiyon. Belirli makrofaj tükenmesi verimli lipo klodronat tabanlı bir prosedür (protokol 5.1) ya da morfolino tabanlı bir prosedür (protokol 5.2) kullanılarak üretilebilir. Makrofaj varlığı kurulması ve damar sisteminin doğru gelişimi için bakım embriyo için çok önemlidir, çünkü Bununla birlikte, bu, lipo-klodronat kullanılarak 24 hpf makrofaj üretimini aşındırılması için tavsiye edilir.

Zebra balığı embriyo M. incelemek için eşsiz bir model olarak görünüyor abscessus enfeksiyonlar ve extracell rolüular bir bağışıklık sistemi yıkılma stratejisi olarak Cording. Belirleyiciler M'de Cording kontrol ederse abscessus tespit edilebilir, bunlar yenilikçi tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine yol açabilir. Yenilikçi yüksek verimlilik teknolojilerine 42 ile birlikte zebrabalıkları kullanımını Bağlama da ilaç keşfi ve bu ilaç dirençli patojene karşı yeni farmakolojik yaklaşımlar alanı açılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar yararlı tartışmalar için sırasıyla, tdTomato ve Wasabi ifadesini sağlayan pTEC27 ve pTEC15 cömert hediye için lipo-klodronat ve L. Ramakrishnan sağlamak için K. Kissa minnettarız. Fransız Ulusal Araştırma Ajansı projelerinden (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 ve DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) ve Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı Bu çalışma parçasını oluşturmaktadır (FP7-PEOPLE-2011-ITN) Hibe sözleşmesi kapsamında hayır. PITN-GA-2011-289209 Marie-Curie İlk Eğitim Ağı FishForPharma için. Biz CM Dupont fon Derneği Gregory Lemarchal ve Vaincre La mukoviskidoz (RF20130500835) teşekkür etmek de isterdim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

Enfeksiyon Sayı 103, Zebra balığı enfeksiyon patogenez doğuştan gelen bağışıklık makrofaj mikro-enjeksiyon floresan mikroskopi canlı görüntüleme Cording.
Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet,… More

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter