Introduction
マイコバクテリウム膿瘍は、ヒトにおける臨床症候群の広いスペクトルを引き起こす新興病原体です。これらは、主に、免疫不全にし、1,2,3,4、嚢胞性線維症患者に遭遇する皮膚の感染症だけでなく、重度の慢性肺感染症が含まれる。M.膿瘍はまた、ヒトにおける院内や医原性の感染症に関与する主要な急速に成長しているマイコバクテリア種とみなされています。また、いくつかの最近の報告は 、Mの可能性を強調膿瘍は、血液脳関門を通過し、中枢神経系（CNS）5,6において重要な病変を誘導することができます。急速な生産者であるにもかかわらず、M.また、 膿瘍展示肉芽腫性構造体内年間は黙秘し、肺7に乾酪病変を生成する能力を含む、結核菌のものに関連するいくつかの病原性機能。もっと憂慮すべきは、低銭ですMの sitivity抗生物質に膿瘍 、重要な治療の失敗率8,9につながる治療することが極めて困難これらの感染症をレンダリングします。この種の重要な脅威は、公衆衛生機関10と肺移植11禁忌の主要な関心事である、主に抗生物質に対する固有の抵抗です。
M.膿瘍ディスプレイ異なる臨床転帰につながるスムーズ（S）または粗い（R）コロニー形態型。 S株とは対照的に、R細菌はロープまたはひも状構造12,13につながる、エンドツーエンドを成長させる傾向があります。細胞性または動物モデルのいずれかに基づいて、いくつかの独立した研究は、R形態型14,15のハイパー病原性表現型を明らかにしました。疫学的研究、Mの最も深刻なケースから、 膿瘍肺感染症は、その唯一のバリアントです16バリアント Rに関連すると思われます感染したホスト3年間持続することが確認されています。形態型の違いは、表面結合glycopeptidolipids（GPL）12の（Rで）（S）に存在又は損失に依存しています。しかし、現在利用可能な携帯/動物モデルの固有の制限のためには 、M を研究するために使用膿瘍感染は、RまたはSの変異体の病態生理学的事象についての我々の知識が曖昧なままになります。静脈内またはエアロゾル経路を介して免疫適格マウスの感染は、持続感染およびin vivoでの薬剤感受性試験のための17を研究するためにマウスの使用を妨げ、一過性の植民地化につながります。したがって、宿主応答の操作に適した動物モデルを開発することは大きな課題です。この文脈において、感染の非哺乳動物モデルは、例えば、O、コスト、スピードおよび倫理的許容性など、いくつかの利点を提供するキイロショウジョウバエ 18を含め、近年開発されていますマウスモデルをVER。感染のゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）のモデルは、非侵襲的イメージング、Mの進行や年表により、可視化するために検討されています生きた動物19内膿瘍感染。重要なのは、コンセプトの証明はまた、Mに対するin vivoでの抗生物質の評価のための適合性を実証するために設立されました17,20 膿瘍 。
ゼブラフィッシュは、広く様々な病原体と宿主免疫系21との間の相互作用を研究するために、最後の二十年の間に使用されてきました。この代替脊椎動物モデルの増加成功はやる気と多数のウイルスや細菌感染19,22,23,24,25,26,27,28,29をより良く理解するためのその使用を検証し、主要な、ユニークな機会に依存しています。ほとんどの他の動物モデルとは対照的に、ゼブラフィッシュ胚は、非侵襲的な蛍光画像30を可能にする光学的に透明である。これは、HAS は 、M を研究するために導きました膿瘍は、細菌の形態学的可塑性の一例を表す外よれの説明で最高潮に達する、前例のない詳細をゼブラフィッシュ胚を感染させました。コーディングは、免疫系の転覆の新機構と急性Mの病因を促進する重要なメカニズムを表し膿瘍感染症19。
このレポートでは、Mの病態生理学的特徴を解読するためにゼブラフィッシュの胚を使用して、新しいツールと方法について説明します感染膿瘍と菌と自然免疫系との間の密接な相互作用を研究します。まず、 それ自体細菌接種、胚の準備、及び感染の処理を含む詳細なマイクロインジェクション手順は、提示されています。方法は、具体的にMを評価するように適合さそのような宿主の生存と細菌負荷など様々なパラメータを測定することによって膿瘍の病原性は、提示されています。特別な焦点は、どのように与えられています感染および M.に対する宿主免疫応答の監視、時空間レベルで、運命および進行へビデオ顕微鏡を用いて膿瘍 。また、M.間に寄与し、マクロファージの役割を調査するために感染膿瘍 、方法は、（遺伝的にまたは化学的ベースのいずれかの方法を使用して）、マクロファージ枯渇胚に記載されているが生成されます。最後に、固定または生きているいずれかの胚を用いて、マクロファージまたは好中球との特異的相互作用を可視化するプロトコルが記載されています。
このレポートの目的は 、Mに新たな光を当てるために、さらなる研究を刺激することです膿瘍病原性メカニズム、特に急性および制御不能な感染プロセスの確立によれの役割。
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Protocol
ゼブラフィッシュ実験手順は、関連機関や政府の規制を遵守しなければなりません。本研究では、ゼブラフィッシュの実験は、実験動物の取り扱いのための欧州連合のガイドライン（http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm）によると、大学モンペリエで行われた、基準の下で承認CEEA-LR-13007。
試薬およびマイクロインジェクション機器の作製
- 1ヶ月まで（20分間120°C）を滅菌するオートクレーブその後、1Lの蒸留水31に0.06グラムインスタントオーシャン海の塩を溶解させ、魚の水を用意し、28.5℃で保存します。
- 1リットルの蒸留水にメチレンブルー1gを溶解することによってメチレンブルー溶液を準備します。その後、1ヶ月まで28.5℃で滅菌して保存するために、オートクレーブ、青魚の水を得るために、1Lの魚の水にメチレンブルー溶液を300μlを追加します。
注：additi魚水中のメチレンブルーの上にカビの成長を防止します。 - リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の調製
- 5.696グラムの Na 2 HPO 4、680ミリグラムのKH 2 PO 4、969 mgのKCl及び78.894グラムのNaCl 1リットルで蒸留水に溶解することにより10×PBS原液を調製し、HClでpHを7.0に調整します。 、1 X PBSを得る滅菌するために、120℃で20分の間、水、オートクレーブ蒸留900mL中で10×PBS溶液100mlに希釈します。
- 1年まで、室温で1×PBSTを得るために、0.05％のTween 80を追加し、保存します。
- 8.5グラムのNaClを溶解することによってオレイン酸デキストロースカタラーゼ（OADC）濃縮を準備し、50グラムのウシ血清アルブミン、20gのD-グルコース、40mgのカタラーゼ、ウシの肝臓およびオレイン酸0.5gから1リットルの蒸留水を溶液を滅菌フィルタし、 6ヶ月まで4℃で保管してください。
- 400ミリグラムtricaiを溶解させることにより、エチル3-アミノ安息香酸、メタンスルホン酸（トリカイン）の100 mlのストック溶液を調製します97.9ミリリットルの蒸留水にNE粉末。 pHを7.0に調整し、-20℃で溶液を保存するために1Mトリス（pHが9）の2.1ミリリットルを追加します。
- 次の設定でマイクロピペットプラー装置を用いて、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（1ミリメートルOD X 0.78ミリメートルのID）を引くことにより、マイクロキャピラリー注射針を準備します。エア圧650; 999を加熱。 50を引いて、速度80;時間200。
- 青い魚の水中の1.5％寒天溶液を調製し、100ミリメートルペトリ皿中で溶融した寒天の25ミリリットルを注ぎます。溶融した寒天の上に、特定のチャネルをインプリントするために、自家製の金型を配置します。 「V」字状のチャンネルが位置胚に使用されている卵（ 図1）31のために使用される形状の「U」つつ。固化した後、慎重にインプリントを削除します。
注：最大2ヶ月間4℃で脱水し、ストアを回避するために、青魚の水と寒天をカバー。
ゼブラフィッシュの注射については、図1の位置決め室。 （A）卵（左パネル）および胚のためのV字型のチャネル（右パネル）のためのU字型のチャネル。ゼブラフィッシュの卵/胚は、チャンネルに敷設し、同じ軸に沿って整列している。（B）の表示室顕微鏡観察のために。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2. Mの準備と保管接種膿瘍
- M.膿瘍成長条件
- Mをプレートアウトミドル7H10寒天上に-80℃のグリセロールストックから膿瘍 10 OADCの％および0.5％グリセロール（7H10 OADC）を含む 、蛍光タンパク質をコードするベクターによって運ば耐性マーカーに応じて、適切な抗生物質を補充しました。プレートをインキュベート4-5日間30℃で。
- 蛍光陽性マイコバクテリアのコロニーをピックアップし、15 mlの滅菌プラスチックチューブで、必要な抗生物質をOADCを補充した1ミリリットルミドル7H9ブロス、0.2％グリセロール、0.05％のTween 80（7H9 OADC / T）を接種します。振盪せずに1週間、30℃でインキュベートします。
注：トゥイーン80は、凝集および細菌凝集を制限します。 - （周りの5.10 7細菌/ mlに相当する）は、最終的な0.1 OD 600に150cm 2の組織培養フラスコに50ミリリットルミドル7H9 OADCは/ Tで2.1.2で得られた前培養を再懸濁し、4、30℃でさらにインキュベート日が指数関数的に成長している培養物（OD 600 = 0.6〜0.8）を得ました。
注：特にラフ変異体、凝集を最小限にするために、インキュベーションは、5日を超えてはなりません。どちらも滑らかで荒れた変異体は、同様の成長率を表示します。
- Mの準備接種物膿瘍60;
注：ラフMの高い傾向のために膿瘍大きな凝集体を形成すると、コードを生成するために、特定の治療法は、前胚におけるマイクロインジェクションに均質かつ定量的に制御された接種物を生成する必要があります。この処理は、ラフ株よりも少ない程度ではあるが、凝集体を産生する細菌を平滑化するために適用されます。- 収穫4で遠心分離150 CMから指数関数的に増殖する培養物2組織培養フラスコ、RTで15分間、000×gで50ミリリットルの滅菌プラスチックチューブ中、1mlの7H9 OADC / T中の細菌ペレットを再懸濁します。小分け1.5mlの微小管への細菌懸濁液200μlの。
注：1ミリリットル注射器の小さいボリュームの操作は、非常に均質な懸濁液を得るために必要です。 - 各超音波処理SEの間に10秒の休憩を（10秒間、（15上下配列）に超音波処理3回26-G針で細菌懸濁液を均質化水浴超音波処理を使用してquence）。簡単7H9 OADC / Tと渦の1ミリリットルを追加します。 100×gで3分間遠心。
- 慎重塊を避けるため、50 mlの滅菌プラスチックチューブで均質な懸濁液をプールするマイコバクテリア含有上清を収集します。
- 最終的に残った細菌の凝集体の存在を視覚的に確認してください。
注：凝集体がまだ存在している場合は、2分間100×gで、追加の遠心分離工程に進み、上清を収集します。 - 5分間遠心4000×gで懸濁液を、200μlの7H9 OADC / Tでペレットを再懸濁し、注入に進みます。
- 7H10 OADC寒天上 （1×PBST中で）連続希釈液をメッキし、30℃で4日間のインキュベーション後にコロニー形成単位（CFU）をカウントすることによって、最終細菌濃度を評価します。 CFUを、それぞれ新しいバッチのために決定されるべきです。
- -80＆＃で5μlのアリコートを格納することにより、冷凍接種物ストックを準備します176; C。
注：凍結/解凍は、接種物の細菌の生存能力に影響を与える可能性があるとして、-80℃で凍結した一定分量のCFUの評価は、生菌数を正確に決定するための前提条件です。これらの冷凍接種物は、その後の注射のために使用される準備ができています。すべてのアリコートを、CFUの数が同じであるので、彼らは別の実験で再現性のある方法で細菌を注入することができます。
- 収穫4で遠心分離150 CMから指数関数的に増殖する培養物2組織培養フラスコ、RTで15分間、000×gで50ミリリットルの滅菌プラスチックチューブ中、1mlの7H9 OADC / T中の細菌ペレットを再懸濁します。小分け1.5mlの微小管への細菌懸濁液200μlの。
- 接種材料の品質管理
注：（マイコバクテリアに特異的）、チール・ネルゼン染色の前に2.2に記載の均質化手順の後に細菌懸濁液の品質を比較するために使用することができます。- スポットとスライドガラス上の均質化された細菌懸濁液の1滴を広げ、それは、完全に乾かし65-70 O Cと汚れがジールネルゼン染色プロトコルを使用して設定したホットプレート上に少なくとも30分間、スミアを修正することができます。
- 100を使用して顕微鏡で細菌スミアを観察X目的と未処理の細菌懸濁液の汚れと比較（ 図2）。
分散Mの図2.準備膿瘍接種材料。RまたはSのジールネルゼン染色は（上のパネル）は、任意の処理の前にブロス培地上で増殖させた変異体または治療（下パネル）の後にマイコバクテリアの凝集体の大きさと数（syringing、超音波処理およびデカンテーションの一連の工程）を低減します。細菌は100 X APO油1.4 NAの対物レンズ）と顕微鏡を用いて観察しました。スケールバー：20μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ゼブラフィッシュ胚の準備3.
- ゼブラフィッシュの卵を産卵し、収集
- 前日入質、2人の男性と女性1を配置することで、品種の大人のゼブラフィッシュ：採卵かご31と別々の水槽からなる、飼育室に（通常2 1の比率が最適な受精率を可能にします）。
注：採卵バスケットは両親に食べられているから卵を保護し、卵の収穫を容易にするために使用されます。 - 1 HPF、収穫の卵と25ミリリットル青魚の水（皿当たり最大100の胚）を充填した100ミリメートルペトリ皿でのみ適切に開発された胚では28.5℃で保管してください。非受精卵は廃棄されます。
- 前日入質、2人の男性と女性1を配置することで、品種の大人のゼブラフィッシュ：採卵かご31と別々の水槽からなる、飼育室に（通常2 1の比率が最適な受精率を可能にします）。
- 注射のためのゼブラフィッシュ胚の作製
- 約24時間後に受精（HPF）で、100ミリメートルペトリ皿に細かいピンセットで胚をdechorionateと28.5℃で保管してください。
- ピペットを用いて30〜48 HPFの胚を収集し、魚の水25mlを270 mg / Lのトリカインを含むで満たされた「V」字状の位置決め室に転送します。簡単にマイクロ操作のために最適化自家製microloader先端ツール（自家製クリップされたマイクロローダチップ）を使用して、チャネルで正しく胚を置きます。
注：尾の筋肉注射のために上向きに尾静脈または背側に静脈内注射のために下向きに背側を向きで。
4.マイクロインジェクション手順
注：M.ためのマイクロインジェクションの手順膿瘍は、Mについて前述したものと同様ですmarinumの注射32。 Mの年表を評価するために、 膿瘍感染症（生存、細菌負荷、運動および感染の特性）が、30 HPFの胚の尾静脈内注射が好ましいです。免疫細胞の動員を可視化するために、注射は48 HPF胚における尾の筋肉であるようなローカライズされたサイトで行われます。
- CFUの数に応じて、1×PBST（中マイコバクテリア接種材料を希釈適切な注入を確認するために10％フェノールレッドを含む、ステップ2.2.6）において決定されるように投与することができます。
- microloaderチップを用いて細菌接種の5〜10μlのマイクロキャピラリー注射針をロードし、インジェクタに接続された3次元マイクロマニピュレーターのホルダーにマイクロインジェクションの針を接続して取得するために細かいピンセットで針の上を断ちます5-10ミクロンの直径を開きます。
- マイクロインジェクション圧（20-50 HPA）と時間（0.2秒）を調整することにより、注入量を調整します。
注：必要な注入量は、胚の卵黄に排出された液滴の直径を視覚的に決意ことによって較正されます。 - 尾静脈注射のために、針に面した腹側に胚を配置する（セクション3.2.2で説明したように）、および泌尿生殖器の開口部の近くに針の先端を配置し、尾静脈をターゲットに、ゆっくり胚に針の先端を押してくださいそれだけでcaudを貫通するまで、アル静脈地域。通常、約100 CFU / NLを含む1-3 NL、細菌調製物の所望の体積を実現します。
- 筋肉内注射のために、（セクション3.2.2のように）針が直面している背側に胚を置き、1体節の上に針を置き、接種物の少量（1 NL）を注入します。
注：尾静脈注射用としては、筋肉内感染も実行するために挑戦しています。ケアは、周囲の組織を傷つけることが過負荷を避けるようにしなければなりません。 - 注入処置の終わりに、7H10 OADC上にプレーティングし、CFUを計数し、続いて無菌PBSTの低下に細菌懸濁液の同じ量を注入することによって接種物のサイズを制御します。約100胚を針で注射することができます。
注：ので、ラフM.膿瘍は、針で凝集体を形成し続けることができる、注射は接種物の調製後すぐに実行する必要があります。 - 感染したFISの転送2ミリリットル/ウェル魚水を含有し、28.5℃でインキュベート24ウェルプレートで個別に時間。 1-3 NL 1×PBSTを用いて注入した胚を対照として使用することができます。
- 胚における蛍光細菌の適切な感染は、蛍光顕微鏡を使用して監視されます。
マクロファージ枯渇胚の5世代
注：組織からのマクロファージの選択的枯渇は、感染時の貢献と役割を調査するために使用されます。マクロファージの適切な枯渇を視覚化するためには、mCherryをを具体的にマクロファージ特定MPEG1プロモーター 19の制御下で発現される蛍光マクロファージ、トランスジェニックラインを使用することをお勧めします。
- リポクロドロネートベースの手順
注：リポクロドロネート手順は、組織からのマクロファージの選択的枯渇（ただし、好中球）19を可能にします。この化合物は、胚の生存率を変えることも、AFんもありません細菌の整合性をfect。リポソーム封入クロドロネートを調製するための詳細なプロトコールは、以前に報告されている33。- 24 HPFで、胚をdechorionateと3.2.2で説明したように、注入手順の終わりまで麻酔状態で胚を維持するために、トリカインを補った魚の水で満たされた「V」字型の注射皿にそれらを転送します。下向きに背側に向けます。
- リポソーム封入クロドロネート（リポクロドロネート）とマイクロキャピラリー注射針をロードし、3次元マイクロマニピュレーターのホルダーにマイクロインジェクションの針を接続し、10μmの先端開口径を得るために、細かいピンセットで針の上を断ちます。
- 注入量を較正するために、0.2秒に20ヘクトパスカルと注入時間にマイクロインジェクション圧を調整します。尾静脈をターゲットに、泌尿生殖器の開口部に近い針の先端を置き、ゆっくりに針の先端を押してください胚それだけで尾静脈領域とを貫通して、溶液の所望の容量（2-3 NL、3回）を提供するまで。
注：リポクロドロネートサスペンションは非常に粘着性であり、胚の血管系と殺害を阻止回避するために、注射前にボルテックスする必要があります。これは、少量のいくつかの連続した注射に進むことが重要です。 - 魚の水を含む100ミリメートルペトリ皿に胚を移し、感染するまで28.5℃で保管してください。
- 蛍光顕微鏡によりマクロファージの適切な枯渇を制御します。
注：完全なマクロファージの枯渇は、リポclodoronate投与後4日間有効です。
- モルホリノベースの手順
- 産卵、飼育室でプラスチック障壁によって分離された2人の男性と女性1を配置することで品種大人のゼブラフィッシュの前日。
- 次の日には、光がゼブラフィッシュ施設でオンになり、その後≈30分は、分離障壁を取り除きます雄と雌。受精率を最適化するために、産卵の開始後、約20分間待ちます。卵を採取し、冷青魚の水（4°C）を充填した100 mmのペトリ皿にそれらを転送することによって、開発を遅らせます。
注：産卵の制御は、モルフォリノベースの実験のために重要です。モルフォリノは、4つのセルの段階までの卵に注入することができます。 - ピペットを用いて卵を収集し、冷たい青魚の水で満たされた「U」字型に射出チャンバ内の卵を下に堆積し、自家製microloader先端ツールを使用して、チャネル内の卵をブロックします。
- 以前に19を説明したように、フェノールレッドを10％含有するPU.1ホリノソリューションを準備します。 obtaiに細かいピンセットで針の先端を切り離した後、モルホリノ準備とマイクロキャピラリー注射針をロードし、3次元マイクロマニピュレーターのホルダーにマイクロインジェクションの針を接続します5-10ミクロンのNA先端開口径。
- 注入量を較正するために、0.2秒20〜50ヘクトパスカルと注入時間にマイクロインジェクション圧を調整します。卵の近くに針の先端を置き、そっと卵に絨毛膜を介して針の先端を押して、希望のモルホリノ溶液容量を実現、通常は3-5 NL。
- マイクロインジェクション後に、魚の水に100 mmのペトリ皿に卵を転送し、感染の手順を開始するまで28.5℃でインキュベートします。
- 30〜48 HPFで蛍光顕微鏡によるPU.1のモルファントにおけるマクロファージの適切な（完全な）枯渇を分析します。。
注：注入濃度に依存して、p個のU.1のモルホリノはまた、初期の好中球数に影響を与え得ます。好中球の数を変更することなく、マクロファージの適切な枯渇を確認するために、GFPで（蛍光マクロファージおよび好中球との二重トランスジェニックゼブラフィッシュラインを使用することをお勧めします特にMPXプロモーターによって駆動される式）19。
6.細菌負荷の定量化
- CFU列挙によって決意
- 所望の時点で1.5 mlマイクロチューブ（1胚/チューブ）に（条件につき5）感染胚のグループを収集し、10分間氷上でインキュベートすることにより、胚を凍結麻酔及びトリカインの過剰摂取を使用して安楽死させる（300〜 500ミリグラム/ L）
- 二回滅菌水で胚を洗浄し、新しいチューブにそれらを分配、溶解すると各胚2％トリトンX-100 26-G針を使用し、完全に溶解するまで、懸濁液を均質化1、X PBSTで希釈しました。遠心サスペンションと1×PBST中でペレットを再懸濁は、供給業者により推奨されるように、0.05％Tweenでホモジネートの80段階希釈をミドル7H10 OADC上にメッキされ、BBL MGIT PANTAを補いました。
注：M. NaOHをtreatmenの影響を受けやすいという膿瘍Mよりトンmarinumの、Mに影響を与えることなく、魚の溶解物の除染膿瘍成長が正常BBL MGIT PANTA抗生物質カクテルを用いて達成することができます。 - 30℃で4日間プレートをインキュベートし、コロニーをカウントします。
- 蛍光ピクセルによって決意は、ライブ胚における（FPC）の測定値をカウント
注：蛍光発光を介した細菌負荷を決定するためには、感染した胚の連続画像を取得すると、FPC（粒子解析による細菌の同定）により測定された蛍光強度は、ImageJのフリーウェア用に開発された手作りのマクロを使用します。粒子解析は、背景から関心のある蛍光シグナルを識別することを可能にする閾値範囲に依存しているバイナリ黒と白のイメージが必要です。- 3.2.2で説明したように所望の時点で、35ミリメートルペトリ皿で感染した胚（条件当たり5-10）をtricain-麻酔。
- 水とsubmeを削除RGE胚および魚水中の1％低融点アガロースと全体食器表面は、次に横方向に胚を整列させます。トリカインを含む魚の水で凝固したアガロースをカバー。
- 10のX目的とした落射蛍光顕微鏡を用いて、全胚の蛍光画像を取得します。
注：蛍光画像の取得は、FPCの測定手順の重要なステップです。これは、色校正プローブを較正し、モニタを使用することが重要です。取得信号の飽和を防止する間に露出の最適時間を調整することで、最小限のバックグラウンドを得ました。画像は、8ビットTIFF形式でなければなりません。同じ設定は、定量的な目的のために全体の実験中に保持されます。 - 自家製microloaderの先端工具と胚から慎重にアガロースを削除します。必要に応じて、これらの胚は、その後の分析のために使用することができます。細菌負荷の定量化の前に、各画像は品質を制御しなければなりません。まで画像をnalyze、魚ごとのFPCに蛍光強度を変換し、ImageJのフリーウェアを開きます。
注：Mを使用して、前述のように、FPC値は、細菌負荷を反映していますmarinumの34。 - 感染していない胚の画像を用いた画像解析に必要な閾値を決定する（いくつかの対照胚は平均閾値を得るために用いることができます）。 （ゼロであるべきである、すなわち、背景を得るために）→→しきい値を調整して、背景が真っ黒になるまで右にしきい値ウィンドウに下部スライダーを画像に移動します。対応する値を記録します。
- 画像J内では、FPCマクロ（補足ファイル）を開いて、画面の指示に従います。測定される画像のフォルダを検索し、以前に決定されるようなしきい値を入力し、「OK」をクリックしてください。
注：マクロが自動的にバックグラウンドを減算します。閾値が適用されます。蛍光信号が同定されています粒子解析、次のfiedが。 - コピーは、データ分析のために必要なソフトウェアを要約ウィンドウからデータを貼り付けると。
注：CFUの決意の方法とは対照的に、FPCの方法は、非侵襲的であり、力学の監視、重要なことは、その後の分析のための胚を再使用し、可能/個別に細菌負荷の動力学。それは、従って、かなり倫理規則と一致して、動物の数を減らすことを可能にします。
7.イメージングM.感染した胚abscessus-
- Mのライブイメージング膿瘍感染
- マウントトリカイン麻酔胚（3.2.2を参照）落射蛍光顕微鏡観察の前に35mmのペトリ皿中の1％低融点アガロースで。倒立型共焦点顕微鏡または直立共焦点顕微鏡のための単一のキャビティうつ病のスライドガラスボトムディッシュを使用します。希望の位置とカバーに胚を配向トリカインを含む魚の水でアガロース固化しました。
- 胚全体の順次蛍光取得送信画像のための10のX目的とした落射蛍光顕微鏡を使用してください。また、感染後の免疫細胞の活性を可視化するために40Xや63X目標に共焦点顕微鏡を使用しています。
- イメージング固定M.膿瘍感染した胚
- 6.1.1で説明したように胚を安楽死させるし、4℃で、RTまたはO / Nで2時間1×PBST中4％パラホルムアルデヒド中で胚を1.5ミリリットルマイクロ遠心管に転送して修正。 10分間1×PBSTで二回、胚を洗浄することにより、パラホルムアルデヒドを除去します。
注：蛍光を維持するために、固定された胚は、光から保護されなければなりません。 - 組織蛍光の完全性を維持するために、胚のために、（1×PBST中で希釈し10、20、30、40および50％）、グリセロール濃度溶液の増加を連続的にインキュベートします条件ごとに10分。
注：固定胚を4℃で50％グリセロール中で数ヶ月間保存することができます。 - 閲覧室（ 図1B）31で50％グリセロール中に埋め込 まれた胚を置きます。
- 共焦点顕微鏡で40Xや63X目的を用いた画像。
- 6.1.1で説明したように胚を安楽死させるし、4℃で、RTまたはO / Nで2時間1×PBST中4％パラホルムアルデヒド中で胚を1.5ミリリットルマイクロ遠心管に転送して修正。 10分間1×PBSTで二回、胚を洗浄することにより、パラホルムアルデヒドを除去します。
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Representative Results
様々な解剖学的部位32を注入することができるが、尾静脈注射は、多くの場合、生存実験では、細菌負荷の決意、食作用活性またはコード形成を含む後続の分析のための全身感染を生成するために使用されます。尾の筋肉内注射は、注射部位（ 図3A）でのマクロファージの動員を評価するために使用されます。 Mの RとSの変異体の病原性を調査し、比較するために、 膿瘍 、蛍光細菌の懸濁液は、30 HPFの胚（ 図3A）19の尾静脈内に注入されます。 S変異体とは対照的に、Rの形態型は、中枢神経系（CNS）（ 図3C）内膿瘍、細菌の急速な発展によって特徴付けゼブラフィッシュ胚（ 図3B）で、より堅牢で致命的感染を引き起こします。 RとSバリアントの両方で全身注射は、CNSの感染症と差につながります病理学および病原性の表現型は、蛍光顕微鏡観察（ 図3C）により、魚あたりCFU（ 図3D）を列挙することによって、または取得された画像のFPC（ 図3E）を決定することによってのいずれかで定量することができます。重要なことは、CFUとFPCの決意は相関し、3と5 dpiでのS株よりもR株に対してより大きな細菌負荷に指摘されています。全体として、これらの結果は、感染プロセスの年表を研究するために、感染の関連および非侵襲的なモデルとしてゼブラフィッシュをサポートしています。
おそらく最も壮観な機能の一つは、R変異体（ 図4）に感染した胚のCNS 内で蛇行コードを可視化することができ、ビデオ顕微鏡によって明らかになりました。胚の光透過性のおかげで、R-コード形成の運動がextを複製するためにR変異体の高い傾向を示し、非侵襲的に監視し、画像化することができましたracellularly。セルラ/組織破壊と組み合わせて、この制御されない複製速度は、急速に膿瘍および最終的に死亡幼虫の開発につながります。
マクロファージがマイコバクテリア感染の間に、特に、肉芽腫形成35を駆動することにより重要な役割を果たすことが知られています。二つの相補的な戦略は 、M を研究するために使用することができマクロファージ枯渇胚における膿瘍成長/毒性：リポ- clodronate-およびモルホリノベースの手順（ 図5A）。ビデオ顕微鏡（ 図5B）によって明らかにされたように、R変異体は非常に急速な死に至る、細菌負荷とコードの生産の大幅な増加につながるとマクロファージ枯渇胚の感染（3 dpiで100％死んだ胚; 図5C） 。これは明らかに、マクロファージは、Mを制御する必要があることを示し膿瘍感染。
さらに、マクロファージの役割を調べるため感染時に、赤色蛍光マクロファージ（MPEG1：mCherryを）を保有する特定のトランスジェニック胚は、19を使用することができます。 Mの注入尾の筋肉内または尾静脈にわさびを表現膿瘍感染部位で、主にマクロファージ、骨髄細胞の顕著な動員を誘導します。この動員は、個々の細菌の効率的な食作用（ 図6A-6B）をもたらします。マクロファージの存在にもかかわらず、共焦点顕微鏡は、マクロファージが（ 図6C）を貪食することができない大規模な細菌のコードの外観を明らかにする。まとめると、これらの知見は、マイコバクテリアの食作用を防止するのによれの役割に基づいて、免疫回避の新しいメカニズムを強調表示します。
図3. M.ゼブラフィッシュ胚における膿瘍感染。 >（A）（上部パネル）の蛍光Mを注入することによって行わ静脈内感染膿瘍 30 HPFの胚に、尾静脈（矢印1）、泌尿生殖器の開口部に後方に（白で示されています）。 （下のパネル）の蛍光マイコバクテリアを注入することによって行わ筋肉内感染が48 HPF胚において、体節（矢印2）の上に尾の筋肉内（白で示されている）。30 HPFの胚静脈内tdTomato- M.に感染した（BE） 膿瘍 （RおよびSバリアント）。（B）≈300 CFU RまたはSのいずれかに感染した胚の生存曲線は、変異体またはPBSコントロールを注射した（n = 20）。 3つの独立した実験からの代表的な結果を示す。RまたはSのいずれかの変異体（C）の時空間可視化を様々な時点でtdTomato（白）を発現する蛍光ライブイメージングによって行わ感染後ポイント。各株について、全体の感染胚の代表的蛍光および透過オーバーレイがshoです WN。同じ胚3,5解像度で画像化した。RまたはSのいずれかの変異体に感染した胚中に（DE）細菌負荷（≈200 CFU）溶解物から（D）または FPC 測定（E）（D）の CFU計数CFUによって決定種々の時点で個々の胚の感染後は、BBL MGIT PANTAを補っミドル7H10 OADC上にプレーティングすることにより決定しました。結果は、種々の時点で3つの独立した実験（N = 5）。個々の生活の胚から（E）FPC測定から胚あたり±SD（水平バー）CFUログはImageJのを用いた粒子の分析に基づいて、感染後ポイント平均として表されます。 3つの独立した実験からの胚あたりのSD（水平バー）FPC±対数平均として結果が表現された（n = 5）。すべての画像は、デジタルカラーカメラを備えた落射蛍光顕微鏡を用いて得ました。 T = "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Mの R変種を静脈内感染R変異体のin vivoでのコーディングでは 、図4。30 HPFの胚膿瘍と様々な時間で画像化は、コード形成の進行を可視化するため、感染後を指します。赤い矢印は、コードの時空間的変化を追跡するために、固定基準点として使用されます。成長蛇行コードを含む尾の部分のDIC画像は（カラーカメラを備えた顕微鏡）を四角で囲んであります。スケールバー：100ミクロン、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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マクロファージの図5.枯渇は増加したコードの増殖につながる。（A）胚は、リポ-クロドロネートベースのプロシージャまたはモルホリノベースの手順を使用して枯渇しています。胚：（上部パネル）クロドロネート-カプセル化されたリポソーム（リポクロドロネート）は24 HPF のTg（mCherryをMPEG1）に静脈内注射します。循環内では、リポ - クロドロネートは急速に、その後のアポトーシスを受けるマクロファージに包まれています。ゼブラフィッシュの卵：ノックダウンするPU.1遺伝子の発現を受精のTg（mCherryをMPEG1）にモルフォリノ準備の（左下パネル）注射。 （ - ）。（右ダウンパネル）胚におけるマクロファージの正しい枯渇は（BC）30 HPFマクロファージ含有（+）またはマクロファージ枯渇蛍光顕微鏡によって確認された（リポクロドロネート処置後の）胚M.に感染していますtdTomatoを発現している膿瘍 Rが（白で表示）。（B） のM.に感染したマクロファージ含有又はマクロファージ枯渇胚の（C）生存曲線膿瘍 R（N = 20）。 3つの独立した実験からの代表的な結果を示します。すべての画像はカラーカメラに接続されている顕微鏡で取得した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
M.で、ローカルまたは全身感染した胚におけるマクロファージの図6.挙動膿瘍 （A）48 HPF のTg（MPEG1：mCherryを）。ゼブラフィッシュの胚は、わさびを発現するM.を筋肉内に感染しています膿瘍 R.ライブimagi個々のマイコバクテリア（分単位で感染後、MPI）を貪食マクロファージ募集を可視化するために、共焦点顕微鏡を用いてngの。 （40X APO水0.8のNAを目的とした共焦点顕微鏡）注射部位にマクロファージ（赤）の強烈な募集を示す最大値投影。スケールバー：20μmの（BC）48 HPF のTg（MPEG1：mCherryを）。静脈内M.に感染した胚Rはわさびを発現膿瘍固定し、撮像された共焦点顕微鏡（40X）で4 HPI（B）で3解像度（C）（B）マクロファージの最大強度投影（赤）または他の骨髄細胞、おそらく好中球（矢印）を含有しました。分離されたマイコバクテリア注射部位に近い（緑）（63X APO油1.33のNAを目的とした共焦点顕微鏡）。スケールバー：10μmの（C）最大強度投影コード（緑）（63X APO油1.33 NAの対物レンズで共焦点顕微鏡）を貪食することができない1マクロファージ（赤）を示します。スケールバー：5μmのこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュは最近、リアルタイム36に広い視野と共焦点イメージングを用いて細菌感染症のダイナミクスを研究するための優れた脊椎動物のモデル系として浮上しています。一緒にマイクロインジェクション法（プロトコル4）と分散マイコバクテリア懸濁液（プロトコル2.2）の組み合わせは、再現性の全身感染症、およびその後のモニタリングとホストマクロファージと細菌の相互作用に焦点を当てた特別な感染の進行の可視化を可能にします。 Mの病原性生体内での膿瘍は、野生型ゴールデンゼブラフィッシュ 37の使用のおかげで調べることができます。 M.間の相互作用を研究するために、骨髄細胞を膿瘍 、ホスト、いくつかのトランスジェニックゼブラフィッシュ系は、Tgは（MPEG1：mCherryを）として使用することができ、マクロファージ19を可視化します 。 38またはTgは（LYZ：DsRedを ）39ワット ：などのTg（GFP MPX）などの追加のトランスジェニックレポーターラインi番目のいずれかの好中球の赤、緑、それぞれ、また、感染に応答してこれらの顆粒球の特定の役割に対処するために使用することができます。
M.の膿瘍、特にR変異体は、このようにして再現性のマイクロインジェクションを防止する、大規模な細菌の凝集体19を形成する自然な傾向を示します。また、Sバリアントよりも事実のR変異型はるかに大きな塊はまた、2つの同質遺伝子変異体についての病原性表現型の潜在的な比較を妨げます。セクション2に記載されているプロトコルは、同種得ることを可能とMを分散しました胚におけるマイクロインジェクション用の膿瘍懸濁液。この調製物は、過度の凝集特性を示す任意の他のマイコバクテリア種または変異株にも適用することができます。超音波処理工程は、最も外側のマイコバクテリア細胞壁層を変化させることができるので、注意がEの細菌の生存率に対するこの物理的処理の影響を評価するために取られるべきです新しい菌株をACH。
細菌負担の決意は、日常的にプロトコル6.1で説明したように、種々の時点感染後に選択寒天培地上で溶解された胚をめっき後カウントCFUに依存しています。この手順は、いくつかの制限を含む：動物を安楽死させているので、それぞれの胚（または胚の群）は、単一の時点の決意のために使用することができます。さらに、この方法が原因溶解中に殺害され、および/または失われた細菌、その後の連続希釈液の大部分に、または主に凝集することにより不正確なまま。 CFUを数えることも面倒な作業です。別の方法として、プロトコル6.2 Mを定量化するための効率的な方法を記載M.のために独自に開発したように、画素定量に感染した胚の蛍光画像の分析に基づいて、限られた取り扱いステップを含む膿瘍負担marinumの 40,41。粒子の分析に基づいて、このFPCの方法は、良好な相関を示しているワットCFUのcountings番目。同様に、蛍光顕微鏡および定量化を組み合わせることにより、胚あたりの自然免疫細胞数の相対的変化は、適切なトランスジェニック系統を用いた画像解析により定量することができます。
ゼブラフィッシュ胚は、感染中の免疫細胞の役割を評価するために使用することができ、マクロファージ枯渇に悪影響M.に応答して宿主の生存に影響を与えることが見出されました膿瘍感染。特定のマクロファージの枯渇は、効率的にリポクロドロネートベースの手順（プロトコル5.1）またはモルホリノに基づく手順（プロトコル5.2）を使用して生成することができます。マクロファージの存在を確立し、血管系の維持のために、正しい胚発生に重要であるので、それにもかかわらず、それはリポクロドロネートを使用して、HPF 24でマクロファージの生産を切除することをお勧めします。
ゼブラフィッシュの胚は 、M を研究するユニークなモデルとして表示されます膿瘍感染症やextracellの役割ウラル免疫系subversionの戦略としてコーディング。決定は、Mによれを制御する場合膿瘍を識別することができ、彼らは、革新的な治療選択肢の開発につながる可能性があります。革新的なハイスループット技術42と一緒にゼブラフィッシュの使用をリンクすることも、薬物の発見およびこの薬剤耐性病原体に対する新しい薬理学的ア プローチにフィールドを開きます。
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Acknowledgments
著者は、有益な議論のために、それぞれtdTomatoとわさびの発現を可能にpTEC27とpTEC15の寛大な贈り物のためにリポ - クロドロネートとL.ラマクリシュナンを提供するためのK.喫茶に感謝しています。フランス国立研究機構（ANR ZebraFlam-10-MIDI-009とDIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01）と欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7-PEOPLE-2011-ITN）のプロジェクトのこの作品の一部を形成しますグラント契約に基づきなし。 PITN-GA-2011-289209マリー・キュリー初期研修ネットワークFishForPharmaため。私たちは、CMデュポンに資金を提供するために協会グレゴリーLemarchalとVaincreラMucoviscidose（RF20130500835）を感謝することも望みます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBL MGIT PANTA | BD Biosciences | 245114 | |
| Bovine Serum Albumin | Euromedex | 04-100-811-E | |
| Catalase from Bovine Liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Difco Middlebrook 7H10 Agar | BD Biosciences | 262710 | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Paraformaldehyde | Delta Microscopie | 15710 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | 319244 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P4780 | |
| Agar | Gibco Life Technologie | 30391-023 | |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich | ||
| Instant Ocean Sea Salts | Aquarium Systems Inc | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter instrument Inc | BF100-78-10 | 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D. |
| Micropipette puller device | Sutter Instrument Inc | Flamming/Brown Micropipette Puller p-87 | |
| Microinjector | Tritech Research | Digital microINJECTOR, MINJ-D | |
| Tweezers | Sciences Tools inc | Dumont # M5S | |
| Microloader Tips | Eppendorf |
References
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