Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

abscessus Mycobacterium הוא הפתוגן מתעוררים שגורם ספקטרום רחב של תסמונות קליניות בבני אדם. אלה כוללים זיהומים עוריים, כמו גם זיהומי ריאות כרוניים קשים, בעיקר נתקלו במדוכאי חיסון וחולי סיסטיק פיברוזיס 1,2,3,4. מ ' abscessus גם נחשב למינים צומחים במהירות גדול mycobacterial אחראים לזיהומי nosocomial וiatrogenic בבני אדם. יתר על כן, לאחרונה פורסם מספר מחקרים הדגישו את האפשרות שמ ' abscessus יכול לחצות את מחסום דם-המוח ולגרום לנגעים חשובים במערכת העצבים המרכזית (CNS) 5,6. למרות היותו מגדל מהיר, מ ' תערוכות abscessus גם כמה תכונות פתוגניים הקשורים לאלה של שחפת Mycobacterium, כולל היכולת לשתוק במשך שנים בתוך מבני granulomatous וליצור נגעי caseous בריאות 7. יותר מדאיג היא סן הנמוכהsitivity של מ ' abscessus לאנטיביוטיקה, טיוח זיהומים אלה קשים מאוד לטיפול מוביל לשיעור כישלון טיפולי משמעותי 8,9. האיום החשוב של מין זה הוא בעיקר התנגדותו הפנימית לאנטיביוטיקה, אשר היא דאגה מרכזית במוסדות בריאות ציבוריים 10 ונגד להשתלת ריאה 11.

מציג abscessus מ morphotypes מושבה (R) חלק (S) או מחוספס שיובילו לתוצאות קליניות שונות. בניגוד למתח S, יש לי חיידקי R נטייה לגדול קצה לקצה, שהוביל לחבל או כמו חוט-מבנה 12,13. מספר מחקרים עצמאיים המבוססים על מודלים או סלולריים או בעלי חיים גילו את הפנוטיפ היפר-האלימות של R morphotype 14,15. ממחקרים אפידמיולוגיים, במקרים החמורים ביותר של מ ' זיהומי ריאות abscessus מופיעים להיות מזוהים עם R גרסאות 16 שהגרסה היחידה שכבר ראה להתמיד במשך שנים במארח נגוע 3. הבדל morphotype מסתמך על הנוכחות (בS) או הפסד (בR) של glycopeptidolipids הקשורים משטח (GPL) 12. עם זאת, בשל המגבלות המובנות של הדגמים סלולריים / בעלי החיים הזמינים המשמש כיום ללמוד מ ' זיהום abscessus, הידע שלנו על אירועי pathophysiological של גרסאות R או S נותר מעורפל. זיהום של עכברים חיסוניים מוסמכת באמצעות נתיבים תוך ורידי או תרסיס מוביל להתישבות ארעית, המעכב את השימוש בעכברים ללמוד זיהומים מתמשכים ולin vivo בדיקת רגישות לסמים 17. לכן, פיתוח מודלים של בעלי חיים ניתנים למניפולציה של תגובת המארח הוא אתגר גדול. בהקשר זה, מודלים שאינם יונקים של זיהום פותחו לאחרונה, כולל דרוזופילה melanogaster 18 שמציעה מספר יתרונות כגון עלות, מהירות וo קבילות האתיתVer מודל העכבר. מודל דג הזברה (Danio rerio) של זיהום גם נחקר לדמיין, על ידי הדמיה לא פולשנית, ההתקדמות והכרונולוגיה של מ ' זיהום abscessus בחי 19. חשוב לציין, הוכחה של קונספט הוקמה גם כדי להדגים את התאמתה לin vivo הערכות אנטיביוטיות נגד מ ' abscessus 17,20.

דג הזברה הייתה בשימוש נרחב בשני העשורים האחרונים ללמוד את יחסי הגומלין בין פתוגנים שונים והמערכת החיסונית מארח 21. ההצלחה הגוברת של מודל חוליות חלופה זו מסתמכת על הזדמנויות גדולות וייחודיות שהניעו ומאומתים השימוש בו להבנה טובה יותר של זיהומים נגיפיים וחיידקיים רבים 19,22,23,24,25,26,27,28,29. בניגוד למרבית המודלים של בעלי החיים האחרים, עוברי דג הזברה הם שקופים אופטי, המאפשרים הדמיה הקרינה בלתי פולשני 30. זה חהשעות הובילו ללמוד מ ' abscessus נגוע עוברי דג הזברה עם פרטים חסרי תקדים, שהגיע לשיא עם התיאור של cording תאי, המייצג דוגמא לגמישות מורפולוגיים בקטריאלי. Cording מייצג מנגנון חדש של חתרנות של מערכת החיסון ומנגנון מפתח קידום פתוגנזה של מ 'החריף זיהום abscessus 19.

דו"ח זה מתאר כלים ושיטות חדשים באמצעות עובר דג הזברה לפענח את תכונות pathophysiological של מ ' abscessus זיהום וללמוד את יחסי הגומלין ההדוקים בין מערכת החיסון המולדת החיידקים ו. ראשית, פרוטוקול microinjection מפורט הכולל עיבוד של הבידוד החיידקים, הכנת עובר, וזיהום כשלעצמו, מוצג. שיטות מותאמות במיוחד כדי להעריך מ ' ארסיות abscessus על ידי מדידת פרמטרים שונים, כגון הישרדות מארח וניטל חיידקים, מוצגות. דגש מיוחד יינתן לאופןכדי לפקח, ברמת spatiotemporal, הגורל והתקדמות של הזיהום ואת התגובה החיסונית מארח למ ' abscessus באמצעות מיקרוסקופ וידאו. יתר על כן, כדי לחקור את התרומה ואת התפקיד של מקרופאגים במ ' abscessus זיהום, שיטות להפקת מקרופאגים מדולדלים עוברים (תוך שימוש בגישות או genetically- או מבוססות כימי) מתוארים. לבסוף, פרוטוקולים כדי להמחיש את האינטראקציות הספציפיות עם מקרופאגים או נויטרופילים או באמצעות עוברים קבועים או חיים מתועדים.

מטרת דו"ח זה היא לעורר מחקרים נוספים כדי לשפוך אור חדש לתוך מ ' מנגנוני abscessus אלימות ובמיוחד את התפקיד של cording בהקמת תהליך זיהום חריף ובלתי מבוקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוצדורות דג הזברה לעמוד בתקנות מוסדיות וממשלתיות הרלוונטיות. לצורך המחקר הנוכחי, ניסויי דג הזברה נעשו במונפלייה האוניברסיטה, על פי הנחיות של האיחוד האירופי לטיפול בחיות מעבדה (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) ואושרו על פי ההתייחסות CEEA-LR-13007.

1. הכנת ריאגנטים וציוד Microinjection

  1. הכן מים דגים על ידי המסת מלח ים אוקיינוס ​​0.06 גרם מיידי במים מזוקקים 1 ליטר 31, אז החיטוי לעקר (120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות) וחנות על 28.5 מעלות צלזיוס עד 1 בחודש.
  2. הכן פתרון מתילן כחול על ידי המסת 1 גרם של מתילן הכחול במים מזוקקים 1 ליטר. להוסיף 300 μl של פתרון מתילן כחול במי דגי 1 ליטר להשיג מים דגים כחולים, אז החיטוי לעקר ולאחסן ב 28.5 ° C עד 1 חודש.
    הערה: additiעל מתילן כחול במי דגים מונע צמיחת עובש.
  3. הכנת בופר פוספט (PBS)
    1. הכן פתרון מניות X PBS 10 על ידי המסת 5.696 גרם Na 2 HPO 4, KH 680 מ"ג 2 PO 4, 969 מ"ג KCl ו78.894 גרם NaCl בL 1 מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH 7.0 עם HCl. כדי להשיג 1 X PBS, לדלל של פתרון 10 X PBS ב900 מיליליטר מים מזוקקים וחיטוי 100 מיליליטר במהלך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס לעקר.
    2. להוסיף 0.05% Tween 80 להשיג 1 X PBST ולאחסן ב RT עד 1 שנה.
  4. הכן העשרה אולאית חומצת דקסטרוז Catalase (OADC) על ידי המסת 8.5 גרם NaCl, 50 גרם בסרום שור אלבומין, D-גלוקוז 20 גרם, 40 מ"ג Catalase מהכבד בקר ו0.5 גרם של חומצה אולאית במים מזוקקים 1 ליטר אז לסנן לעקר את הפתרון ו לאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  5. הכן של חומצת אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonic (tricaine) פתרון מניות, 100 מיליליטר ידי המסת 400 מ"ג tricaiאבקת ne ב97.9 מיליליטר מים מזוקק. להוסיף 2.1 מיליליטר של 1 M טריס (pH 9) כדי להתאים את ה- pH 7.0 ובלאחסן את הפתרון ב -20 ° C.
  6. הכן את מחטי הזרקת microcapillary ידי משיכת נימי זכוכית בורוסיליקט (X OD 1 מ"מ 0.78 מזהה מ"מ) באמצעות מכשיר חולץ micropipette עם ההגדרות הבאות: לחץ אוויר 650; מחממים 999; משוך 50; מהירות 80; זמן 200.
  7. הכן פתרון אגר 1.5% במי דגים כחולים ולשפוך 25 מיליליטר של אגר נמס ב100 מ"מ צלחות פטרי. בחלק העליון של אגר נמסו, הנח תבניות תוצרת בית כדי להטביע ערוצים ספציפיים. ערוצי -shaped "V" המשמשים לעוברי עמדה בעוד צורה "" U משמש לביצים (איור 1) 31. ברגע שהתגבש, להסיר בזהירות את החותם.
    הערה: מכסה את אגר במי דגים כחולים כדי למנוע התייבשות וחנות על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים.

איור 1 איור 1. תאי מיקום לזריקות דג הזברה. (א) ערוצים בצורה U לביצים (פנל משמאל) וערוצים בצורת V לעוברים (פנל מימין). ביצי דג הזברה / עוברים מוטלות בערוצים ומיושרים לאורך אותו הציר. תאים מציג (ב) לתצפית מיקרוסקופית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. הכנה ואחסון של מ ' abscessus הבידוד

  1. תנאי גידול abscessus מ '
    1. צלחת החוצה מ ' abscessus ממניות גליצרול -80 ° C על אגר מידלברוק 7H10 המכיל 10% של OADC וגליצרול 0.5% (7H10 OADC) והשלים עם האנטיביוטיקה המתאימה בהתאם לסמן ההתנגדות בוצע על ידי וקטור קידוד חלבון פלואורסצנטי. דגירה הצלחותבמעלות צלזיוס 30 ל4-5 ימים.
    2. להרים מושבה mycobacterial הקרינה חיובית ולחסן 1 מיליליטר מרק מידלברוק 7H9 בתוספת OADC, גליצרול 0.2%, 0.05% Tween 80 (7H9 OADC / T) עם האנטיביוטיקה הנדרשת בצינור פלסטיק סטרילי 15 מיליליטר. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך שבוע 1 בלי ללחוץ.
      הערה: Tween 80 מגביל clumping וצבירת חיידקים.
    3. Resuspend מראש התרבות שהושגה ב2.1.2 ב 50 מיליליטר מידלברוק 7H9 OADC / T ב150 סנטימטר 2 צלוחיות תרבית רקמה ל0.1 OD 600 סופיים (מקביל לכ 5.10 7 חיידקים / מיליליטר) ודגירה נוספת על 30 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים להשיג תרבות גדלה באופן אקספוננציאלי-(OD 600 = 0.6-0.8).
      הערה: כדי למזער להתנהל בכבדות, במיוחד של הגרסה מחוספס, דגירה לא תעלה על 5 ימים. שני גרסאות חלקות ומחוספסות להציג שיעור צמיחה דומה.
  2. הכנת מ ' inocula abscessus60;
    הערה: בשל נטייה גבוהה של מ 'הגס abscessus כדי ליצור אגרגטים גדולים ולייצר מיתרים, טיפול ספציפי יש צורך ליצור inocula הומוגנית וכמותית מבוקרת לפני microinjections בעוברים. טיפול זה חל גם על חלקת חיידקים המייצרים אגרגטים, אם כי ליותר מהזן מחוספס במידה פחותה.
    1. הקציר באופן אקספוננציאלי-צומח תרבויות מ -150 סנטימטר 2 צלוחיות תרבית רקמה על ידי צנטריפוגה ב 4, 000 XG במשך 15 דקות ב RT בצינור פלסטיק 50 מיליליטר סטרילי וresuspend גלולה החיידקים בOADC 1 מיליליטר 7H9 / T. Aliquot 200 μl של השעיות חיידקים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
      הערה: עבודה עם נפחים קטנים ב 1 מיליליטר מזרקים יש צורך לקבל השעיות הומוגנית מאוד.
    2. Homogenize השעיות חיידקים עם מחט 26-G (15 רצפים מעלה ומטה), שלוש פעמים sonicate במשך 10 שניות (עם 10 שניות הפסקות בין כל sonication sequence) באמצעות sonicator waterbath. הוסף 1 מיליליטר של 7H9 OADC / T ובקצרה מערבולת. צנטריפוגה דקות 3 ב 100 x גרם.
    3. לאסוף בזהירות את supernatants המכיל mycobacteria להימנע הגושים וברכת ההשעיות הומוגנית בצינור פלסטיק סטרילי 50 מיליליטר.
    4. בדקו חזותי לנוכחות של אגרגטים חיידקים שנותרו סופו של דבר.
      הערה: אם מצרפים עדיין קיימים, המשך לצעד נוסף בצנטריפוגה XG 100 במשך 2 דקות, ולאסוף את supernatant.
    5. צנטריפוגה ההשעיה ב 4000 XG במשך 5 דקות, resuspend גלולה ב200 OADC μl 7H9 / T ולהמשיך להזרקה.
    6. להעריך את ריכוז החיידקים הסופי על ידי ציפוי דילולים סדרתי (ב 1 x PBST) ב7H10 אגר OADC וספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU) לאחר דגירה 4 ימים על 30 מעלות צלזיוס. CFUs צריך להיקבע עבור כל אצווה חדשה.
    7. הכן מניות inocula קפוא על ידי אחסון 5 aliquots μl ב -80 & #176; C.
      הערה: הערכת CFU של aliquots מעלות צלזיוס הקפוא -80 היא תנאי מוקדם כדי לקבוע את מספר חיידקי קיימא המדויק כמו הקפאה / הפשרה עשויה להשפיע כדאיות חיידקים של הבידוד. inocula קפוא אלה הם מוכנים לשימוש לזריקות שלאחר מכן. מאז כל aliquots מכיל את אותו מספר CFU, הם מאפשרים הזרקת חיידקים באופן שחזור מניסוי אחד למשנהו.
  3. בקרת איכות הבידוד
    הערה: מכתים Ziehl-Neelsen (ספציפי לmycobacteria) ניתן להשתמש כדי להשוות את האיכות של השעיות חיידקים לפני ואחרי הליכי הומוגניזציה מתוארים ב2.2.
    1. ספוט ופרוש טיפה אחת של ההשעיה חיידקים הומוגני בשקופית זכוכית ולאפשר לו להתייבש לחלוטין, לתקן למרוח לפחות 30 דקות על פלטה חשמלית מוגדרת 65-70 המעלות צלסיוס וכתם באמצעות פרוטוקול מכתים Ziehl-Neelsen .
    2. שים לב למריחת החיידקים במיקרוסקופ באמצעות 100מטרת X ולהשוות עם כתם של השעיה חיידקים-מעובד שאינו (איור 2).

איור 2
הכנת איור 2. של מ 'המפוזר inocula abscessus. מכתים Ziehl-Neelsen של R או S גרסאות גדל על מדיום מרק לפני כל טיפול (לוחות העליונים) או לאחר טיפול (לוחות נמוכים יותר) כדי להקטין את הגודל ומספר אגרגטים mycobacterial (צעדים רצופים של לשטיפה, sonication וdecantation) . חיידקים נצפו באמצעות מיקרוסקופ עם 100 X APO שמן 1.4 מטרת NA). ברים סולם:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. הכנת עוברי דג הזברה

  1. השרצה ואיסוף ביצי דג הזברה
    1. היום לפני יםלמשכן, דג הזברה מבוגרת גזע על ידי הצבת 2 זכרים ונקבה 1 (בדרך כלל 2: 1 מאפשר שיעור הפריה אופטימלי) לתא רבייה, בהיקף של האקווריום נפרד עם סל אוסף ביצה 31.
      הערה: סלי אוסף ביצה משמשים כדי להגן על הביצים מנאכלו על ידי ההורים ולהקל על קצירת ביצה.
    2. בhpf 1, ביצי קציר ועוברים רק התפתחו כראוי בצלחת 100 מ"מ פטרי מלא 25 מיליליטר מים דגים כחולים (מחיר למנה 100 עוברים מרביים) ולשמור אותם על 28.5 מעלות צלזיוס. ביצים ללא מופרה מבוטלים.
  2. הכנה של עוברי דג הזברה לזריקות
    1. בערך 24 שעות לאחר הפריה (hpf), dechorionate את העוברים עם פינצטה בסדר בצלחת פטרי 100 מ"מ ולשמור אותם על 28.5 מעלות צלזיוס.
    2. לאסוף 30-48 עוברי hpf בעזרת פיפטה ולהעביר אותם לתא מיצוב -shaped "V" מלא 25 מיליליטר של מים דגים המכיל 270 מ"ג / tricaine L.הנח את העוברים כראוי בערוצים באמצעות כלי תוצרת קצה microloader (טיפ מטעין מיקרו מקוטע תוצרת בית) מותאם למייקרו-מניפולציה קלה יותר.
      הערה: להתמצא צד הגב כלפי מטה לזריקות תוך ורידי בוריד הזנב או צד הגב כלפי מעלה לזריקות זנב שרירים.

4. מיקרו-הזרקת נוהל

הערה: הליך הזרקת מיקרו למ ' abscessus דומה לזה שתואר בעבר למ ' marinum זריקות 32. כדי להעריך את הכרונולוגיה של מ ' זיהום abscessus (הישרדות, המון חיידקים, קינטית ומאפיינים של זיהום), זריקות בוריד הזנב של 30 hpf עוברים עדיפים. כדי להמחיש את הגיוס של תאים חיסוניים, זריקות נעשות באתרים מקומיים כגון היא בשרירי זנב בעובר 48 hpf.

  1. לדלל את הבידוד mycobacterial ב 1 X PBST (תלוי במספר CFU ללהיות מנוהל כפי שנקבע בשלב 2.2.6), המכיל 10% פנול האדום כדי לבדוק הזרקה נכונה.
  2. לטעון מחט זריקת microcapillary עם 5-10 μl של הבידוד החיידקים באמצעות קצה microloader, לחבר את מחט microinjection לבעל micromanipulator תלת ממדים מחובר למזרק ולשבור את החלק העליון של המחט עם פינצטה בסדר לקבל פתיחה בקוטר של 5-10 מיקרומטר.
  3. כייל את עוצמת הזריקה על ידי התאמת לחץ microinjection (20-50 hPa) וזמן (0.2 שניות).
    הערה: נדרש הזרקת הנפח מכויל על ידי קביעה חזותית של הקוטר של אגל גורש בחלמון של עובר.
  4. להזרקה לוריד הזנב, מקם את העובר עם הצד הגחוני מול המחט (כמפורט בסעיף 3.2.2) ולמקם את קצה מחט הקרוב לפתיחה ואברי המין, מיקוד וריד הזנב, ודחפת בעדינות את קצה המחט לתוך העובר עד שפשוט מפלח את caudאזור וריד אל. לספק את הנפח הרצוי של הכנת חיידקים, בדרך כלל 1-3 NL המכיל כ -100 CFU / NL.
  5. לזריקה תוך שרירית, מקם את העובר עם צד הגב מול המחט (כמו בסעיף 3.2.2), למקם את המחט על somite אחד ולהזריק נפח קטן (NL 1) של הבידוד.
    הערה: באשר לזריקות וריד הזנב, זיהומים תוך-שרירית גם מאתגרים לבצע. יש להקפיד להימנע מעומס יתר שעלולה לפגוע ברקמות הסובבות.
  6. בסופו של הליך ההזרקה, לשלוט על הגודל של הבידוד על ידי הזרקה באותו הנפח של השעיה חיידקים בירידה של PBST סטרילי ואחרי ציפוי על 7H10 OADC ולספור CFU. ניתן להזריק סביב 100 עוברים עם מחט.
    הערה: מאחר מ גס abscessus עשוי להמשיך ליצור אגרגטים במחט, זריקות צריכים להיעשות מייד לאחר ההכנה של הבידוד.
  7. העבר את FIS הנגועצלחות בנפרד ב24 גם שעות המכילות 2 מים גם דגי מיליליטר / לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס. עוברים מוזרקים עם 1-3 PBST X 1 NL יכולים לשמש כקבוצת ביקורת.
  8. זיהום תקין של חיידקי ניאון בעוברים מנוטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. דור של מקרופאג המדולדל עוברים

הערה: דלדול סלקטיבי של מקרופאגים מרקמות משמשת לחקור את תרומתם ותפקיד במהלך זיהום. כדי להמחיש את הדלדול התקין של מקרופאגים, מומלץ להשתמש בקו מהונדס עם מקרופאגים ניאון, שבו באו לידי ביטוי במיוחד mCherry תחת שליטת יזם MPEG1 הספציפי מקרופאג 19.

  1. הליך מבוסס Lipo-clodronate
    הערה: הליך השאיבה-clodronate מאפשר דלדול סלקטיבית של מקרופאגים מרקמות (אך לא נויטרופילים) 19. המתחם הזה לא משנה את ההישרדות של עוברים ולא AFfect היושרה של חיידקים. פרוטוקול מפורט להכנת clodronate-כמוס liposome כבר דווח בעבר 33.
    1. בגיל 24 hpf, dechorionate את העוברים ולהעביר אותם לצלחת הזרקת -shaped "V" מלא במי דגים בתוספת tricaine כדי לשמור על העוברים במדינה מורדמת עד סוף הליך ההזרקה, כפי שתואר ב3.2.2. להתמצא צד הגב כלפי מטה.
    2. לטעון מחט זריקת microcapillary עם clodronate-כמוס יפוזום (Lipo-clodronate), לחבר את מחט microinjection לבעל micromanipulator תלת-ממדי ולשבור את החלק העליון של המחט עם פינצטה בסדר לקבל קוטר פתיחת טיפ של 10 מיקרומטר.
    3. כדי לכייל את עוצמת הזריקה, להתאים את לחץ microinjection 20 hPa וזמן ההזרקה ל -0.2 שניות. הנח את קצה מחט הקרוב לפתיחה ואברי המין, מיקוד וריד הזנב, ודחפת בעדינות את קצה המחט לתוךעובר עד שפשוט מפלח את אזור וריד הזנב ולספק את הנפח הרצוי של פתרון (2-3 NL, 3 פעמים).
      הערה: ההשעיה Lipo-clodronate היא מאוד דביקה ויש vortexed לפני הזרקה כדי למנוע חסימה של כלי הדם במערכת וההרג של העובר. זה חיוני כדי להמשיך לכמה זריקות רצופות של נפחים קטנים.
    4. מעבירים את העוברים בצלחות פטרי 100 מ"מ המכילות מים דגים ולשמור אותם על 28.5 מעלות צלזיוס עד זיהום.
    5. לשלוט על הדלדול התקין של מקרופאגים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
      הערה: דלדול מקרופאג שלם הוא יעילה למשך 4 ימים לאחר מתן Lipo-clodoronate.
  2. הליך מבוסס Morpholino
    1. היום לפני ההשרצה, דג הזברה מבוגרת גזע על ידי הצבת 2 זכרים ונקבה 1 מופרדת על ידי מחסום פלסטיק בתא רבייה.
    2. למחרת, 30 דקות לאחר ש≈ האור נדלק במתקן דג הזברה, להסיר את מכשול הפרדהזכרים ונקבות. להמתין כ 20 דקות לאחר תחילת ההשרצה כדי לייעל את שיעור ההפריה. לקצור את הביצים ולהאט את התפתחותם על ידי העברתם בצלחת פטרי 100 מ"מ מלאים במים קרים כחולים דגים (4 מעלות צלזיוס).
      הערה: השליטה של ​​ההשרצה היא קריטית עבור הניסויים מבוססי morpholinos. Morpholinos ניתן להזריק רק לביצים עד שלב ארבעה תאים.
    3. לאסוף את הביצים בעזרת פיפטה ולהפקיד את הביצים בהזרקה-הקאמרית -shaped "U" מלאים במים קרים דגים כחולים ולחסום את הביצים בערוצים באמצעות כלי קצה microloader תוצרת בית.
    4. הכן את פתרון morpholino pu.1 המכיל 10% של פנול האדום, כפי שתואר בעבר 19. לטעון מחט זריקת microcapillary עם הכנת morpholino ולחבר את מחט microinjection לבעל micromanipulator תלת-ממדי, ולאחר מכן לנתק את קצה המחט עם פינצטה בסדר לobtaiקוטר פתיחת טיפ נה של 5-10 מיקרומטר.
    5. כדי לכייל את עוצמת הזריקה, להתאים את לחץ microinjection ל20-50 hPa וזמן ההזרקה ל -0.2 שניות. הנח את קצה המחט קרוב לביצה ודחף בעדינות את קצה מחט הדרך סיסית לתוך הביצה ולספק רצוי פתרון morpholino הנפח, בדרך כלל 3-5 NL.
    6. לאחר הזרקת מיקרו, להעביר את הביצים בצלחת פטרי 100 מ"מ במי דגים ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס עד הליך הזיהום מתחיל.
    7. נתח את הדלדול הנכון (מלא) של מקרופאגים בmorphants pu.1 ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב30-48 hpf..
      הערה: בהתאם לריכוז המוזרק, morpholinos u.1 עמ 'עשוי להשפיע גם על מספר הנויטרופילים המוקדמים. כדי לאשר את הדלדול התקין של מקרופאגים מבלי לשנות את מספר הנויטרופילים, מומלץ להשתמש בקו דג הזברה מהונדס כפול עם מקרופאגים ונויטרופילים ניאון (עם GFPביטוי מונע במיוחד על ידי האמרגן MPX) 19.

6. כימות נטל בקטריאלי

  1. קביעה על ידי ספירת CFU
    1. בנקודת הזמן הרצויה, לאסוף קבוצות של עובר נגוע (5 לתנאים) ב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (עובר 1 / צינור), cryo-להרדים את העוברים על ידי דגירה על קרח למשך 10 דקות ולהרדים באמצעות מנת יתר של tricaine (300 500 מ"ג / ליטר)
    2. לשטוף את העוברים עם מים סטריליים פעמיים ולספק אותן בצינור חדש, lyse כל עובר עם 2% Triton X-100 בדילול מלא 1 X PBST באמצעות מחט 26-G וhomogenize ההשעיה עד תמוגה המלאה. צנטריפוגה ההשעיה וresuspend גלולה ב 1 X PBST עם 0.05% Tween 80. דילולים סידוריים של homogenates הם מצופים במידלברוק 7H10 OADC והשלימו עם BBL MGIT פנטה, כפי שהומלצו על ידי הספק.
      הערה: מ ' abscessus להיות רגיש יותר לtreatmen NaOHלא יותר ממ ' טיהור marinum, של lysates דגים מבלי להשפיע מ ' צמיחת abscessus ניתן להשיג בהצלחה באמצעות קוקטייל האנטיביוטיקה BBL MGIT פנטה.
    3. דגירה הצלחות במשך 4 ימים על 30 מעלות צלזיוס מושבות וספירה.
  2. קביעה על ידי הקרינה פיקסל רוזן מדידות (FPC) בעוברים חיים
    הערה: כדי לקבוע את עומסי חיידקים באמצעות פליטת הקרינה, תמונות סדרתי של עוברים נגועים נרכשות ועוצמת הקרינה שנמדדה על ידי FPC (זיהוי של חיידקים על ידי ניתוח חלקיקים) באמצעות מאקרו תוצרת בית שפותח עבור התוכנה החופשית ImageJ. ניתוח חלקיקים דורש תמונה בשחור לבן בינארי המסתמכת על מגוון סף המאפשר לאפלית אות הניאון של ריבית מהרקע.
    1. בנקודת הזמן הרצויה, tricain-להרדים עוברים נגועים (5-10 לכל מצב) בצלחות פטרי 35 מ"מ, כמתואר ב3.2.2.
    2. הסר מים וsubmerge העוברים ומשטח הצלחת השלם עם 1% נקודת התכה נמוכה agarose במי דגים, לאחר מכן יישר רוחבי העוברים. לכסות את agarose הקרושה במי דגים המכילים tricaine.
    3. לרכוש תמונות הקרינה של כל העובר באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם מטרת 10 X.
      הערה: רכישת תמונת הקרינה היא שלב קריטי של הליך מדידות FPC. חשוב להשתמש בצג מכויל עם בדיקה כיול צבע. התאמת האופטימלית של זמן חשיפה כדי להשיג רקע מינימאלי במהלך רכישה מונעת רוויה של האות. תמונות חייבת להיות בפורמט TIFF 8 סיביות. הגדרות זהות נשמרות במהלך הניסוי כולו למטרות כמותי.
    4. מוציא בזהירות את agarose מהעוברים עם כלי קצה microloader תוצרת בית. עוברים אלה יכולים לשמש לניתוחים שלאחר מכן במידת צורך. לפני כימות של עומס החיידקים, כל תמונה תהיה בשליטת האיכות. לnalyze התמונות ולהמיר את עוצמת הקרינה לFPC לדגים, לפתוח את התוכנה החופשית ImageJ.
      הערה: ערך FPC משקף את נטל החיידקים כפי שמוצג באמצעות בעבר מ ' marinum 34.
    5. לקבוע את הסף הנדרש לניתוח תמונה באמצעות תמונה של עובר נגוע (ניתן להשתמש בכמה עוברי שליטה להשיג סף ממוצע). עבור לתמונה → התאם → סף ולאחר מכן הזז את המחוון התחתון בחלון הסף לימין עד שהרקע הופך שחור לחלוטין (כלומר, להשיג רקע צריך להיות באפס). רשום את הערך המקביל.
    6. בתוך התמונה J, לפתוח מאקרו FPC (קובץ נוסף) ובצע את ההנחיות: לאתר את התיקייה של תמונות שיש למדוד ולאחר מכן להזין את הסף כפי שנקבע בעבר ולחץ על "אישור".
      הערה: מאקרו אוטומטי מחסיר את הרקע. סף מוחל אז. אותות ניאון הם זיההfied הבא ניתוח החלקיקים.
    7. העתק והדבק את הנתונים מחלון הסיכום לתוכנה הרצויה לניתוח נתונים.
      הערה: בניגוד לשיטת קביעת CFU, שיטת FPC אינה פולשני ומאפשרת מחדש להשתמש בעוברים ולניתוחים שלאחר מכן, וחשוב, ניטור הדינמיקה / קינטיקה של נטל החיידקים על בסיס פרטני. זה, אם כן, מאפשר להפחתה משמעותית של מספר בעלי החיים, בהסכם עם כללי אתיקה.

7. הדמיה מ ' עוברים נגועים abscessus-

  1. הדמיה חיה של מ ' זיהום abscessus
    1. עוברי הר-הרדים tricaine (ראה 3.2.2) ב 1% נקודת התכה נמוכה agarose בצלחת פטרי 35 מ"מ לפני תצפיות מיקרוסקופי epifluorescence. השתמש בצלחת תחתית זכוכית למיקרוסקופיה confocal ההפוכה או בשקופית דיכאון חלל אחד למיקרוסקופיה confocal הזקופה. להתמצא העובר לתפקיד והכיסוי הרצוייםagarose הקרושה במי דגים המכילים tricaine.
    2. השתמש במיקרוסקופ epifluorescence עם מטרת 10 X עבור תמונות רכישת הקרינה ושידור רציפות של כל העובר. לחלופין, להשתמש במיקרוסקופ confocal עם 40X או 63X מטרות לדמיין את הפעילות של תאים חיסוניים לאחר זיהום.
  2. הדמיה קבועה מ ' עוברי abscessus הנגועים
    1. להרדים את העוברים כפי שתואר ב6.1.1 ולהעביר אותם לצינורות 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגות ולתקן את עוברי paraformaldehyde 4% ב 1 X PBST לשעה 2 ב RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. הסר paraformaldehyde על ידי שטיפת העוברים פעמיים עם 1 X PBST במשך 10 דקות.
      הערה: כדי לשמר את הקרינה, עוברים קבועים חייבים להיות מוגנים מפני אור.
    2. כדי לשמר את היושרה של הרקמות וקרינה, עובר מודגרת ברציפות בהגדלת פתרונות ריכוז גליצרול (10, 20, 30, 40 ו- 50% בדילול מלאים 1 X PBST), ל10 דק 'לכל מצב.
      הערה: עוברים קבועים יכולים להיות מאוחסנים במשך מספר חודשים בגליצרול 50% על 4 מעלות צלזיוס.
    3. הנח את העובר המוטבע בגליצרול 50% בתא צפייה (איור 1) 31.
    4. תמונה באמצעות 40X או 63X יעדים במיקרוסקופ confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

למרות שניתן להזריק אתרים אנטומיים שונים 32, זריקות וריד הזנב משמשים לעתים קרובות כדי ליצור זיהום מערכתי לניתוחים שלאחר מכן, כולל ניסויי הישרדות, נחישות נטל חיידקים, פעילות phagocytosis או היווצרות חוט. זריקות בשרירי הזנב משמשות להעריך את הגיוס של מקרופאגים באתר ההזרקה (איור 3 א). לחקור ולהשוות את האלימות של גרסאות R ו- S של מ ' abscessus, השעיות חיידקי ניאון מוזרקות בוריד הזנב של 30 hpf עוברים (איור 3 א) 19. בניגוד לגרסת S, morphotype R גורם זיהום חזק יותר וקטלני בעוברי דג הזברה (איור 3), המתאפיינים בהתפתחות המהירה של מורסות חיידקים בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) (איור 3 ג). זריקות מערכתיות עם שני R וריאנטים S לגרום לזיהומים במערכת העצבים המרכזית והבדל בניתן לכמת פנוטיפים פתולוגיה וארסיים או על ידי תצפית מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3 ג), על ידי ספירת CFU לדגים (איור 3D) או על ידי קביעת FPC של תמונות שנרכשו (איור 3E). חשוב לציין, CFU ונחישות FPC מתואם ולהצביע להמון חיידקים גדולים יותר עבור זן R מאשר זן S 3 ו -5 dpi. בסך הכל, תוצאות אלו תומכות דג הזברה כמודל רלוונטי ולא פולשנית של זיהום ללמוד הכרונולוגיה של תהליך ההדבקה.

אולי אחת התכונות המרהיבות ביותר נתגלה על ידי וידאו מיקרוסקופיה המאפשרת הדמיה מיתרים מתפתל בתוך מערכת העצבים המרכזית של עוברים נגועים בגרסת R (איור 4). הודות לשקיפות האופטית של העוברים, הקינטית של היווצרות R-חוט יכול להיות במעקב וצלמו באופן לא פולשני, הממחיש את הנטייה הגבוהה של גרסת R לשכפל שלוחהracellularly. שיעור זה בלתי מבוקר שכפול, בשילוב עם הרס סלולריים / רקמות במהירות מובילה לפיתוח של מורסות וסופו של דבר למוות זחל.

המקרופאגים ידועים לשחק תפקיד חשוב בזיהום mycobacterial ובמיוחד על ידי הנהיגה היווצרות granuloma 35. ניתן להשתמש בשתי אסטרטגיות משלימות ללמוד מ ' צמיחה / ארסיות abscessus בעוברים-מדולדל מקרופאג: (איור 5 א) Lipo-clodronate- והנהלים מבוסס morpholino. זיהום של עוברים-מדולדל מקרופאג עם גרסת R מוביל לעלייה מסיבית בהמון חיידקים וייצור כבל כפי שנחשף בוידאו-מיקרוסקופי (איור 5), שהוביל למוות מהיר מאוד (100% עוברים מתים בשעת 3 dpi; איור 5 ג) . זה עולה בבירור כי מקרופאגים נדרשים לשלוט מ ' זיהום abscessus.

כדי לחקור את התפקיד של מקרופאגים נוספיםבמהלך זיהום, עובר מהונדס ספציפי מחסה מקרופאגים ניאון אדום (MPEG1: mCherry) יכול לשמש 19. הזרקה של מ ' abscessus להביע ואסאבי לתוך שריר הזנב או בוריד הזנב גורם גיוס ניכר של תאי מיאלואידית, בעיקר מקרופאגים, באתר של זיהום. גיוס זה מוביל להרס עצמי יעיל של חיידקים בודדים (6A-6B איור). למרות נוכחותם של מקרופאגים, מיקרוסקופיה confocal חושפת את המראה של מיתרי חיידקים גדולים שמקרופאגים לא יכולים phagocytize (איור 6 ג). יחדיו, ממצאים אלה מדגישים מנגנון חדש של התחמקות חיסון המבוסס על התפקיד של cording במניעת הרס עצמי mycobacterial.

איור 3
איור 3. מ ' זיהום abscessus בעוברי דג הזברה. (א) (פנל עליון) זיהום תוך ורידים מבוצע על ידי הזרקת ניאון מ ' abscessus (מוצג בלבן) בוריד הזנב (חץ 1), אחורי לפתיחה ואברי המין, בhpf 30 עוברים. (פנל תחתון) זיהום תוך שרירית המבוצע על ידי הזרקת mycobacteria ניאון (מוצג בלבן) בשריר הזנב מעל somite (חץ 2), ב -48 hpf עוברים. (יהיה) 30 hpf עוברים נגועים הווריד עם tdTomato- מ ' abscessus (R וריאנטים S). (ב) עקומות הישרדות של עוברים נגועים עם 300 ≈ או R CFU או S גרסאות או PBS מוזרק פקדים (n = 20). נציגי תוצאות משלושה ניסויים בלתי תלויים מוצגות. הדמיה של Spatiotemporal או R או גרסת S להביע tdTomato (לבן) בזמנים שונים (C) מציין שלאחר זיהום שבוצע על ידי הדמיה לחיות הקרינה. לכל זן, כיסוי הקרינה ושידור נציג של עוברים נגועים כולו הוא sho WN. אותו העוברים היו צילמו ב 3 ו 5 dpi. (DE) המון בקטריאלי בתוך העוברים נגועים גרסאות או R או S (200 ≈ CFU) נקבעו על ידי CFU ספירה (ד) או מדידות FPC (E). (ד) CFU מlysate של עוברי אדם בנקודות זמן שונים לאחר ההדבקה נקבעה על ידי ציפוי על מידלברוק 7H10 OADC בתוספת BBL MGIT פנטה. התוצאות באות לידי ביטוי כמתכוונים להיכנס ± SD CFU (פסים אופקיים) לכל עובר משלושה ניסויים עצמאיים (n = 5). מדידות (E) FPC מעוברי חיים בודדים בזמן שונים מצביע לאחר פגיעה המבוסס על ניתוח חלקיקים באמצעות ImageJ. התוצאות באות לידי ביטוי כמתכוונים להיכנס ± SD FPC (פסים אופקיים) לכל עובר משלושה ניסויים עצמאיים (n = 5). כל התמונות התקבלו עם מיקרוסקופ epifluorescence מצויד במצלמה דיגיטלית בצבע. t = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. בcording vivo של גרסת R. 30 hpf עוברים נגועים הווריד עם גרסת R של מ ' abscessus וצלם בזמן שונים מצביע לאחר זיהום לדמיין את ההתקדמות של היווצרות חוט. החץ האדום משמש כנקודת התייחסות קבועה כדי לעקוב אחר האבולוציה spatiotemporal של החוט. התמונות של דסק"ש החלק מהזנב המכיל את החוט מתפתל הגובר הם התאגרפו (מיקרוסקופ מצויד במצלמת צבע). ברים סולם:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

0 / 53130fig5.jpg "/>
איור 5. דלדול של מקרופאגים מוביל להתפשטות כבל מוגברת. עוברים () מתרוקנים באמצעות הליך השאיבה-clodronate מבוסס או ההליך המבוסס על morpholino. (פנל העליון) ליפוזומים-כמוס Clodronate (Lipo-clodronate) מוזרקים לוריד ב -24 hpf Tg (MPEG1: mCherry) עוברים. בתוך מחזור הדם, שאיבה-clodronate נבלע במהירות על ידי מקרופאגים שעוברים אפופטוזיס לאחר מכן. הזרקה (שמאל-תחתון פנל) של הכנת morpholino לדפוק למטה הביטוי של גן pu.1 לTg (MPEG1: mCherry) מופרה ביצי דג הזברה. (פנל מימין למטה) הדלדול הנכון של מקרופאגים בעוברים נבדק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (BC) 30 hpf המכיל מקרופאג (+) או מדולדל מקרופאג. (-) עוברים (לאחר טיפול שאיבה-clodronate) נגועים במ ' abscessus R להביע tdTomato (מוצג בלבן). (ב) (ג) הישרדות של העוברים מרוקנים מקרופאג-המכיל מקרופאג או נגועים ב≈300 CFU מ ' R abscessus (n = 20). נציגי תוצאות משלושה ניסויים בלתי תלויים מוצגות. כל התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ המחובר למצלמה צבע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
התנהגות 6. איור של מקרופאגים בעוברים נגועים באופן מקומי או מערכתי עם מ ' abscessus () 48 hpf Tg (MPEG1: mCherry). עוברי דג הזברה נגועים שריר עם מ 'וואסאבי להביע abscessus ר ' imagi חיng באמצעות מיקרוסקופ confocal לדמיין גויס מקרופאגים phagocytizing mycobacteria בודדת (בדקות שלאחר זיהום, MPI). הקרנה מקסימלי עוצמת מראה גיוס אינטנסיבי של מקרופאגים (אדום) לאתר ההזרקה (מיקרוסקופ confocal עם המים 40X APO 0.8 מטרת NA). בר סולם: 20 מיקרומטר (BC) 48 hpf Tg (MPEG1: mCherry). עוברים נגועים הווריד עם מ ' הקרנת עוצמה המרבית של מקרופאג (אדום) או תאים אחרים מיאלואידית, ככל הנראה נויטרופילים (חיצים) abscessus R להביע ואסאבי היה קבועים וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal (40X) בשעת 4 HPI (ב) ו -3 dpi (C). (ב), המכיל mycobacteria המבודדת (ירוק) קרובה לאתר של ההזרקה (מיקרוסקופ confocal עם שמן 63X APO 1.33 אובייקטיבי NA). בר סולם: 10 מיקרומטר (C) הקרנת עוצמה המרבית מראה מקרופאג אחד (אדום) לא הצליח phagocytize כבל (ירוק) (מיקרוסקופ confocal עם שמן 63X APO 1.33 אובייקטיבי NA)..בר סולם:. 5 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דג הזברה התפתחה לאחרונה כמערכת מודל חוליות מצוינת ללימוד הדינמיקה של זיהום חיידקים באמצעות שדה רחב והדמיה confocal בזמן אמת 36. השילוב של מתלים התפזרו mycobacterial (פרוטוקול 2.2) יחד עם שיטות הזרקת מיקרו (פרוטוקול 4) מאפשר זיהומים לשחזור מערכתיים, ולאחר מכן ניטור והדמיה של ההתקדמות של הזיהום עם דגש מיוחד על אינטראקציות חיידקים עם מקרופאגים מארח. ארסיותו של מ ' abscessus in vivo יכול להיחקר הודות לשימוש בדג הזברה זהב wild-type 37. ללמוד אינטראקציות בין מ ' abscessus ולארח תאי מיאלואידית, ניתן להשתמש במספר קווי דג הזברה המהונדס כגון Tg (MPEG1: mCherry) כדי לחזות מקרופאגים 19. קווי כתב מהונדסים נוספים כגון כTg (MPX: GFP) 38 או Tg (ליז: DsRed) 39 wה- i או ירוק של נויטרופילים האדומים, בהתאמה, יכול לשמש גם כדי לטפל בתפקיד הספציפי של גרנולוציטים אלה בתגובה לזיהום.

abscessus מ ', ובמיוחד את גרסת R, מציגה נטייה טבעית ליצירת אגרגטים חיידקים מסיביים 19, ובכך למנוע הזרקת מיקרו לשחזור. בנוסף, גושי העובדה שצורות גרסת R הרבה יותר גדולים מאשר גרסת S גם מונעים השוואת הפוטנציאל של פנוטיפים הארסיות לשתי גרסאות isogenic. הפרוטוקול המתואר בסעיף 2 מאפשר קבלת הומוגנית והתפזר מ ' השעיות abscessus למייקרו הזרקה בעוברים. הכנה זו יכולה להיות מיושמת על כל מינים אחרים mycobacterial או זנים מוטנטים מוצגות מאפייני צבירה מוגזמות. מאז צעד sonication יכול לשנות את דופן תא השכבה החיצונית ביותר mycobacterial, יש להקפיד על מנת להעריך את ההשפעה של טיפול פיזי זה על כדאיות חיידקים לדוארACH זן חדש.

קביעת נטל חיידקים מסתמכת באופן שגרתי על CFU לספור לאחר ציפוי עובר lysed על מדיום אגר סלקטיבית בנקודות זמן שונות לאחר פגיעה, כפי שתואר בפרוטוקול 6.1. הליך זה כולל מספר מגבלות: מאז בעלי החיים מומתים, כל עובר (או קבוצה של עוברים) יכול לשמש לקביעת נקודת זמן אחת. בנוסף, שיטה זו עדיין לא מדויקת בשל חלק גדול מחיידקים שנהרגים ו / או איבדו במהלך תמוגה, דילולים סדרתי שלאחר מכן, או בעיקר על ידי התקבצות. ספירת CFU היא גם משימה מפרכת. כחלופה, הפרוטוקול 6.2 מתאר שיטה יעילה לכמת מ ' נטל abscessus הכולל צעדי טיפול מוגבלים, המבוסס על הניתוח של תמונות ניאון של עוברים נגועים בכימות פיקסל, כפי שפותח במקור עבור מ ' marinum 40,41. שיטה זו מבוססת על ניתוח FPC חלקיקים, מראה קורלציה טובה wה- i countings CFU. באופן דומה, על ידי שילוב של הכימות מיקרוסקופי וקרינה, שינויים יחסי במספרי תא חיסון מולדים לכל עובר ניתן לכמת על ידי ניתוח תמונה באמצעות קווים מהונדסים נאותים.

עוברי דג הזברה יכולים לשמש כדי להעריך את התפקיד של תאי מערכת חיסון בדלדול זיהום ומקרופאג נמצא להשפיע לרעה על הישרדות מארח בתגובה למ ' זיהום abscessus. דלדול מקרופאג ספציפי יכול להיות שנוצר ביעילות באמצעות הליך המבוסס על השאיבה-clodronate (הפרוטוקול 5.1) או ההליך המבוסס על morpholino (פרוטוקול 5.2). עם זאת, מאז נוכחות מקרופאגים היא חיונית להקמה ולתחזוקה של מערכת כלי דם ולהתפתחות עוברית נכונה, מומלץ לכרות ייצור מקרופאג ב 24 hpf באמצעות שאיבה-clodronate.

עובר דג הזברה מופיע כמודל ייחודי ללמוד מ ' זיהומי abscessus והתפקיד של extracellular cording כאסטרטגיה חתרנות מערכת חיסונית. אם גורמי שליטה cording במ ' ניתן לזהות abscessus, הם יכולים להוביל להתפתחות של אפשרויות טיפוליות חדשניות. קישור השימוש בדג הזברה יחד עם טכנולוגיות חדשניות תפוקה גבוהה 42 גם פותח את השדה לגילוי תרופות וגישות תרופתיות חדשות נגד הפתוגן עמיד לתרופות זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מודים לק Kissa לדיונים מועילים ולמתן Lipo-clodronate ול 'Ramakrishnan למתנה הנדיבה של pTEC27 וpTEC15 המאפשרים ביטוי של tdTomato וואסאבי, בהתאמה. חלק צורות עבודה זו של הפרויקטים של הסוכנות הלאומית למחקר הצרפתי (ANR ZebraFlam-10-MIDI-009 וDIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) ותכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7-אנשים-2011-ITN) על פי הסכם מענק לא. PITN-GA-2011-289209 להדרכה ראשונית רשת FishForPharma מארי קירי-. אנו מאחלים גם להודות לאיגוד גרגורי Lemarchal וVaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) למימון CM דופון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

זיהום גיליון 103, דג הזברה זיהום פתוגנזה חסינות מולדת מקרופאג הזרקת מיקרו מיקרוסקופ פלואורסצנטי הדמיה לחיות cording.
פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; בעוברי דג הזברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet,… More

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter