Introduction
Las interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la biología 1 y están estrictamente regulados por mecanismos espacio-temporales en muchas escalas de tiempo y longitud. Los estudios sobre la señalización celular en la membrana celular, por ejemplo, han puesto de manifiesto compartimentos espaciales dinámicas, a nanoescala que facilitan IBP específicos y procesos celulares 2. Por lo tanto, la capacidad para sondear los IBP en los sistemas biológicos con suficientes resoluciones espaciales y temporales, una alta especificidad y alta sensibilidad es clave para lograr una comprensión mecanicista de la biología.
Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) es una de las pocas herramientas existentes para la visualización de los IBP en una celda con resolución subcelular y la compatibilidad de las células vivir 3-5. La técnica es relativamente sencilla y consiste en la división de una proteína de fluorescencia en dos fragmentos no fluorescentes; cuando etiquetados genéticamente para dos proteínas que interactúan ypuesto en proximidad, los fragmentos pueden reconstituir para formar una proteína fluorescente completa, dando señal fluorescente. Cuando se diseñan adecuadamente, sondas BiFC no deben reconstituir de forma espontánea en ausencia de IBP. Como tal, la señal de fluorescencia en un ensayo de BiFC sólo surgir en la presencia de los IBP, que permite la visualización directa de los IBP con alta especificidad. Beneficios adicionales de utilizar la fluorescencia como la lectura son de alta sensibilidad, resolución subcelular, y la compatibilidad con un alto rendimiento y ensayos de cribado de alto contenido, entre otros. Para estos beneficios, una serie de sondas BiFC basados en diferentes proteínas fluorescentes padres se han desarrollado. Como en todas las otras técnicas de detección basados en microscopía de luz convencional, sin embargo, la resolución espacial de BiFC se limita a ~ 250 nm por la difracción de la luz. Esto hace que sea un reto para estudiar la regulación de los IBP en la nanoescala, que, como se aludió antes y ejemplificado por las balsas de lípidos 6and nanoclusters Ras 7, es una escala de longitud crítica para la comprensión de muchos procesos celulares como la señalización.
BiFC se ha combinado con microscopía de localización fotoactivado (PALM) 8,9 para superar este límite de la resolución espacial para obtener imágenes de los IBP 10. PALM es una técnica de microscopía de super-resolución reciente que elude el límite de difracción en imágenes de fluorescencia a través de la activación estocástico y localización subdiffractive de moléculas fluorescentes individuales. En cada ciclo de activación, una molécula fluorescente emite unos pocos cientos a unos pocos miles de fotones y da lugar a una sola imagen molécula en el detector. Mientras que la imagen es de difracción limitada (~ 250 nm de anchura), su centroide se puede determinar con precisión mucho mayor, típicamente del orden de un 10-50 nm en función del número de fotones detectados. Mediante la activación y localización de cada molécula fluorescente en la muestra, una imagen de alta resolución puede ser reconstruido. Performed en las células vivas, sola molécula de seguimiento (SMT-) PALM permite además adquisición de miles de trayectorias de difusión proteína a partir de una sola célula 11. Es importante destacar que, PALM utiliza sondas fluorescentes especializados tales como proteínas fluorescentes fotoactivables (PA-PM) para lograr la activación estocástico. Dado que tanto BiFC y proteínas fluorescentes uso PALM, que se combinaron mediante el fraccionamiento de PAmCherry1, un PA-FP comúnmente utilizado para PALM, en dos fragmentos entre los aminoácidos 159 y 160.
El sistema basado en PAmCherry1 BiFC dividida muestra una baja señal de fondo de la reconstitución espontánea de los dos fragmentos. Cuando etiquetado genéticamente a un par de proteínas que interactúan, los dos fragmentos (RN = residuos 1 a 159; RC = Met + residuos 160-236) reconstituido de manera eficiente para formar proteínas completas PAmCherry1 incluso a 37 ° C y sin incubación a temperaturas más bajas, lo cual No es el caso de otros pares BiFC 12 como el padre mCherry 13. Furthermore, la proteína PAmCherry1 reconstituido conserva las propiedades fotofísicas del PAmCherry1 padres, tales como alta relación de contraste, rendimiento de fotones medio y fotoactivación rápida, entre otros, que son fundamentales para la exacta localización sola molécula y de imágenes PALM alta resolución.
En este protocolo, se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS utilizando dividida PAmCherry1 (Figura 1). El primer paso es el diseño de las construcciones para la expresión de proteínas de fusión entre los fragmentos PAmCherry1 (es decir, RN y RC) y las proteínas de interés. En teoría, para cada par de proteínas candidatas (A y B), hay ocho pares de proteínas de fusión a ensayar: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; y A-RC / B-RN. Este proceso a menudo se puede simplificar teniendo en cuenta las propiedades estructurales o bioquímicas de las proteínas candidatas. En el caso de Ras, la proteína esdespués de la traducción modificado el cuadro de CAAX C-terminal (C = Cys; A = alifático; X = cualquier), después de lo cual el motivo AAX se escinde. Por lo tanto, RN o RC sólo pueden ser fusionados con el extremo N-terminal de Ras; esto reduce el número de pares de proteína de fusión a cuatro (Figura 1B). Para Raf, los dominios Ras vinculante (RBD; residuos 51-131) se utiliza y se pueden etiquetar en cada extremo. Se generaron Estas cuatro configuraciones de fusión: RN-KRas / RC-Raf RBD; RN-KRas / Raf RBD-RC; RC-KRas / RN-Raf RBD; y RC-KRas / Raf RBD-RN.
Además, tendrá que ser considerado el enlazador entre los fragmentos y las proteínas de interés. Un enlazador flexible de aproximadamente diez aminoácidos se utiliza a menudo, ya que proporciona la suficiente libertad para la complementación que se produzca. Uno de estos es enlazador (GGGGS) x2, aunque hay muchos otros que se han aplicado con éxito, incluyendo secuencias aleatorias generadas a partir de un sitio de clonación múltiple (MCS) 14. La longitud de los enlazadores puede necesitar ser optimizado depending del tamaño de las proteínas de interés y sus orientaciones cuando interactúan.
Los fragmentos PAmCherry1 están contenidos en una pequeña columna vertebral de la clonación con flanqueando MCSs (ver Lista de Materiales). Los genes de interés se pueden insertar a través de los sitios de restricción o con un método de ligadura independiente. Después de la clonación y la secuencia de verificación, el casete de expresión se transfiere a un vector de expresión usando una reacción de recombinasa, un proceso de clonación con alta fidelidad y alta eficiencia.
A continuación, las construcciones de expresión resultantes se transfectaron en la línea de célula diana o, si se desea una línea celular estable, empaquetado en lentivirus para infectar la línea celular objetivo. La transfección transitoria permite la validación rápida de las configuraciones BiFC, pero los problemas potenciales debe tenerse en cuenta. La transfección utilizando productos químicos a menudo hace hincapié en las células, lo que resulta en alta autofluorescencia; mientras que el uso del total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopy puede mitigar esta señal de fondo mediante la limitación del volumen de la iluminación, TIRF ideal cuando los IBP tienen lugar en la membrana celular. Además, las transfecciones transitorias a menudo conducen a altos niveles de expresión de proteínas, muy por encima de los de las proteínas endógenas, que pueden causar artefactos en la detección de los IBP. Por lo tanto, se recomienda que se establezcan líneas celulares estables después de una configuración apropiada BiFC se ha determinado a través de pruebas inicial. Las líneas celulares estables también tienen el potencial para la expresión sintonizable mediante doxiciclina inducción 15.
Después de la infección, las células se seleccionan con antibióticos, por lo general puromycin y neomicina, uno para cada constructo. Los pasos subsiguientes para la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y análisis de datos se describen en detalle en los protocolos.
Con este enfoque, la formación de agrupaciones de nanoescala en imágenes BiFC-palma de Ras-Raf RBD se observan rutinariamente (Figura 2A </ strong>). Consistentemente, trayectorias smt-palma de Ras-Raf RBD muestran una distribución heterogénea en los estados de difusión (Figura 2B-D). Estos resultados sugieren que existen complejos de Ras-Raf en varios estados en la membrana celular, presumiblemente como monómeros y clusters, con potenciales implicaciones biológicas. Este trabajo demuestra el poder de BiFC-PALM en imagen selectiva de los IBP en células con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula, que sería difícil de obtener con BiFC convencional, fluorescencia co-localización, o transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).
En el diseño de experimentos BiFC e interpretación de los resultados, es importante tener en cuenta que el proceso BiFC es irreversible en la mayoría de casos, incluyendo PAmCherry1 dividida. Una vez que los dos fragmentos se combinan y forman una proteína PAmCherry1 completa, el enlace entre los dos fragmentos, y por lo tanto el PPI se convierte en permanente. Esto limita el uso de BiFC y BiFC-PALM para el seguimiento de la dinámica de los IBP (es decir, la cinética de unión y no la dinámica de difusión del complejo de proteínas, una vez que se forma) y, a veces incluso podría conducir a mislocalization de los complejos de PPI.
Un factor adicional a tener en cuenta en el diseño de experimentos BiFC-PALM es el retraso en la maduración cromóforo que es inherente a las proteínas fluorescentes. Una vez que dos proteínas interactúan y los fragmentos de PF se unen, por lo general refold del orden de segundos (tiempo-medio de 60 seg para EYFP 3). Sin embargo, la maduración cromóforo subsiguiente y la señal fluorescente se desarrollan en el orden de minutos. Mientras que la fluorescencia puede ser detectable en 10 minutos después de la reconstitución de la fracción de Venus, una variante de rápido plegado YFP, el tiempo medio para la maduración en general es a menudo alrededor de 60 min 16. Split-PAmCherry1 se observó a tener tasas similares. Por lo tanto, BiFC y BiFC-PALM son opciones actualmente pobres para el seguimiento de la cinética de PPI en tiempo real; otro yothods, tales como FRET y una proteína fluorescente dependiente de la dimerización recientemente desarrollado 17, pueden ser más adecuados para este propósito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Clonación
- Determine las configuraciones de clonar y elegir un enlazador. Proteínas de la etiqueta con los fragmentos de la N- o C-terminal como se describe a continuación para que no interrumpan su correcta localización. Utilice un enlazador flexible, tal como (GGGGS) x2.
- Genéticamente etiquetar las proteínas de interés a los fragmentos PAmCherry1. Como una opción, utilice los plásmidos de clonación que figuran en la Lista de materiales que contienen los fragmentos de RN (residuos PAmCherry1 1-159) y RC (Met más residuos PAmCherry1 160-236) con flanqueando MCS secuencias.
- Linealizar los plásmidos que contienen los fragmentos de RN y RC con PCR inversa (o digestión de restricción) en el punto de inserción. Los cebadores para PCR inversa se enumeran en la Tabla 1. A continuación se muestra un ejemplo de protocolo de PCR utilizado en el laboratorio del autor (ver Lista de materiales para los materiales exactos utilizados en este protocolo).
- Mezclar la reacción de PCR juntos, llevado hasta un volumen final de 50 l con agua: a una pared delgadatubo ed PCR, añadir el agua, 25 l de mezcla maestra 2x, 0,5 mu l cada uno de los cebadores directo e inverso (20 mu M de valores diluidos, 0,2 M de concentración final), y 1 ng de plantilla. Use las siguientes condiciones de ciclo: 98 ° C durante 30 seg, 30 ciclos de 98 ° C durante 7 segundos y 68 ° C durante 2 min, y una extensión final a 72 ° C durante 10 min.
- PCR los genes de interés para la inserción de los plásmidos linealizados que contenían fragmentos de RN y RC. Realice la PCR como en el paso 1.2.1 con el tiempo de extensión a 68 ° C. Utilice cebadores con voladizos que contienen una secuencia de unión flexible, tal como GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT para (GGGGS) x2, y 15 pares de bases de homología con los extremos de la RN linealizado y plásmidos RC para la recombinación.
Nota: Los voladizos cebadores para las proteínas de interés se presentan en la Tabla 2, si el uso de los cebadores en la Tabla 1 para linealizar el plásmido columna vertebral. - Digerir el PCRreacción con Dpn1 para eliminar la plantilla de PCR. Añadir 0,5 l de Dpn1 (20 U / l) directamente a los 50 l de reacción de PCR. Incubar a 37 ° C durante 1 hr y el calor inactivar al 80 ° C durante 20 min. Si la plantilla de fondo persiste en pasos posteriores, aumente la cantidad de enzima o alargar el tiempo de digestión.
- Purificar los productos de PCR a través de una columna de centrifugación como se describe por el fabricante.
- Realizar una reacción de ligadura independiente para combinar un plásmido linealizado que contiene un RN o fragmento de RC con el gen de interés. Medir la concentración de los productos de PCR purificados: combinar 50 ng de plásmido linealizado y 50 ng del gen de interés con 1 l de enzima premezcla y llevar el volumen total a 5 l con agua desionizada. Se incuba a 50 ° C durante 15 minutos, el lugar en el hielo, y añadir 20 l de tampón TE.
- Transformar los plásmidos recombinantes en bacterias competentes 18.
- Seleccione 2-4 + (según se desee) colonias de O cultura / N. Añadir 5 mlde caldo LB y 5 l de kanamicina (50 mg / ml) en un tubo de fondo redondo de 14 ml de polipropileno, y añadir la colonia bacteria seleccionada con un asa de inoculación esterilizada. Incubar a 37 ° CO / N con agitación a 225 rpm.
- Congelar 1 ml de cultivo O / N para el glicerol y 19 de la miniprep el resto como se describe por el fabricante.
- Realizar secuenciación para determinar un buen clon. Si se utiliza los plásmidos de clonación en la Lista de Materiales, M13 utilizar cebadores directo e inverso (en reacciones separadas) según sea necesario para obtener la secuencia completa de la construcción de fusión. Comparar con la secuencia esperada utilizando una herramienta de alineación tal como BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- La transferencia de los constructos secuencia verificada a un plásmido de expresión a través de una reacción recombinasa.
- Añadir 75 ng del plásmido de destino & #8212; como pcDNA para transfecciones transitorias o Plenti para embalaje lentiviral 20 - y 50 ng del plásmido de clonación recombinante a 1 l de enzima premezcla y criar a un volumen total de 5 l con agua destilada. Se incuba a 25 ° C durante 1 hora, a continuación, añadir 5 l de tampón TE.
Nota: Para el envasado lentiviral y estable generación de la línea celular, utilizar un plásmido de destino diferente para cada constructo, por ejemplo, uno con resistencia a la puromicina y el otro neomicina. Esto permite una doble selección de células transducidas. Ten en cuenta también el promotor para cada uno, tal como el promotor de citomegalovirus constitutivo (CMV) para altos niveles de expresión, o CMV con el operador TetO para sintonizable expresión doxiciclina regulado. - Transformar 5 l en bacterias competentes y los plásmidos Miniprep como en los pasos 1.2.6 a 1.2.8, pero utilizando el antibiótico apropiado (típicamente ampicilina).
- Añadir 75 ng del plásmido de destino & #8212; como pcDNA para transfecciones transitorias o Plenti para embalaje lentiviral 20 - y 50 ng del plásmido de clonación recombinante a 1 l de enzima premezcla y criar a un volumen total de 5 l con agua destilada. Se incuba a 25 ° C durante 1 hora, a continuación, añadir 5 l de tampón TE.
- Linealizar los plásmidos que contienen los fragmentos de RN y RC con PCR inversa (o digestión de restricción) en el punto de inserción. Los cebadores para PCR inversa se enumeran en la Tabla 1. A continuación se muestra un ejemplo de protocolo de PCR utilizado en el laboratorio del autor (ver Lista de materiales para los materiales exactos utilizados en este protocolo).
- Determinar la óptimaConfiguración BiFC.
- Plásmidos cotransfectar expresión en células U2OS (o células de elección).
- Añadir 350 l de fenol DMEM libre de rojo y libre de antibióticos suplementado con 10% de SFB en cada pocillo de un porta con cámara inferior de 8 pocillos # 1.5 vidrio. Placa aproximadamente 7,5 x 10 4 células por pocillo lo que las células son aproximadamente 70% -90% de confluencia el día siguiente.
- El día después de plásmidos de expresión de chapado, co-transfectar con diferentes configuraciones en cada pocillo utilizando el reactivo preferido y tal como se describe por el fabricante.
- Para cada bien, añadir 125 ng de cada plásmido de expresión en 50 l de medios reducidos sin suero en un tubo de 0,6 ml y pipeta de arriba y abajo para mezclar. Añadir 1 l de la reactivo de transfección por el centro del tubo y directamente en los medios de comunicación. Agite suavemente para mezclar y dejar reposar la reacción durante 30 min.
- Reducir los medios de comunicación en cada pocillo de la diapositiva cámara a la mitad. Añadir gota a gota la mezcla de transfección a los pocillos y sacuda gtemente para mezclar. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 a 48 horas. Cambie los medios de comunicación el día después de la transfección.
- Células de imagen en un microscopio de fluorescencia como en el Protocolo 2 comenzando con el paso 2.1.4.
Nota: La muestra puede ser proyectado sobre un microscopio de fluorescencia estándar si los niveles de expresión son altos y la cámara es lo suficientemente sensible para la salida relativamente baja de fotones de PAmCherry1. Moléculas PAmCherry1 reconstituidas se pueden activar con un conjunto de filtros ultravioleta (405 nm) antes de la proyección de imagen con una excitación verde (561 nm) conjunto de filtros.
- Plásmidos cotransfectar expresión en células U2OS (o células de elección).
- En su caso, crear un control negativo, por ejemplo, la introducción de una mutación puntual en una de las proteínas de interés que causa la disrupción de la interacción. Realizar una mutagénesis dirigida al sitio 21 en el plásmido de clonación de la proteína a mutar y de la configuración elegida.
- Generar una línea celular estable empaquetando las construcciones en viralpartículas y infectar células U2OS (o línea celular de elección). Considere un sistema inducible (tetraciclina) la expresión 15 de modo expresión puede ser inducida antes de la imagen si la irreversibilidad prolongada de BiFC es un problema, o si se desea la expresión sintonizable.
ATENCIÓN: Trabajar con los virus se clasifica como Nivel de Bioseguridad 2. Mientras recientes generaciones de sistemas de envasado virales han reducido en gran medida la probabilidad de producir virus competentes para la replicación, algunos riesgos siguen presentes. Las referencias se pueden encontrar en http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.- Repita el paso 1.2.10 utilizando un vector retroviral o destino lenti- 20. Aumentar el cultivo O / N a 100 ml de una midiprep y una mayor pureza de los plásmidos.
- En el Día 1: Placa aproximadamente 2 x 10 6 293T / 17 células en un plato de 10 cm para cada constructo a envasar.
- En el Día 2: Preparar una reacción de transfección usando un transfection reactivo de elección y como se describe por el fabricante.
- Preparar una premezcla de envasado de plásmidos con concentraciones finales de 250 ng / l para el envasado de plásmidos 1 y 2, y 100 ng / l para el envasado de plásmido 3 en agua estéril. Añadir 10 l de la premezcla plásmido de embalaje y 2,5 g del plásmido diana a 1 ml de medio reducidos sin suero en un tubo y una pipeta de fondo redondo de 5 ml de polipropileno arriba y abajo para mezclar. Añadir 20 l de reactivo de transfección en el centro del tubo y directamente en los medios de comunicación.
- Agitar suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Retire la mitad de los medios de comunicación de las células y añadir la mezcla de transfección gota a gota. Agitar suavemente para mezclar e incubar a 37 ° C y 5% de CO 2. Incubar 10 ml de medio por placa en un tubo con el tapón aflojado para la temperatura y CO 2 equilibración.
- En el Día 3: cambiar suavemente los medios de comunicación con los medios de comunicación pre-incubados y returN las células a la incubadora. Incubar otro tubo de los medios de comunicación con el tapón aflojado.
Nota: Los sincitios, o la formación de células grandes multi-nucleado, puede ser una señal de que el embalaje está yendo bien. Sin embargo, las células están en un estado frágil y se pueden separar fácilmente. Al cambiar los medios de comunicación, incline la pipeta de modo que sea horizontal y añadir gota a gota el soporte en un borde de la placa. - En el Día 4: Cosecha del virus mediante la eliminación de los medios de comunicación con una jeringa y filtrar a través de un filtro de 0,45 micras de tamaño de poro en un tubo de 50 ml limpio. Reemplazar suavemente los medios de comunicación con los medios de comunicación pre-incubados.
- En el Día 5: Cosecha de nuevo como hizo anteriormente en el paso 1.5.3.3 y combinar filtrado común en el mismo tubo de 50 ml. Añadir 6 ml de concentrador de virus a cada tubo y mezclar. Almacenar a 4 ° C durante al menos 24 horas hasta que los precipitados de virus.
Nota: En función de la salud de las células, el virus se puede cosechar por tercera vez. - Se concentra el virus mediante centrifugación a 1.500 xgdurante 15 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 250 l de medios de comunicación. El virus puede ser utilizado inmediatamente para la infección o se almacena en 50 alícuotas a -80 ° C durante un máximo de un año.
- Placa aproximadamente 3 x 10 5 U2OS (u objetivo) células por pocillo en una placa de 6 pocillos (2 ml de DMEM con 10% de FBS por pocillo) durante la infección, por lo que las células son aproximadamente 50% de confluencia en el momento de la infección.
- Al día siguiente, eliminar la mitad los medios de comunicación por lo que alrededor de 1 ml restos. Coinfectar con 50 l de virus concentrado para cada constructo. Añadir 1 l de polibreno (8 mg / ml) a cada pocillo. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2. Cambie los medios de comunicación al día siguiente y se incuba durante un día más antes de la selección de antibióticos.
Nota: La cantidad de virus a añadir puede variar dependiendo de la velocidad deseada de la infección. Los virus se pueden valorar mediante QRT-PCR. - Añadir antibióticos para seleccionar las células infectadas. Pozos separados con células no infectadas que no han visto virus se requieren como canarios para poner a prueba la eficacia de la selección. Incubar durante 2-7 días, o hasta que la selección está completa.
Nota: Las concentraciones eficaces deben titularse inicialmente, pero son típicamente 1.0 mg / ml para la puromicina y 1,0 mg / ml de neomicina. - Expandir las células en una placa de 10 cm más grande y proceder al Protocolo 2.
- Preparar una premezcla de envasado de plásmidos con concentraciones finales de 250 ng / l para el envasado de plásmidos 1 y 2, y 100 ng / l para el envasado de plásmido 3 en agua estéril. Añadir 10 l de la premezcla plásmido de embalaje y 2,5 g del plásmido diana a 1 ml de medio reducidos sin suero en un tubo y una pipeta de fondo redondo de 5 ml de polipropileno arriba y abajo para mezclar. Añadir 20 l de reactivo de transfección en el centro del tubo y directamente en los medios de comunicación.
2. Las células de imagen fija
- Preparar una muestra para formación de imágenes
- Limpie a 8 y # 1.5 diapositiva cámara de fondo de vidrio mediante la adición de 250 l de NaOH 1 M durante al menos 1 hora y lavar a fondo con PBS.
Nota: cámara de diapositivas no tratados suelen dar lugar a alta señal de fondo. Además, las células pueden ser sensibles a NaOH y el fracaso para limpiar a fondo la superficie de vidrio (tanto como 10 veces más lavados) puede hacer difícil la adhesión celular residual. Si es necesario, se incuba la diapositiva cámara de limpiado con PBS O / N después del lavado. Para las líneas celulares sensibles, chapado a una densidad más alta(Por ejemplo, en el 50% -60% de confluencia inicial) puede ayudar. - Placa de aproximadamente 5,5 x 10 4 de las células de expresión estable U2OS por pocillo en 350 l de fenol DMEM libre de rojo con 10% de FBS para que las células están sanas y no sobre confluente cuando Imaging.
- Realizar tratamientos necesarios para el experimento, como la adición de tetraciclina para inducir la expresión de la proteína.
- Fijar las células inmediatamente antes de la imagen.
- Antes de la fijación, preparar paraformaldehído solución fresca (PFA) - 3,7% PFA en 1x PHEM con 0,1% glutaraldehído (GA). Para la solución 10 ml de PFA, pesan 0,37 g de PFA y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 ml de agua destilada y 30 l de NaOH 1 M y vórtice. Se calienta a 70 ° C y agitar cada 1-2 minutos hasta PFA se disuelva por completo.
- Transferencia disolvió PFA a un tubo cónico de 15 ml y añadir 3,8 ml de agua destilada, 5 ml 2x tampón PHEM, 20 l de 25% de glutaraldehído, y agitar para mezclar. Stock, tampón PHEM 2x es 120 TUBOS mM, HEPES 50 mM, EGTA 20 mM, 16 mM y MgSO 4, con pH ajustado a 7,0 con 10 M KOH. Esta solución de fijación se puede almacenar a 4 ° C durante varios días.
PRECAUCIÓN: PFA y GA son tanto peligrosos. Preparar la solución en una campana de extracción y utilizar equipo de protección adecuado al manipular ambos productos químicos. Evitar la inhalación o el contacto directo con la piel. - Retire el medio de crecimiento. Lave rápidamente con 500 l de PBS y añadir 250 ml de fijador PFA por pocillo. Se incuban las células durante 20 min a TA.
- Retire el fijador PFA de la muestra y añadir 350 l de PBS o tampón de imagen (Tris 100 mM con NaCl 30 mM y 20 mM de MgCl 2, pH 8,5) por pocillo.
- Vortex 100 nm partículas de oro para romper los agregados y añadir 35 l por pocillo (10x dilución final) para el seguimiento de la etapa de deriva durante la exploración.
- Limpie a 8 y # 1.5 diapositiva cámara de fondo de vidrio mediante la adición de 250 l de NaOH 1 M durante al menos 1 hora y lavar a fondo con PBS.
- Adquirir imágenes
- Encienda el microscopio. Encienda los 405 y 561 nm láseres, pero mantener las persianascerrado (interna o externa) en este punto. Encienda la cámara EMCCD y deje que se enfríe. Asegúrese de que los filtros de 561 nm están en su lugar.
- Abra el software de adquisición y establecer el tiempo de exposición a 100 ms y la ganancia EMCCD al 300 (rango 1 - 1000).
- Añadir aceite de inmersión al objetivo y asegurar la muestra de la platina del microscopio.
- Con cualquiera de campo brillante o el láser de 561 nm en (~ 1 kW / cm 2), llevar la muestra en el foco.
- Para obtener imágenes Ras y otras proteínas de membrana, use un 60X apochromat TIRF objetiva con 1,49 apertura numérica y llevar el microscopio en la configuración TIRF. Ajuste el láser de excitación para que sea descentrada al golpear la abertura posterior de la TIRF objetivo; esto hace que el láser para desviar al llegar a la muestra. Siga ajustando el láser hasta que se alcanza el ángulo crítico y el láser se refleja hacia atrás. Búsqueda de una célula a la imagen con varias partículas de oro a la vista. Establezca una región de interésque encierra la célula (o de una región dentro de la célula) y las partículas de oro.
Nota: TIRF disminuye la profundidad de penetración del láser de excitación y reduce la señal de fondo fuera de foco. Además, la corrección de la deriva es probable que sea más preciso en que más partículas de oro están a la vista. - Si está disponible, active el sistema de enfoque automático para corregir la deriva de la muestra en la dirección z. De lo contrario, ajuste el enfoque manualmente a lo largo de la adquisición si la imagen se desenfoca.
- Comience de adquisición con los 405 nm láser apagado y el láser de 561 nm sobre (~ 1 kW / cm 2) en el caso de activación suficiente se está produciendo ya (por lo general, si los niveles de expresión son altos). De lo contrario, active el láser nm 405 en el nivel de potencia más bajo de la fábrica (0,02 mW o 0,01 W / cm 2) y aumentar gradualmente (0,1 mW a la vez) como sea necesario hasta que hay varias decenas de moléculas por cuadro más o menos que las moléculas individuales están bien separados.
- Como la adquisición de datos continúa, graduadodualmente aumentar la potencia del láser 405 nm para mantener la densidad de terreno más o menos constante.
Nota: A menor potencia de excitación 405 nm, algunos PAmCherry1 ya se puede activar. Como estas moléculas fotoblanqueador, la población de moléculas restante PAmCherry1 fotoactivables disminuye, lo que requiere un mayor flujo de fotones para mantener la misma densidad de las moléculas que emiten fluorescencia en cada fotograma. - Continuar la adquisición de imágenes de alta potencia hasta 405 nm (2,5 a 10 W / cm 2) no se activa más eventos de activación.
Nota: El tiempo total de adquisición depende del nivel de expresión y la eficiencia de la complementación.
- Procesar las imágenes
Nota: Hay muchas opciones de software de código abierto para el procesamiento de imágenes. Ejemplos de ello son la tempestad de truenos (https://code.google.com/p/thunder-storm/) y QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Los procedimientos típicos de procesamiento de datos se ilustran brevemente aquí usando un paquete personalizado Matlab llamada wfiread para procesar datos de palma como un ejemplo. Sin embargo, las revisiones futuras no pueden seguir exactamente lo que se describe aquí. Para el procesamiento de imágenes con otro software, consulte la documentación de usuario.- Descargue el software de procesamiento de imágenes (Código Archivo Suplementario) o la versión más reciente en http://www.ohsu.edu/nan. Abra Matlab y cargar el software wfiread (que ya se puso en la ruta predeterminada).
- Ver la secuencia de imágenes en bruto y determinar la región de interés. Seleccione el área de la pila a procesar pulsando con el botón izquierdo y arrastrando un cuadro alrededor del área deseada. Si la región de interés no se redujo durante la adquisición (a alrededor de 256x256 píxeles), seleccione un área más pequeña para reducir el tiempo de cálculo. Para anular la selección de un área y procesa toda la imagen, haga clic derecho en cualquier parte ªe imagen.
- Introduzca el rango de fotogramas para ser procesada.
- Seleccione una partícula de oro (que está aislado y uniforme en forma) haciendo clic izquierdo sobre la imagen y arrastrando una pequeña caja alrededor de él. En Seguimiento de partículas, haga clic en el botón Seguir. Una gráfica aparecerá que muestra la posición de la partícula de oro seleccionado a través de la pila de imágenes, que representa la medida de la deriva.
- Repita este proceso para realizar un seguimiento de la mayor cantidad de partículas de oro como sea posible y determinar los que siguen juntos (las partículas serán codificados por color). Lo ideal sería que la deriva global es del orden de un píxel en la mayoría.
- Seleccione individualmente las partículas de oro que dio seguimiento juntos uno a la vez y haga clic en el botón Agregar marcador en Seguimiento de partículas. Una cruz verde aparecerá que significa que se ha añadido como un marcador y se usa para corregir la deriva.
- Ajuste el rango Sigma, Rango Smoothing y Umbral según sea necesario, cambiando ligeramente los valores. Haga clic en la Búsqueda de Partículasbotón para probar la configuración. Las partículas que se procesarán serán en caja y los que no lo son se quedará fuera. Las moléculas PAmCherry1, partículas que son relativamente redonda y brillante, se deben seleccionar.
- Comience el procesamiento de las imágenes haciendo clic en el botón Coord Archivo Cierre y guarde el archivo.
Nota: El programa va a ir a través de cada cuadro dentro del rango marco definido, encontrar todos los puntos fluorescentes, y realizar ajuste de Gauss para encontrar las coordenadas del centroide. Un archivo .cor se generará el almacenamiento de todas las coordenadas y otros parámetros de ajuste de las imágenes de una sola molécula procesados.
- Post-proceso de las imágenes y hacen que la imagen de la palma
Nota: Otro software puede hacer directamente la imagen después de coordinar la extracción.- En Matlab, lanzar el paquete 'palma' y cargar el archivo .cor acaba de crear.
- Antes de dictar la imagen PALM utilizando las coordenadas, ordenar las coordenadas individuales (cada uno de un 'localizatien el evento '). Los valores de clasificación óptimas pueden variar dependiendo de la configuración y el fluoróforo.
- Para PAmCherry1, utilice los siguientes valores: Combinando Frame - 8; Combinando Distancia (nm) - 100; RMS mínimo - 4; La bondad de ajuste mínimo - 0,25; y Max. Excentricidad - 1.4. Vea la sección de Discusión para la explicación adicional de estos parámetros.
- Haga clic en el botón Ordenar para generar un nuevo conjunto de coordenadas listos para el renderizado de imágenes de alta resolución.
- Introduzca valores para la prestación adecuada de la imagen final, tales como el tamaño de píxeles en bruto (nm), el tamaño de la característica deseada (nm) en la imagen renderizada, y el tamaño de píxel de la imagen renderizada.
Nota: El tamaño de píxel prima debe ser determinada para cada configuración. El tamaño de la característica mostrada puede ser fijado arbitrariamente, pero normalmente se establece en un valor ligeramente superior a la media de precisión de localización. Para PAmCherry1, la precisión media de localización es de alrededor de 18 nm, por lo que un tamaño de la característica de 20 - 30 nm es apropiaciónTE. De la nota, la precisión de localización se calculó tomando la desviación estándar de las localizaciones de la misma molécula a través de múltiples tramas 22 y no dividiendo el límite de difracción con la raíz cuadrada del número detectado de fotones. En cuanto al tamaño de píxel de la imagen renderizada, 10 nm es un buen punto de partida; establecer este valor demasiado bajo dará lugar a archivos de imagen innecesariamente grandes de puntos de vista sin ampliar. - Haga clic en el botón Render para generar la imagen PALMA. Utilice los iconos +/- de aumento en la barra de herramientas de la ventana de la figura para acercar y alejar.
- Opcional: Realice análisis de conglomerados de la imagen PALM reconstruido utilizando la prueba K de Ripley u otros mecanismos como la simulación asistida DBSCAN (SAD) 23. Nota: En el paquete de palma personalizada, tanto K de Ripley y análisis SAD ya están construidas en; para las coordenadas generadas a partir de otro software, los mismos análisis se pueden realizar con scripts personalizados adicionales.
3. Individual de Seguimiento de la molécula en células vivas - Tratar la superficie de cultivo de tejidos y la placa de las células como se describe en el Protocolo 2. Puesto que la temperatura y la o etapa controlada / CO 2 puede requerir un cierto plato de cultivo, asegurar asegurarse de que el cubreobjetos tiene el grosor adecuado (0,17 mm) para la configuración de la microscopía.
- Transfectar células si hacer una expresión transitoria y realizar cualquier tratamiento necesario para el experimento, tal como tetraciclina para inducir la expresión, y se incuba según sea necesario. Esto también es el mismo que se describe en el Protocolo 2.
- Coloque la placa de cultivo en una incubadora en el escenario. Deje el plato instalarse en el escenario durante unos minutos hasta que la temperatura y la concentración de CO 2 estabilizar cada vez que después de montar la placa de cultivo o mudarse a una nueva región de interés. Láseres Bloque en este paso. Si CO 2 de control no está disponible, cambie a un CO 2 medios de comunicación independientes justo antes de imagen, como Leibovde itz L-15.
Nota: Se recomienda medio fenol-rojo-libre para el fondo deprimente fluorescencia.
- Adquirir imágenes como en el Protocolo 2. Sin embargo, establezca un tiempo de exposición adecuada (típicamente 25 a 50 ms para PAmCherry1).
Nota: La densidad molécula debe ser inferior a la de las células fijadas de modo que las trayectorias se pueden grabar sin solaparse entre sí. Las pocas decenas de moléculas especificadas es típico para una adquisición de 256x256 píxeles en un tamaño de píxel de alrededor de 160 nm. La densidad de potencia de láser 561 nm se ajustó a 0,8 kW / cm 2 para mantener una buena relación señal-ruido, mientras que la disminución de la fototoxicidad a las células y el aumento de la longitud media de trayectoria. - Procesar las imágenes.
- Extraer coordenadas de moléculas individuales con el paquete wfiread como se describe en el Protocolo nº 2, o con otro paquete.
- Reconstruir trayectorias de las partículas individuales utilizando diferentes sola partícula de seguimiento de paquetes (SPT) en base a diferentes algoritmos encontradosen otro lugar 24. Nota: Como alternativa, este paso puede realizarse utilizando casa construida paquete Matlab (posiblemente disponible en futuras revisiones en http://www.ohsu.edu/nan.
- Opcional: Después de la reconstrucción, utilice un paquete de SPT 24 para calcular el desplazamiento y difusión constantes de las trayectorias. Además, utilice variacional Bayes seguimiento sola partícula (vbSPT) 25 para determinar los estados de difusión de las proteínas diana. paquete y documentación vbSPT Matlab se pueden encontrar en su página oficial de Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El ejemplo BiFC-PALM mostrado es KRas G12D mutante interactuar con los Ras vinculante dominio (RBD) de FARC (Figura 1). Como se ha discutido, la RN o fragmentos de RC no se marcaron a la C-terminal de Ras, ya que perturbaría la localización de la membrana y por lo tanto la actividad biológica de Ras. Esto reduce las posibles combinaciones de ocho a cuatro (Figura 1B). Cada una de estas cuatro combinaciones se introdujo en células U2OS utilizando la infección lentiviral. Las células se fijaron como se detalla en el protocolo, y las señales BiFC fueron evaluados utilizando una configuración de PALM. Las células con señales positivas BiFC fueron identificados por el brusco aumento en la fluorescencia cuando el láser 405 nm se enciende; el láser de 561 nm estaba en todo el experimento de formación de imágenes. Este cambio brusco en la fluorescencia se debe a la fotoactivación de PAmCherry1 reconstituido-BiFC tras la iluminación con el láser de 405 nm. Varias regiones de la muestra fueron evaluados utilizando este enfoque, Y la intensidad de la señal BiFC se calcula promediando el aumento de intensidades de píxel antes y después de un pulso de alta potencia desde el láser 405 nm.
Como se ve en la Figura 1C, de las cuatro configuraciones posibles, dos configuraciones (a saber, Rn-Ras / Raf RC-RBD y RN-Ras / Raf RBD-RC) tenían señales fuertes BiFC. Otra configuración (RC-Ras / Raf RBD-RN) tenía señal débil, y uno tenía ninguna señal. Para todos los experimentos posteriores, se usó el RN-Ras / Raf configuración RBD-RC (parte superior derecha en la Figura 1C). Como control negativo, una mutación puntual (R89L) en el dominio de unión a Ras de Raf se introdujo y la eficiencia BiFC usando la misma configuración se probó. Esta mutación se conoce para interrumpir Raf unión a Ras; consistentemente, la mutación reduce en gran medida la señal BiFC (Figura 1D).
Dado que las moléculas generadas a través de BiFC PAmCherry1 mostraron propiedades de fotoactivación similar a la originalPAmCherry1 10, lo que permite obtener imágenes de muestras PALM BiFC utilizando los mismos parámetros experimentales como en el PAmCherry1 padres. Una imagen PALM ejemplo de células con una fuerte señal de BiFC después de la infección con RN-Ras y Raf RBD-RC se muestra en la Figura 2A.
Cuando el zoom (abajo a la izquierda y la figura 2A inserciones, con áreas ampliadas en caja), moléculas individuales y su distribución espacial nanoescala se puede ver claramente. Es de destacar que cada punto en estas imágenes PALM representa uno putativo complejo Ras-Raf RBD etiquetados con una molécula PAmCherry1. Para la comparación, el lado derecho de la Figura 2B se simuló imágenes de baja resolución de los mismos campos de visión, donde los grupos se convirtieron completamente oscuro. La observación de las agrupaciones Ras-Raf RBD es consistente con las observaciones anteriores sobre el comportamiento agrupación de Ras y Raf.
Con células vivas que expresan BiFC reconstituyeron PAmCherry1, smt-PALM era performó adquirir trayectorias de difusión de complejos individuales Ras-Raf RBD, de manera similar al descrito previamente 10. Bajo iluminación continua con 561 nm y 405 nm láser, moléculas PAmCherry1 individuales estocásticamente encienden y duran unos cuantos fotogramas antes de entrar en estados oscuros (en parte debido a photobleaching). En este período de tiempo, las moléculas exhiben al menos dos comportamientos de difusión diferentes: un estado inmóvil (Figura 2B, molécula 1) y un estado móvil (Figura 2B, molécula 2). Ambos tipos de trayectorias están claramente presentes en el (x, y) parcela se muestra en la Figura 2C, en donde se registran las trayectorias de múltiples moléculas. La misma distribución heterogénea de los estados de difusión se puede inferir a partir del histograma de desplazamiento molecular entre cuadros sucesivos. Normalmente, 10.000 - 100.000 trayectorias de difusión se pueden adquirir a partir de cada célula; este gran número permite el análisis estadístico más riguroso de tque la difusión estados, por ejemplo, con el algoritmo vbSPT 25.
Figura 1. BiFC-PALM diseño experimental de interacción Ras-Raf. (A) Ras es una proteína unida a la membrana que recluta Raf cuando está activo. Cuando fragmentos PAmCherry1 división no fluorescentes se unen a Ras y Raf, la interacción trae los fragmentos juntos y complementación se produce, lo que resulta en una proteína fluorescente funcional. (B) Desde el etiquetado de Ras en su C-terminal pueda interrumpir su localización en la membrana, el número de configuraciones probadas por Ras-Raf BiFC-PALM se redujo de ocho a cuatro. (C) Imágenes de células U2OS expresan las configuraciones probadas tomadas con un microscopio TIRF. Para medir la eficiencia BiFC de cada configuración, las células tienen la misma alta dosis de 405 nm, mientras que la luzsiendo excitado con luz 561 nm. (D) La introducción de la mutación R89L en el Raf RBD reducido en gran medida la señal BiFC de la configuración de RN-KRas G12D / FARC RBD-RC (arriba a la derecha en C, n = 5-8). Las barras de error son SEM en (D). Las barras de escala en (C), 10 m. RN = PAmCherry1 N-terminal fragmento, fragmento RC = PAmCherry1 C-terminal, y RBD = Ras dominio de unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. BiFC-palma de células U2OS expresan la configuración RN-KRas G12D / FARC RBD-RC. (A) Una imagen PALM entera se muestra arriba. Paneles inferiores se magnifican vistas de las regiones en caja en la imagen superior, como se indica. Inserciones son más altosampliaciones de las regiones en caja en los respectivos puntos de vista ampliada. El lado derecho de los paneles inferiores (TIRF etiquetado) son representaciones de las imágenes en su izquierda, como si se toma con un microscopio de difracción limitada. (B) Los sucesivos fotogramas de una célula viva experimento smt-PALM que representan (1) y rápidas (2) móviles complejos Ras-Raf lentas. (C) La producción de un experimento smt-PALM mostrando las trayectorias de difusión de los complejos de Ras-Raf dentro de una pequeña área de una célula. (D) Histograma de desplazamientos por trama de complejos Ras-Raf de un experimento smt-PALMA. Las barras de escala en (A), 5 micras superiores, inferiores 500 nm, 50 nm inserciones, y (C), 1 m. RN = PAmCherry1 N-terminal fragmento, fragmento RC = PAmCherry1 C-terminal, y RBD = Ras dominio de unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Secuencia de cebador (5 'a 3') | |
| La clonación de plásmido para la inserción en el extremo N-terminal inversa | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN en el extremo N-terminal hacia adelante | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC en el extremo N-terminal hacia adelante | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| La clonación de plásmido para la inserción en el C-terminal hacia adelante | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN de C-terminal inversa | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC de C-terminal inversa | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabla 1. Los cebadores para linealizar los plásmidos de clonación que contienen fragmentos PAmCherry1. Los plásmidos de clonación que contienen RN y RC se puede linealizar con PCR inversa en el punto de inserción en cualquiera de los extremos N- o C-terminal de los fragmentos. Las secuencias se enumeran 5 'a 3R17 ;.
| Voladizos para gen de cebadores de interés (5 'a 3') | |
| RN inserción N-terminal o RC adelante | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminal RN inserción inversa | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminal de inserción RC inversa | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminal de inserción RN hacia adelante | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| Inserción C-terminal RC adelante | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminal RN inserción o RC inversa | GCGCCCACCCTTTTA |
Tabla 2. Salientes para el gen de cebadores de interés que responden a la tabla 1 se cebadores. Los 15 pares de bases de homología para la reacción de ligadura independiente se generade voladizos de cebadores. Además, los voladizos incluyen la secuencia para un (GGGGS) x2 enlazador flexible. La secuencia de enlazador flexible se puede añadir a los cebadores en la Tabla 1 en su lugar. Las secuencias se enumeran 5 'a 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC ha sido una técnica comúnmente utilizada para la detección y la visualización de los IBP en las células, mientras que PALM es una técnica de microscopía reciente sola molécula de super-resolución que permite formación de imágenes a nanoescala de muestras biológicas intactas. La combinación de BiFC con PALM logra imagen selectiva de los IBP en el interior de una celda con nanómetros resolución espacial y sensibilidad única molécula. BiFC-PALM extiende la utilidad de ambas técnicas, y como se demuestra en este trabajo, muestra una gran promesa en la revelación de los detalles moleculares de los IBP en su contexto celular nativo. En particular, la resolución nanométrica permite investigación detallada de la regulación espacial y temporal de los IBP específicas a escala molecular, que ha sido un reto en la investigación biomédica. Sin embargo, como se mencionó antes, BiFC-PALM está limitada por la irreversibilidad de la complementación y la maduración cromóforo lento.
Dividir PAmCherry1 se utilizó para demostrar el principio y Utilidad de BiFC-PALMA. PAmCherry1 ha sido ampliamente utilizado en los experimentos PALM por sus excelentes propiedades fotofísicas. Un beneficio adicional del uso de PAmCherry1 como la sonda BiFC es el bajo fondo y alta especificidad y eficiencia en la reconstitución de proteína a 37 ° C cuando se acopla a los IBP. Por estas razones, se espera que la sonda PAmCherry1 BiFC dividida para convertirse en un valioso recurso aplicable a muchas investigaciones biológicas diferentes que implican alta resolución de imagen de los IBP. Además de PAmCherry1, una proteína fluorescente fotoconvertible, mEos3.2, también se dividió para BiFC-PALM 26. Debido a que sus espectros de emisión se solapan, mEos3.2 PAmCherry1 y no se pueden utilizar juntos, pero verde PA-MF han sido reportados recientemente 27, abriendo la posibilidad de formación de imágenes de dos colores superresolución a nanoescala de IBP.
Al igual que en BiFC convencional, un paso crítico en la implementación BiFC-PALM es el diseño y la clonación de las construcciones de fusión. El hecho de que hastaocho construcciones de expresión diferentes que ser clonado y ocho pares BiFC que ser probado en cada intento de implementar BiFC y BiFC-PALM puede ser un tedioso, si no es prohibitivo, proceso. Sin embargo, como se ilustra en el ejemplo Ras-Raf, el conocimiento previo sobre las propiedades bioquímicas y estructurales de las proteínas de interés a menudo puede ser usado para guiar un diseño optimizado de las construcciones de fusión con un número reducido de pares BiFC a ensayar. Dicho esto, en la actualidad no hay una pauta universal a asegurar que un BiFC (de ahí BiFC-PALM) experimento funcionaría; gran parte de ella sigue siendo un arte.
Mientras BiFC y BiFC-PALM se utilizan normalmente para investigar la formación de heterodímeros entre dos proteínas, también es factible estudiar la formación de homodímero utilizando estos enfoques, en cuyo caso las dos proteínas candidatos sería el mismo. Sin embargo, como tal, dos proteínas con el mismo fragmento pueden interactuar pero no dar lugar a la señal BiFC. A pesar de cada constructo en calidad deun inhibidor competitivo a los otros, tales interacciones son reversibles, mientras que las interacciones que resultan en la complementación con éxito acumularían debido a la irreversibilidad. En general, podría haber una reducción en la señal si hay una diferencia drástica entre los niveles de expresión de cada construcción. Por lo tanto, pueden necesitar ser determinada cuando se comparan las intensidades de fluorescencia (por ejemplo, entre el tipo salvaje y mutantes muestras homodímero) en los niveles de expresión endógenos los niveles de expresión de las dos construcciones. Tal vez por eso los experimentos BiFC se realizan comúnmente con transfecciones transitorias y la sobreexpresión de las construcciones.
Por último, pero no menos importante, todos los experimentos BiFC deben confirmarse con los controles adecuados. Si la señal BiFC está presente, hay una posibilidad de que la señal es no específica (es decir, los fragmentos se reconstituir por sí mismos y no a causa de la PPI). Un control negativo es mutaciones en cualquiera o ambas proteínas que se sabepara interrumpir la interacción, lo que debería resultar en una pérdida significativa de señal BiFC. Si una mutación tal punto es desconocida, otros métodos pueden ser utilizados, tales como la introducción de una pareja de unión competitiva para una de las proteínas y ver si hay una disminución concomitante en la señal.
La situación más difícil es solucionar un falta de señal BiFC o falsos negativos. En tales casos, es importante incluir controles positivos durante el proceso de clonación, tales como un control GFP durante transfecciones. Transferencias de Western pueden realizarse para evaluar la expresión de las construcciones. Si estos factores son normales, pueden necesitar ser cambiado, como la longitud del enlazador y / o secuencia, o una configuración diferente BiFC debe considerarse otros factores.
En cuanto a la parte de PALM, un número de parámetros debe ser considerada cuando se procesan las imágenes. Paso 2.4.2.1 se describen los parámetros utilizados para la clasificación de las coordenadas y generar la imagen PALM final. El primerodos parámetros, que combina marco y combinando Distancia, definen si dos eventos de localización están a menos de 100 nm y aparecen menos de 8 fotogramas (a 100 ms / marco) o ~ 0,8 seg apartado como hemos descrito previamente 23. Si es así, entonces se considerará que surgen de la misma molécula, y sus coordenadas se combinarán promediando. Estados oscuros con tiempos de vida muy superiores a 0,8 seg para PAmCherry1 parece ser poco frecuente; como el caso de un fluoróforo se recupera de un estado oscuro de larga vida es indistinguible de una molécula diferente en una fluorescencia distancia proximal emisores de luz, dos eventos de localización se consideran derivados de la misma molécula sólo si aparecieron dentro de un cierto número de fotogramas y distancia física. Empíricamente, un entorno 'combinar marco' en 8-12 marcos (0,8 a 1,2 seg) parece ser óptima en nuestras condiciones experimentales. RMS mínimo define la relación entre la amplitud mínima de ajuste y la desviación estándar del ruido de residuo después deel accesorio. Estos valores se registran en el archivo de coordenadas .cor durante la extracción.
En resumen, BiFC-PALM combina las ventajas de BiFC y Palm y permite la investigación de los IBP en mucho más detalle de lo que se ha logrado con anterioridad. Con las consideraciones para los factores antes mencionados y con los experimentos de control apropiados, BiFC-PALM debe ser una herramienta útil para el estudio de los IBP en una amplia gama de ajustes biológicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L.
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
