Introduction
Protein-protein interaktioner (PPI) er grundlæggende for biologi 1 og er stramt reguleret via spatiotemporale mekanismer på tværs af mange tid og længde skalaer. Undersøgelser af celle signalering på cellemembranen, for eksempel, har afsløret dynamiske nanostørrelse rumlige rum, der letter specifikke PPI og cellulære processer 2. Derfor er evnen til at sondere PPI i biologiske systemer med tilstrækkelige rumlige og tidslige resolutioner, høj specificitet og høj følsomhed er nøglen til at opnå en mekanistisk forståelse af biologi.
Bimolekylære fluorescens komplementering (BiFC) er en af de få eksisterende værktøjer til at visualisere PPI i en celle med subcellulær opløsning og leve-celle kompatibilitet 3-5. Teknikken er relativt ligetil og involverer opsplitning af en fluorescens protein i to ikke-fluorescerende fragmenter; når genetisk kodet til to interagerende proteiner ogbringes i nærhed, kan fragmenterne rekonstituere at danne en komplet fluorescerende protein, hvilket gav fluorescerende signal. Når korrekt udformet, bør BiFC sonder ikke spontant rekonstituering i mangel af PPI. Som sådan vil fluorescens signal i et BiFC assay kun opstå i overværelse af PPI, som muliggør direkte visualisering af PPI med høj specificitet. Yderligere fordele ved anvendelse af fluorescens som udlæsningen er høj følsomhed, subcellulær opløsning og kompatibilitet med højt gennemløb og højt indhold screeningsassays, blandt andre. For disse fordele, er der blevet udviklet en række BiFC prober baseret på forskellige forældre fluorescerende proteiner. Som i alle andre detektionsteknikker baseret på konventionelle lysmikroskopi imidlertid den rumlige opløsning af BiFC begrænset til ~ 250 nm ved diffraktion af lys. Dette gør det til en udfordring at studere reguleringen af PPI på nanoskala, der, som hentydede tidligere og eksemplificeret ved lipidklumper 6 and Ras nanoclusters 7, er en kritisk længde skala til at forstå mange cellulære processer, såsom signalering.
BiFC er blevet kombineret med fotoaktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) 8,9 for at overvinde denne grænse i rumlig opløsning til billeddannelse PPI'er 10. PALM er en nyere superresolution mikroskopi teknik, der omgår diffraktionsgrænsen i fluorescens billeddannelse gennem stokastisk aktivering og subdiffractive lokalisering af enkelte fluorescerende molekyler. I hver aktivering cyklus, et fluorescerende molekyle udsender et par hundrede til nogle få tusinde fotoner og giver anledning til et enkelt molekyle billede på detektoren. Mens billedet er diffraktionsbegrænset (~ 250 nm i bredden), dens tyngdepunkt kan bestemmes med meget større præcision, typisk i størrelsesordenen 10-50 nm afhængigt af antallet af fotoner detekteret. Ved at aktivere og lokalisere hvert fluorescerende molekyle i prøven, kan en høj opløsning billede rekonstrueres. Performed på levende celler, enkelt molekyle tracking (smt-) PALM yderligere tilladelser erhvervelse af tusindvis af protein diffusion baner fra en enkelt celle 11. Det er vigtigt, anvender PALM specialiserede fluorescerende prober såsom fotoaktiverbare fluorescerende proteiner (PA-RP) for at opnå stokastisk aktivering. Da både BiFC og PALM brug fluorescerende proteiner, blev de samlet ved at opdele PAmCherry1, et almindeligt anvendt PA-FP for PALM, i to fragmenter mellem aminosyrer 159 og 160.
Det BiFC system baseret på split PAmCherry1 viser lav baggrund signal fra spontan rekonstituering af de to fragmenter. Når genetisk mærkede til et par interagerende proteiner, de to fragmenter (RN = resterne 1-159, RC = Met + rester 160-236) rekonstitueret effektivt til at danne komplette PAmCherry1 proteiner selv ved 37 ° C og uden inkubering ved lavere temperaturer, hvilket er ikke tilfældet for andre BiFC par 12 som den forælder mCherry 13. Furthermore, den rekonstituerede PAmCherry1 protein beholdt fotofysiske egenskaber moderselskabets PAmCherry1, såsom højt kontrastforhold, medium foton udbytte, og hurtigt fotoaktivering, blandt andre, som er afgørende for præcis enkelt molekyle lokalisering og høj opløsning PALM billeddannelse.
I denne protokol, brug af BiFC-PALM til billeddannelse Ras-Raf interaktioner i U2OS celler ved hjælp af split PAmCherry1 (figur 1A) er beskrevet. Det første trin er at designe konstruktionerne til ekspression af fusionsproteiner mellem PAmCherry1 fragmenter (dvs. RN og RC) og proteinerne af interesse. I teorien, for hvert par af kandidat-proteiner (A og B), er der otte par fusionsproteiner der skal testes: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; og A-RC / B-RN. Denne proces kan ofte forenkles ved at tage hensyn til de strukturelle eller biokemiske egenskaber af kandidat-proteiner. I tilfælde af Ras proteinet erposttranslationelt modificeret ved C-terminale CAAX (C = Cys; A = alifatisk; X = en hvilken som helst), hvorefter AAX motivet fraspaltes. Derfor kan RN eller RC kun fusioneret til N-terminalen af Ras; Dette reducerer antallet af fusionsprotein par til fire (figur 1B). For Raf, Ras-bindingsdomænet (RBD -rester 51-131) anvendes, og kan mærkes i begge ender. Disse fire fusion konfigurationer blev genereret: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; og RC-KRAS / Raf RBD-RN.
Derudover vil linkeren mellem fragmenterne og proteinerne af interesse skal overvejes. En fleksibel linker på ca. ti aminosyrer anvendes ofte, da det giver tilstrækkelig frihed til komplementation at forekomme. En sådan linker er (GGGGS) x2, selv om der er mange andre, der er blevet anvendt med succes, herunder vilkårlige sekvenser genereret fra et multipelt kloningssted (MCS) 14. Længden af linkerne kan være nødvendigt at optimere depending af størrelsen af proteinerne af interesse og deres orienteringer, når de vekselvirker.
De PAmCherry1 fragmenter er indeholdt i en lille kloning backbone med flankerende MCSS (se Materialer List). Gener af interesse kan indsættes via restriktionssteder eller med en ligation-uafhængig metode. Efter kloning og sekvensanalyse kontrol, er ekspressionskassetten overført til en ekspressionsvektor under anvendelse af en rekombinase reaktionen blev en kloning processen med high fidelity og høj effektivitet.
Dernæst følger ekspressionskonstruktioner transficeret i målcellen linje eller, hvis der ønskes en stabil cellelinie, pakkes i lentivirus til at inficere målcellen linje. Transient transfektion giver mulighed for hurtig validering af BiFC konfigurationer, men potentielle problemer, skal noteres. Transfektion ved hjælp kemikalier ofte understreger cellerne, hvilket resulterer i høj autofluorescens; mens anvendelsen af total indre refleksion fluorescens (TIRF) microscopy kan afbøde denne baggrund signal ved at begrænse belysningen volumen, TIRF ideel, når de PPI finde sted på cellemembranen. Derudover transiente transfektioner ofte føre til høje niveauer af proteinekspression, der langt overstiger de af endogene proteiner, som kan forårsage artefakter i detektering af PPI. Det derfor anbefales, at stabile cellelinier etableres efter en passende BiFC konfiguration er bestemt ved første afprøvning. Stabile cellelinier har også potentiale for afstemmelige udtryk via doxycyclin induktion 15.
Efter infektion blev celler vælges med antibiotika, typisk puromycin og neomycin, en for hver konstruktion. De efterfølgende trin for prøveforberedelse, billedoptagelse, og dataanalyse vil blive beskrevet i detaljer i protokollerne.
Med denne fremgangsmåde, er dannelsen af nanoskala klynger i BiFC-PALM billeder af Ras-Raf RBD rutinemæssigt observeret (figur 2A </ strong>). Konsekvent, smt-PALM baner af Ras-Raf RBD viser en heterogen fordeling i diffusion stater (figur 2B-D). Disse resultater tyder på, at der findes Ras-Raf komplekser i flere stater på cellemembranen, formentlig som monomerer og klynger, med potentielle biologiske implikationer. Dette arbejde demonstrerer magt BiFC-PALM i selektiv billeddannelse af PPI i celler med nanometer rumlig opløsning og enkelt molekyle følsomhed, hvilket ville være vanskeligt at opnå med konventionel BiFC, fluorescens co-lokalisering, eller fluorescensresonansenergioverførsel (FRET).
Ved udformningen BiFC eksperimenter og fortolkning af resultater, er det vigtigt at huske på, at BiFC er irreversibel i de fleste tilfælde, herunder split PAmCherry1. Når de to fragmenter danner et komplet PAmCherry1 protein, forbindelsen mellem de to fragmenter og kombinere og dermed PPI bliver permanent. Dette begrænser brugen af BiFC og BiFC-PALM til overvågning af dynamikken i PPI (dvs. bindingskinetik og ikke de diffusions- dynamik proteinkomplekset snart den er dannet), og til tider kunne endda føre til mislocalization af PPI komplekser.
En yderligere faktor til at overveje, når designe BiFC-PALM eksperimenter er forsinkelsen i kromofor modning, der ligger i fluorescerende proteiner. Når to proteiner interagerer og FP fragmenter kommer sammen, de typisk genfolde af størrelsesordenen sekunder (halv tid på 60 sek til EYFP 3). Dog medfører efterfølgende kromofor modning og fluorescerende signal udvikle sig på størrelsesordenen minutter. Mens fluorescens kan være påviselig inden for 10 min efter opløsning af split-Venus, en hurtigt folde YFP variant den halve tid til modning i almindelighed er ofte omkring 60 min 16. Split-PAmCherry1 blev observeret at have lignende priser. Derfor BiFC og BiFC-PALM i øjeblikket dårlige valg til overvågning i realtid PPI kinetik; andre migthods, såsom FRET og en nylig udviklet dimerisering afhængige fluorescerende protein 17, kan være mere egnet til dette formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning
- Bestem konfigurationerne at klone og vælge en linker. Tag proteiner med fragmenterne på N- eller C-terminalen som beskrevet nedenfor, så de ikke forstyrrer deres korrekte lokalisering. Brug en fleksibel linker såsom (GGGGS) x2.
- Genetisk tagge proteinerne af interesse for PAmCherry1 fragmenter. Som en option, skal du bruge kloning plasmider er anført i Materialer liste med fragmenter RN (PAmCherry1 resterne 1-159) og RC (Met plus PAmCherry1 rester 160-236) med flankerende MCS sekvenser.
- Linearisere de plasmider, som indeholder fragmenterne RN og RC med omvendt PCR (eller restriktionsfordøjelse) ved punktet for indsættelse. Primere til omvendt PCR er vist i tabel 1. Nedenfor er et eksempel PCR protokol, der bruges i forfatterens laboratorium (se Materialer liste for de nøjagtige materialer, der anvendes i denne protokol).
- Bland PCR-reaktionen sammen, bringes op på et slutvolumen på 50 pi med vand: til en tyndvæggeted PCR-rør, tilsæt vand, 25 pi 2x mastermix, 0,5 pi hver af de fremadrettede og reverse primere (20 uM fortyndet materiale, 0,2 uM slutkoncentration), og 1 ng template. Brug følgende cyklusbetingelser: 98 ° C i 30 sek, 30 cyklusser af 98 ° C i 7 sek og 68 ° C i 2 minutter, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 minutter.
- PCR generne af interesse for indsættelse af de lineariserede plasmider indeholdende RN og RC-fragmenter. Udfør PCR som i trin 1.2.1 med forlængelsestiden ved 68 ° C. Brug primere med overlap, der indeholder en fleksibel linkersekvens, såsom GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT for (GGGGS) x2 og 15 basepar homologi med enderne af det lineariserede RN og RC plasmider til rekombination.
Bemærk: De primer udhæng for proteinerne af interesse er vist i tabel 2, hvis anvendelse af primerne i tabel 1 til linearisering plasmidrygraden. - Fordøje PCRomsætning med Dpn1 at fjerne PCR template. Tilsæt 0,5 pi Dpn1 (20 U / ul) direkte til de 50 pi PCR-reaktion. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time og varmeinaktiveres ved 80 ° C i 20 minutter. Hvis baggrund skabelon fortsætter i senere trin, øger enzymet beløb eller forlænge fordøjelsen tid.
- PCR-produkterne renses via et spin søjle som beskrevet af producenten.
- Udfør en ligering-uafhængig reaktion at kombinere et lineariseret plasmid indeholdende en RN eller RC fragmentet med genet af interesse. Måle koncentrationen af de oprensede PCR-produkter: kombinere 50 ng lineariseret plasmid og 50 ng af genet af interesse med 1 pi enzym premix og bringe det totale volumen til 5 pi med deioniseret vand. Der inkuberes ved 50 ° C i 15 minutter, anbring på is, og der tilsættes 20 pi TE-buffer.
- Omdan rekombinante plasmider til kompetente bakterier 18.
- Vælg 2-4 + (som ønsket) kolonier for O / N-kulturen. Der tilsættes 5 mlLB bouillon og 5 pi kanamycin (50 mg / ml stamopløsning) i en 14 ml polypropylen rundbundet rør og tilføje det valgte bakterier koloni med en steriliseret inokuleringslokke. Der inkuberes ved 37 ° CO / N under omrystning ved 225 rpm.
- Frys 1 ml O / N-kulturen for glycerol stock 19 og minipræp resten som beskrevet af producenten.
- Udfør sekventering for at bestemme et godt klon. Hvis du bruger kloningen plasmider i Materials List, bruge M13 frem og bak primere (i separate reaktioner) som er nødvendigt for at opnå den fuldstændige sekvens af fusionskonstruktet. Sammenligne med den forventede sekvens ved hjælp af en tilpasning værktøj såsom BLAST fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Overfør sekvensverificeret konstruktioner til et ekspressionsplasmid via en rekombinase reaktion.
- Tilføj 75 ng på destinationen plasmidet & #8212; såsom pcDNA for transiente transfektioner eller pLenti for lentiviral emballage 20 - og 50 ng af det rekombinante kloningsplasmid til 1 pi enzym premix og hente et samlet volumen på 5 pi med deioniseret vand. Der inkuberes ved 25 ° C i 1 time, hvorefter der tilsættes 5 pi TE-buffer.
Bemærk: lentiviral emballage og stabil cellelinie generation, bruge en anden destination plasmid for hver konstruktion, for eksempel, den ene med puromycin modstand og den anden neomycin. Dette giver mulighed for dobbelt markering af transducerede celler. Overvej også promotoren for hver, som den konstitutive cytomegalovirus (CMV) promotor for høje ekspressionsniveauer, eller CMV med TetO operatør for afstemmelige doxycyclin-reguleret ekspression. - Transform 5 pi i kompetente bakterier og minipræp plasmiderne som i trin 1.2.6 til 1.2.8, men anvendelse af det passende antibiotikum (typisk ampicillin).
- Tilføj 75 ng på destinationen plasmidet & #8212; såsom pcDNA for transiente transfektioner eller pLenti for lentiviral emballage 20 - og 50 ng af det rekombinante kloningsplasmid til 1 pi enzym premix og hente et samlet volumen på 5 pi med deioniseret vand. Der inkuberes ved 25 ° C i 1 time, hvorefter der tilsættes 5 pi TE-buffer.
- Linearisere de plasmider, som indeholder fragmenterne RN og RC med omvendt PCR (eller restriktionsfordøjelse) ved punktet for indsættelse. Primere til omvendt PCR er vist i tabel 1. Nedenfor er et eksempel PCR protokol, der bruges i forfatterens laboratorium (se Materialer liste for de nøjagtige materialer, der anvendes i denne protokol).
- Bestemme den optimaleBiFC konfiguration.
- Co-transfektion af ekspressionsplasmiderne i U2OS celler (eller celler af valg).
- Tilføj 350 pi phenolrødt-frit og antibiotika-fri DMEM suppleret med 10% FBS i hver brønd i en 8-brønds # 1.5 glasbund kammer slide. Plade ca. 7,5 x 10 4 celler per brønd, så celler er omkring 70% -90% konfluente den næste dag.
- Dagen efter udpladning, co-transficere ekspressionsplasmider med forskellige konfigurationer i hver brønd under anvendelse af det foretrukne reagens og som beskrevet af producenten.
- For hver brønd tilsættes 125 ng af hver ekspressionsplasmidet i 50 pi serumfrie reducerede medier i en 0,6 ml rør og pipette op og ned for at blande. Tilsæt 1 pi af transfektionsreagens ned i midten af røret og direkte ind i mediet. Omryst forsigtigt for at blande og lad reaktionen sidde i 30 minutter.
- Reducer medier i hver brønd af kammeret slide med omkring halvdelen. Dråbevis transfektionsblandingen Tilføj til brøndene og ryst gladende at blande. Cellerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 24-48 timer. Skift medierne dagen efter transfektion.
- Billede celler på et fluorescens mikroskop som i protokol 2 begynder med trin 2.1.4.
Bemærk: Prøven kan afbildes på en standard fluorescensmikroskop hvis ekspressionsniveauer er høje, og kameraet er følsom nok til relativt lave foton produktion af PAmCherry1. Rekonstituerede PAmCherry1 molekyler kan aktiveres med en ultra violet filtersæt (405 nm) før billeddannelse med en grøn excitation (561 nm) filtersæt.
- Co-transfektion af ekspressionsplasmiderne i U2OS celler (eller celler af valg).
- Hvor det er relevant, at skabe en negativ kontrol ved for eksempel, at indføre en punktmutation til et af proteinerne af interesse, der forstyrrer interaktionen. Udfør en site-directed mutagenese 21 på kloningsplasmid af proteinet, der skal muteres, og af den valgte konfiguration.
- Generere en stabil cellelinie ved emballering af konstruktioner i viralpartikler og inficere U2OS celler (eller cellelinie valg). Overvej en inducerbar (tetracyclin) ekspressionssystem 15 så udtryk kan induceres før billeddannelse, hvis langvarig irreversibilitet BiFC er et problem, eller hvis afstemmelig udtryk ønskes.
ADVARSEL: Arbejde med virus er klassificeret som biosikkerhedsniveau 2. Mens de seneste generationer af virale emballage systemer i høj grad har reduceret sandsynligheden for at producere replikationskompetente vira, nogle risici er stadig til stede. Referencer kan findes på http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.- Gentag trin 1.2.10 hjælp af en lenti- eller retroviral vektor destination 20. Øge O / N-kulturen til 100 ml til en midiprep og større renhed af plasmiderne.
- På dag 1: Plate ca. 2 x 10 6 293T / 17 celler i en 10 cm skål for hver konstruktion, der skal pakkes.
- På dag 2: Forbered en transfektion reaktion ved hjælp af en transfection reagens med valg og som beskrevet af producenten.
- Der fremstilles en forblanding af emballage plasmider med slutkoncentrationer på 250 ng / pl til emballering af plasmider 1 og 2, og 100 ng / pl til emballering af plasmid 3 i sterilt vand. Tilsæt 10 ul af pakning plasmid premix og 2,5 ug målplasmidet til 1 ml serumfrie medier i nedsatte en 5 ml polypropylen rundbundet røret og pipetten op og ned for at blande. Tilsæt 20 pi transfektionsreagens ned i midten af røret og direkte ind i mediet.
- Omryst forsigtigt for at blande og inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter. Fjern ca. halvdelen af mediet fra cellerne og tilføj transfektionsblandingen på en dråbevis måde. Ryst forsigtigt for at blande og inkubere ved 37 ° C og 5% CO2. Inkuber 10 ml medium pr plade i et rør med hætten løsnet for temperatur og CO 2 ligevægt.
- På dag 3: ændre forsigtigt mediet med præinkuberet medier og return cellerne til inkubatoren. Inkubér andet rør af medier med hætten løsnet.
Bemærk: Syncytia, eller dannelsen af store multi-celler med kerne, kan være et tegn på, at emballagen går godt. Men cellerne er i en skrøbelig stat og kan nemt adskilles. Når der skiftes medier, vippe pipette, således at den er vandret, og tilsæt dråbevis mediet i den ene kant af pladen. - På dag 4: indsamles virusset ved at fjerne mediet med en sprøjte og filtrering gennem et 0,45 um porestørrelse filter over i en ren 50 ml rør. Erstatte forsigtigt mediet med præinkuberet medier.
- På dag 5: Harvest igen som gjort tidligere i trin 1.5.3.3 og fælles filtrat kombineres i den samme 50 ml rør. Tilsæt 6 ml virus koncentrator til hvert rør og blandes. Opbevares ved 4 ° C i mindst 24 timer, indtil virus bundfald.
Bemærk: Afhængigt af sundheden af cellerne, kan virus høstes en tredje gang. - Koncentrer virus ved centrifugering ved 1500 xgi 15 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 250 pi medier. Virus kan umiddelbart anvendes til infektion eller opbevares i 50 pi alikvoter ved -80 ° C i op til et år.
- Plade omkring 3 x 10 5 U2OS (eller target) celler per brønd i en plade med 6 brønde (2 ml DMEM med 10% FBS pr brønd) i infektion, så celler er omkring 50% sammenflydende på tidspunktet for infektion.
- Den følgende dag fjernes omkring halvdelen af medier, så ca. 1 ml tilbage. Coinfect med 50 pi koncentreret virus for hver konstruktion. Tilsæt 1 pi polybren (8 mg / ml) til hver brønd. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2. Skift medier den næste dag og inkuberes i en dag før antibiotisk selektion.
Bemærk: Mængden af virus at tilføje kan variere afhængigt af den ønskede hastighed for infektion. Virus kan titreres ved hjælp af QRT-PCR. - Tilføj antibiotika for at vælge for inficerede celler. Separate brønde med ikke-inficerede celler, der ikke har set VIrus er påkrævet som kanariefugle for at teste effektiviteten af markeringen. Inkuber i 2-7 dage, eller indtil Valget er nu fuldført.
Bemærk: Effektive koncentrationer bør titreres i første omgang, men de er typisk 1,0 ug / ml for puromycin og 1,0 mg / ml for neomycin. - Udvid cellerne i en større 10 cm skål og gå videre til protokol 2.
- Der fremstilles en forblanding af emballage plasmider med slutkoncentrationer på 250 ng / pl til emballering af plasmider 1 og 2, og 100 ng / pl til emballering af plasmid 3 i sterilt vand. Tilsæt 10 ul af pakning plasmid premix og 2,5 ug målplasmidet til 1 ml serumfrie medier i nedsatte en 5 ml polypropylen rundbundet røret og pipetten op og ned for at blande. Tilsæt 20 pi transfektionsreagens ned i midten af røret og direkte ind i mediet.
2. Imaging Fixed Celler
- Forbered en prøve til billedbehandling
- Ren en 8-brønds # 1.5 glasbund kammer slide ved tilsætning 250 pi 1 M NaOH i mindst 1 time og vask grundigt med PBS.
Bemærk: Ubehandlede kammerskiver typisk resultere i høje baggrundssignal. Derudover kan celler være følsomme over for tilbageværende NaOH og manglende rengøre glasoverfladen (så mange som 10x gange vask) kan gøre celleadhæsion vanskelig. Hvis det er nødvendigt, inkuberes den rensede kammeret slide med PBS O / N efter vask. For følsomme cellelinjer, plating ved en højere densitet(Fx ved 50% -60% indledende konfluens), kan hjælpe. - Plade ca. 5,5 x 10 4 af U2OS stabil ekspression celler per brønd i 350 pi phenolrødt-frit DMEM med 10% FBS, således at cellerne er sunde og ikke over sammenflydende når billeddannelse.
- Foretag de nødvendige behandlinger for eksperimentet, såsom tilføjelse tetracyclin at inducere proteinekspression.
- Fikseres cellerne umiddelbart før billeddannelse.
- Forud for fiksering, forberede frisk paraformaldehyd (PFA) løsning - 3,7% PFA i 1x Phem med 0,1% glutaraldehyd (GA). For 10 ml PFA løsning, vejer 0,37 g PFA og overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der tilsættes 1 ml destilleret vand og 30 pi 1 M NaOH og vortex. Opvarm ved 70 ° C og vortex hver 1-2 min, indtil PFA er fuldstændigt opløst.
- Overførsel opløst PFA til en 15 ml konisk rør, og der tilsættes 3,8 ml destilleret vand, 5 ml 2x Phem buffer, 20 pi 25% glutaraldehyd, og vortex at blande. Lager, 2x Phem buffer er 120 mM PIPES, 50 mM Hepes, 20 mM EGTA og 16 mM MgSO4, med pH justeret til 7,0 med 10 M KOH. Denne fikseringsopløsning kan opbevares ved 4 ° C i flere dage.
ADVARSEL: PFA og GA er begge farlige. Forbered løsningen i et stinkskab og slid passende beskyttelsesudstyr, når du håndterer både kemikalier. Undgå indånding eller direkte hudkontakt. - Fjern vækstmediet. Vask hurtigt med 500 pi PBS, og der tilsættes 250 pi af PFA fiksativ per brønd. Inkubér cellerne i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern PFA fiksativ fra prøven, og der tilsættes 350 pi PBS eller billeddannende buffer (100 mM Tris med 30 mM NaCl og 20 mM MgCl2, pH 8,5) pr.
- Vortex 100 nm guldpartikler til at bryde op aggregater og tilsæt 35 pi per brønd (10x endelig fortynding) til sporing af fase afdrift under billedbehandling.
- Ren en 8-brønds # 1.5 glasbund kammer slide ved tilsætning 250 pi 1 M NaOH i mindst 1 time og vask grundigt med PBS.
- Anskaf billeder
- Tænd mikroskopet. Tænd de 405 og 561 nm lasere, men holde skodderne(intern eller ekstern) lukket på dette tidspunkt. Tænd EMCCD kamera og lad det køle af. Sørg for, 561 nm filtre er på plads.
- Åbn erhvervelse software og indstille eksponeringen tid til 100 ms, og EMCCD gevinst til 300 (interval 1 - 1000).
- Tilføj fordybelse olie til målet og fastgør prøven til mikroskop scenen.
- Med enten lyse felt eller 561 nm laser på (~ 1 kW / cm 2), bringe prøven i fokus.
- Til billeddannelse Ras og andre membranproteiner, bruge en 60X Apochromat TIRF mål med 1,49 numerisk apertur og bringe mikroskopet i TIRF konfiguration. Juster excitation laser således at det er dårligt centreret, når den rammer bagsiden åbning i TIRF mål; dette medfører laser til at afbøje ved ankomsten til prøven. Hold justere laseren indtil den kritiske vinkel er nået, og laseren bliver reflekteret tilbage. Søge efter en celle af billedet med flere guldpartikler i betragtning. Sæt et område af interesseder omslutter cellen (eller en region i cellen) og guldpartikler.
Bemærk: TIRF nedsætter indtrængningsdybde excitation laser og reducerer ude af fokus baggrundssignal. Derudover drift korrektion vil sandsynligvis være mere nøjagtig, når flere guldpartikler i betragtning. - Hvis det er tilgængeligt, engagere autofokus-system til at korrigere for prøve afdrift i z-retningen. Ellers justere fokus manuelt hele købet, hvis billedet går ud af fokus.
- Begynd købet med 405 nm laseren og 561 nm laseren på (~ 1 kW / cm 2) i tilstrækkelig aktivering tilfælde forekommer allerede (typisk hvis ekspressionsniveauer er høje). Ellers tænde 405 nm laser på det laveste fabrikken power indstilling (0,02 mW eller 0,01 W / cm2) og stige gradvist (0,1 mW ad gangen) som nødvendigt, indtil der er flere snese molekyler pr ramme eller at enkelte molekyler er godt adskilt.
- Som dataopsamling fortsætter, gradviduelt stige 405 nm laser magt for at holde stedet tæthed nogenlunde konstant.
Bemærk: Ved lavere 405 nm excitation magt, kan nogle PAmCherry1 allerede være aktiveret. Da disse molekyler photobleach, populationen af resterende fotoaktiverbare PAmCherry1 molekyler falder, hvilket kræver en højere fotonflux at opretholde den samme densitet af molekyler udsender fluorescens i hver ramme. - Fortsæt billedet anskaffelsen indtil høj 405 nm effekt (2,5-10 W / cm2) ikke aktiverer flere aktivering begivenheder.
Bemærk: Det samlede erhvervelse afhænger af ekspressionsniveauet og effektivitet komplementering.
- Behandle billederne
Bemærk: Der er mange open source software muligheder for billedbehandling. Eksempler er tordenvejr (https://code.google.com/p/thunder-storm/) og QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). De typiske databehandling procedurer er kort illustreret her ved hjælp af en brugerdefineret Matlab pakke kaldet wfiread til forarbejdning PALM data som et eksempel. Dog kan fremtidige revisioner ikke ligefrem følge hvad der er beskrevet her. Til billedbehandling med anden software, henvises til brugeren dokumentationer.- Download billedbehandling software (Supplemental Code File) eller den nyeste udgave på http://www.ohsu.edu/nan. Åbn Matlab og indlæse wfiread software (som allerede sat i standard sti).
- Se den rå billedsekvens og bestemme området af interesse. Vælg det område af stakken skal behandles af venstre klikke og trække en boks rundt det ønskede område. Hvis området af interesse ikke blev reduceret under erhvervelse (til omkring 256x256 pixels), vælg et mindre område for at mindske Compute tid. Hvis du vil fravælge et område og behandler hele rammen, højreklikke et vilkårligt sted i the image.
- Indtast området af rammer, der skal behandles.
- Vælg en guld partikel (en, der er isoleret og ensartet form) ved at venstreklikke på billedet og trække en lille boks omkring det. Under Particle Tracking, skal du klikke på knappen Spor. En graf vises som viser positionen af den valgte guldpartikler på tværs af stakken af billeder, der viser omfanget af drift.
- Gentag denne proces for at spore så mange guldpartikler som muligt og bestemme dem, der sporer sammen (partiklerne vil være farvekodede). Ideelt den samlede drift er i størrelsesordenen én pixel på de fleste.
- Individuelt vælge guld partikler, der spores sammen en ad gangen, og klik på Tilføj markør knappen under Particle Tracking. En grøn indlæg vil blive vist angiver, at det er blevet tilføjet som en markør og vil blive anvendt til at korrigere for afdrift.
- Juster Sigma Range, Udjævning Range og Threshold som nødvendigt ved at ændre værdierne smule. Klik Find Partikelfor at teste indstillingerne. De partikler, der skal forarbejdes, er emballeret, og dem, der ikke vil blive udeladt. De PAmCherry1 molekyler, partikler, som er relativt rund og klar, bør vælges.
- Begynde at behandle billederne ved at klikke på Gør Coord File knappen og gemme filen.
Bemærk: Programmet vil gå igennem hver ramme inden for det definerede billedudsnit, finde alle fluorescerende pletter, og udfører Gaussisk montering at finde de geometriske tyngdepunkt koordinater. En .cor fil vil blive genereret lagring af alle koordinater og andre montering parametre for de forarbejdede enkelt molekyle billeder.
- Post-proces billederne og gøre PALM billedet
Bemærk: Andet software kan direkte gøre billedet efter koordinere ekstraktion.- I Matlab, starte 'håndflade' pakke og indlæse .cor filen lige har oprettet.
- Før gøre PALM billedet ved hjælp af koordinaterne, sortere de enkelte koordinater (hver fra en 'localizatipå hændelse "). De optimale sortering værdier kan variere afhængigt af opsætning og fluoroforen.
- For PAmCherry1 Brug følgende værdier: kombinere ramme - 8; Kombination Distance (nm) - 100; Minimum RMS - 4; Mindste Fit Godhed - 0,25; og Max. Excentricitet - 1.4. Se Diskussion sektion for yderligere forklaring af disse parametre.
- Klik på Sorter knappen for at generere et nyt sæt koordinater klar til rendering billeder i høj opløsning.
- Indtast værdier for korrekt gengivelse af det endelige billede som den rå pixelstørrelse (nm), den ønskede funktion størrelse (nm) i gengivet billede, og pixelstørrelsen for afsmeltet billede.
Bemærk: Den rå pixelstørrelse skal bestemmes for hver opsætning. Det afsmeltede funktion størrelse kan indstilles vilkårligt, men er typisk indstillet til en værdi lidt højere end den gennemsnitlige lokalisering præcision. For PAmCherry1, den gennemsnitlige lokalisering præcision er omkring 18 nm, så en funktion størrelse på 20 - 30 nm er Appropriate. Af note blev lokalisering præcision beregnes ved at tage standardafvigelsen af lokaliseringer af det samme molekyle på tværs af flere rammer 22 og ikke ved at dividere diffraktionsgrænsen med kvadratroden af detekteret antal fotoner. Som for pixel størrelsen af det gengivne billede, 10 nm er et godt udgangspunkt; sætte denne værdi for lavt, vil resultere i unødvendigt store billedfiler til ikke forstørrede visninger. - Klikke på knappen Render at generere PALM billedet. Brug +/- forstørrelsesglas ikoner i værktøjslinjen af figuren vinduet for at zoome ind og ud.
- Valgfrit: Udfør klynge analyse af det rekonstruerede PALM billedet ved hjælp af enten Ripleys K test eller andre mekanismer, såsom simulering Aided DBSCAN (SAD) 23. Bemærk: I den brugerdefinerede palme-pakken, er begge Ripleys K og SAD analyse allerede bygget i; for koordinater genereret fra anden software, kan de samme analyser udføres med yderligere brugerdefinerede scripts.
3. Single Molecule Tracking i levende celler - Behandl vævskultur overflade og pladen cellerne som beskrevet i protokol 2. Da temperaturen og / eller CO2 kontrolleret fase kan kræve en bestemt kultur skål, sikrer sikker på, at dækglasset har passende tykkelse (0,17 mm) til mikroskopi setup.
- Transficere celler hvis gør en forbigående ekspression og udføre alle nødvendige behandlinger for eksperimentet, såsom tetracyclin at inducere ekspression, og inkuber det er nødvendigt. Dette er også den samme som beskrevet i protokol 2.
- Placer dyrkningsskålen på en på scenen inkubator. Lad fadet bilægge på scenen i et par minutter, indtil temperaturen og CO 2 koncentration stabiliserer hver gang efter montering kulturen parabol eller flytter til et nyt område af interesse. Bloker lasere på dette trin. Hvis CO 2 kontrol ikke er tilgængelig, skal du ændre til en CO 2 uafhængige medier lige før billedbehandling, såsom Leibovitz L-15.
Bemærk: Phenol-rød-frit medium anbefales til deprimerende baggrundsfluorescens.
- Anskaf billeder som i protokol 2. Imidlertid fastsætte en passende eksponeringstid (typisk 25-50 msek til PAmCherry1).
Bemærk: Molekylet densitet skal være lavere end for fikserede celler, således at baner kan registreres uden overlappende med hinanden. De angivne par snese molekyler er typisk for en 256x256 pixel erhvervelse ved en pixelstørrelse på ca. 160 nm. 561 nm laser effekttæthed var sat til 0,8 kW / cm2 for at opretholde et godt signal-til-støj-forhold og samtidig begrænse fototoksicitet til celler og forøgelse af den gennemsnitlige bane længde. - Behandle billederne.
- Uddrag koordinater enkelte molekyler med wfiread pakken som beskrevet i protokol 2, eller med en anden pakke.
- Rekonstruere enkelt partikel baner ved hjælp af forskellige enkelt partikel sporing (SPT) pakker baseret på forskellige algoritmer fundetandre steder 24. Bemærk: Alternativt kan dette trin udføres ved hjælp hjemme bygget Matlab-pakke (muligvis tilgængelige i fremtidige revisioner på http://www.ohsu.edu/nan.
- Valgfrit: Efter genopbygning, bruge et SPT-pakke 24 til beregning af forskydning og diffusionskonstanter fra baner. Derudover bruger variational Bayes enkelt partikel sporing (vbSPT) 25 for at bestemme diffusion tilstande af målproteinerne. vbSPT Matlab pakke og dokumentation kan findes på sin officielle Sourceforge websted: http://vbspt.sourceforge.net/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den BiFC-PALM viste eksempel er KRAS G12D mutant interagere med Ras-bindingsdomænet (RBD) HÃ (figur 1A). Som beskrevet blev RN eller RC-fragmenter ikke mærket til C-terminalen af Ras, fordi det ville forstyrre membranen lokalisering og dermed den biologiske aktivitet af Ras. Dette reducerede de mulige kombinationer 8-4 (figur 1B). Hver af disse fire kombinationer blev indført i U2OS celler under anvendelse lentiviral infektion. Cellerne blev fastsat som beskrevet i protokollen, og BiFC signaler blev evalueret ved hjælp af en PALM opsætning. Celler med positive BiFC signaler blev identificeret ved den bratte stigning i fluorescens, når de 405 nm laser blev tændt; 561 nm laser var på hele afbildningseksperiment. Denne pludselige ændring i fluorescens skyldes fotoaktivering af BiFC-rekonstitueret PAmCherry1 ved belysning med 405 nm laser. Flere områder i prøven blev evalueret ved hjælp af denne metodeOg BiFC signalintensiteten blev beregnet som gennemsnittet af stigningen i pixel intensiteter før og efter en høj-drevne puls fra 405 nm laser.
Som det ses i figur 1C, ud af de fire mulige konfigurationer, to konfigurationer (dvs. RN-Ras / RC-Raf RBD og RN-Ras / Raf RBD-RC) havde stærke BiFC signaler. En anden konfiguration (RC-Ras / Raf RBD-RN) havde svagt signal, og en havde ikke noget signal. For alle efterfølgende eksperimenter blev RN-Ras / Raf RBD-RC konfiguration (øverst til højre i fig 1C) anvendes. Som en negativ kontrol blev en punktmutation (R89L) i Ras-bindingsdomænet af Raf indført og BiFC effektivitet ved hjælp af samme konfiguration blev afprøvet. Denne mutation var kendt for at forstyrre Raf binding til Ras; konsekvent, mutationen stærkt reduceret BiFC signal (figur 1D).
Da PAmCherry1 molekyler genereret gennem BiFC viste lignende fotoaktiveringsanordningerne egenskaber til det oprindeligePAmCherry1 10, dette giver mulighed for PALM billeddannelse af BiFC prøver ved anvendelse af de samme eksperimentelle indstillinger som med den forælder PAmCherry1. Et eksempel PALM billede af celler med stærke BiFC signal efter infektion med RN-Ras og Raf RBD-RC er vist i figur 2A.
Når zoomet ind (figur 2A nederst til venstre og mellemværker med forstørrede områder boxed), individuelle molekyler og deres nanoskala rumlige fordeling kan ses tydeligt. Notatet repræsenterer hver prik i disse PALM billeder et formodet Ras-Raf RBD kompleks mærket med en PAmCherry1 molekyle. Til sammenligning blev den højre side af figur 2B simuleret lave billeder af de samme synsfelter, hvor klyngerne blev helt obskure opløsning. Observationen af Ras-Raf RBD klynger er i overensstemmelse med tidligere bemærkninger om klyngedannelse adfærd Ras og Raf.
Med levende celler, der udtrykker BiFC rekonstitueret PAmCherry1, smt-PALM var PerfoRMED at erhverve diffusion baner individuelle Ras-Raf RBD komplekser, tilsvarende tidligere for at beskrevet 10. Under kontinuerlig belysning med 561 nm og 405 nm lasere, individuelle PAmCherry1 molekyler stokastisk tænde og vare et par billeder før indtastning mørke tilstande (delvis på grund af fotoblegning). I denne periode, molekylerne udviste mindst to forskellige diffusions adfærd: en ubevægelig tilstand (figur 2B molekyle 1) og en mobil tilstand (figur 2B molekyle 2). Begge typer af baner er klart til stede i (x, y) plot vist i figur 2C, hvor baner af multiple molekyler registreres. Den samme heterogene fordeling af diffusions tilstande kan udledes af histogram af molekylær forskydning mellem successive rammer. Typisk 10.000 - kan 100.000 diffusions baner erhverves fra hver celle; dette store antal giver mulighed for mere stringent statistisk analyse af than diffusion stater, for eksempel med vbSPT algoritmen 25.
Figur 1. BiFC-PALM eksperimentelt design af Ras-Raf-interaktion. (A) Ras er en membranbundet protein, der rekrutterer Raf når den er aktiv. Når ikke-fluorescerende split PAmCherry1 fragmenter er knyttet til Ras og Raf, samspillet bringer fragmenterne sammen og komplementering forekommer, hvilket resulterer i en funktionel fluorescerende protein. (B) Da tagging Ras ved dens C-terminale ville forstyrre dens membran lokalisering blev antallet af testede for Ras-Raf BiFC-PALM konfigurationer reduceret fra otte til fire. (C) Billeder af U2OS celler, der udtrykker de testede konfigurationer taget med et TIRF mikroskop. At måle BiFC effektivitet hver konfiguration cellerne samme høje dosis på 405 nm lys, mensbliver exciteret med 561 nm lys. (D) Introduktion til R89L mutation i Raf RBD stærkt reduceret BiFC signalet fra RN-KRAS G12D / Craf RBD-RC konfiguration (øverst til højre i C, n = 5-8). Fejlsøjler er SEM i (D). Scale barer i (C), 10 um. RN = PAmCherry1 N-terminale fragment, RC = PAmCherry1 C-terminale fragment, og RBD = Ras bindende domæne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. BiFC-PALM af U2OS celler, der udtrykker RN-Kras G12D / Craf RBD-RC-konfiguration. (A) En hel PALM billedet vist ovenfor. Nedre paneler er forstørret visninger af indrammede regioner i øverste billede som angivet. Mellemværker er højereforstørrelser af de boxed regioner i de respektive forstørrede visninger. Den højre side af de nedre paneler (mærket TIRF) er repræsentationer af billeder på deres venstre, som om taget med et diffraktionsbegrænset mikroskop. (B) Skiftende billeder fra en live celle smt-PALM eksperiment, der skildrer langsom (1) og hurtige (2) bevæger Ras-Raf-komplekser. (C) Output fra en SMT-PALM eksperiment viser diffusion baner af Ras-Raf-komplekser inden for et lille område af en celle. (D) Histogram af forskydninger per frame for Ras-Raf-komplekser fra en SMT-PALM eksperiment. Scale barer i (A), 5 um top, 500 nm bund, 50 nm inlays, og (C), 1 um. RN = PAmCherry1 N-terminale fragment, RC = PAmCherry1 C-terminale fragment, og RBD = Ras bindende domæne. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primersekvens (5 'til 3') | |
| Kloning plasmid til insertion ved N-terminus omvendt | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN ved N-terminus frem | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC N-terminus frem | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Kloning plasmid til insertion ved C-terminus frem | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN fra C-terminus omvendt | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC fra C-terminus omvendt | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabel 1. Primere til linearisering kloning plasmider indeholdende PAmCherry1 fragmenter. Kloningssites'ene plasmider indeholdende RN og RC kan lineariseret med omvendt PCR ved punktet for indføring i enten N- eller C-terminalen af fragmenterne. Sekvenser er angivet fra 5 'til 3R17 ;.
| Udhæng for genet af interesse primere (5 'til 3') | |
| N-terminal indsættelse RN eller RC frem | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminale indføring RN omvendt | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminal insertion RC omvendt | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminale indføring RN frem | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminale indføring RC frem | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminale indsættelse RN eller RC omvendt | GCGCCCACCCTTTTA |
Tabel 2. Udhæng for genet af interesse primere, der svarer til Tabel 1 primere. De 15 basepar af homologi til ligering-uafhængig reaktion genereresfra primer udhæng. Derudover udhæng omfatter sekvensen for a (GGGGS) x2 fleksibel linker. Den fleksible linkersekvens kan tilsættes til primerne i tabel 1 i stedet. Sekvenser er angivet 5 'til 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC har været et almindeligt anvendt teknik til påvisning og visualisere PPI i celler, mens PALM er en nyere enkelt molekyle superresolution mikroskopi teknik, der gør det muligt nanoskala billeddannelse af intakte biologiske prøver. Kombinationen af BiFC med PALM opnået selektiv billeddannelse af PPI inde i en celle med nanometer rumlig opløsning og enkelt molekyle følsomhed. BiFC-PALM udvider nytten af begge teknikker, og som påvist i dette arbejde, viser meget lovende i at afsløre de molekylære detaljer i PPI på deres eget cellulære kontekst. Især nanometer opløsning giver mulighed for detaljeret undersøgelse af den rumlige og tidsmæssige regulering af specifikke PPI på molekylært plan, som har været en udfordring i biomedicinsk forskning. Men som nævnt før, er BiFC-PALM begrænset af irreversibilitet af komplementering og langsom kromofor modning.
Split PAmCherry1 blev brugt til at demonstrere princippet og ufertilitet af BiFC-PALM. PAmCherry1 har været meget anvendt i Palm eksperimenter for sine fremragende fotofysiske egenskaber. En yderligere fordel ved at bruge PAmCherry1 som BiFC probe er den lave baggrund og høj specificitet og effektivitet på protein rekonstitution ved 37 ° C, når der er koblet til PPI. Af disse grunde forventes split PAmCherry1 BiFC sonde til at blive en værdifuld ressource, der gælder for mange forskellige biologiske undersøgelser, der involverer høj opløsning billeddannelse af PPI. Foruden PAmCherry1, en photoconvertible fluorescerende protein, mEos3.2, blev også delt for BiFC-PALM 26. Fordi deres emission spektre overlapper, kan mEos3.2 og PAmCherry1 ikke bruges sammen, men grøn PA-rammeprogrammerne er for nylig blevet rapporteret 27, åbner mulighed for tofarvede nanoskala superresolution billeddannelse af PPI.
Som i konventionel BiFC, et afgørende skridt i gennemførelsen af BiFC-PALM er design og kloning af fusionskonstrukter. Det faktum, at optil otte forskellige ekspressionskonstrukter skal klones og otte BiFC par skal testes i hvert forsøg på at gennemføre BiFC og BiFC-PALM kan være en kedelig, hvis ikke uoverkommelige, proces. Ikke desto mindre, som det er illustreret i Ras-Raf eksempel forudgående viden om de biokemiske og strukturelle egenskaber af proteinerne af interesse ofte kan anvendes til at styre en optimeret udformning af fusionskonstruktionerne med et reduceret antal BiFC par, der skal testes. Når det er sagt, i øjeblikket er der ikke en universel retningslinje for at sikre, at en BiFC (deraf BiFC-PALM) eksperiment ville arbejde; meget af det er stadig en kunst.
Mens BiFC og BiFC-PALM typisk anvendes til at undersøge heterodimer dannelse mellem to proteiner, er det også muligt at studere homodimerdannelse brug af denne metode, i hvilket tilfælde de to kandidat-proteiner ville være det samme. Men som sådan, kan to proteiner med det samme fragment interagere men ikke resultere i BiFC signal. Trods hver konstruktion optræder somen kompetitiv inhibitor til den anden, sådanne interaktioner er reversible, mens interaktioner resulterer i vellykket komplementering vil akkumulere på grund af irreversibel. Generelt kunne der være en reduktion i signal, hvis der er en drastisk forskel mellem ekspressionsniveauerne af hver konstruktion. Derfor kan det være nødvendigt at finde sted, når man sammenligner fluorescensintensiteter (f.eks mellem vildtype og mutant homodimer prøver) ved endogene ekspressionsniveauer ekspressionsniveauerne af de to konstruktioner. Dette er måske grunden til BiFC eksperimenter er almindeligvis udføres med forbigående transfektioner og overekspression af konstruktionerne.
Sidst men ikke mindst, skal alle BiFC eksperimenter bekræftes med ordentlig kontrol. Hvis BiFC signal er til stede, er der en chance for, at signalet er uspecifik (dvs. fragmenterne rekonstituering på deres egne og ikke på grund af PPI). En negativ kontrol er mutationer i et eller begge proteiner, der er kendtat forstyrre interaktion, hvilket bør resultere i et betydeligt tab af BiFC signal. Hvis en sådan punktmutation er ukendt, kan der anvendes andre metoder, såsom at introducere et konkurrencedygtigt bindingspartner til et af proteinerne og se, om der er et samtidigt fald i signal.
Den vanskeligere situation fejlfinding en mangel på BiFC signal eller falsk negative resultater. I sådanne tilfælde er det vigtigt at omfatte positive kontrol under kloningsprocessen, såsom en GFP kontrol under transfektioner. Western blots kan køres for at kontrollere ekspression af konstruktionerne. Hvis disse faktorer er normale, kan være nødvendigt at ændre, såsom linker længde og / eller sekvens eller en anden BiFC konfiguration bør overvejes andre faktorer.
Med hensyn til håndfladestykket, skal et antal parametre tages i betragtning ved behandling af billeder. Trin 2.4.2.1 beskriver parametre, der anvendes til sortering koordinaterne og genererer den endelige PALM billede. Den førsteto parametre, der kombinerer Ramme og kombinere Distance, definere, om to lokalisering begivenheder er både inden for 100 nm og synes mindre end 8 rammer (ved 100 ms / ramme) eller ~ 0,8 sek fra hinanden som vi beskrev tidligere 23. Hvis ja, så vil de blive anset for at hidrøre fra det samme molekyle, og deres koordinater vil blive kombineret som gennemsnittet. Mørke stater med levetider meget større end 0,8 sek for PAmCherry1 synes at være sjældne; som tilfælde af en fluorofor genoprettelse fra en lang levetid mørke tilstand ikke kan skelnes fra et andet molekyle ved en proximal afstand udsender fluorescens, er to lokalisering begivenheder anses for at være som følge af det samme molekyle, hvis de viste sig inden for et bestemt antal rammer og fysisk afstand. Empirisk, vises en indstilling "kombinere ramme 'på 8-12 rammer (0,8-1,2 sek) at være optimal under vores eksperimentelle betingelser. Minimum RMS definerer den minimale forhold mellem montering amplitude og standardafvigelsen for restkoncentrationer støj efterfittingen. Disse værdier registreres i .cor fil under koordinere ekstraktion.
Sammenfattende BiFC-PALM kombinerer fordelene ved BiFC og PALM og muliggør undersøgelse af PPI på langt større detaljer end hvad der er opnået tidligere. Med hensyn til de faktorer, over og med ordentlig kontrol eksperimenter, bør BiFC-PALM være et nyttigt redskab til at studere PPI i en bred vifte af biologiske indstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L.
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
