Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Photoactivated التعريب المجهري مع ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC-PALM)

Published: December 22, 2015 doi: 10.3791/53154
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, 2Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 3OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

Introduction

تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي الأساسية لعلم الأحياء 1 وينظم بإحكام عبر آليات الزمانية المكانية عبر العديد من جداول زمنية والطول. دراسات على الخلايا مما يدل على غشاء الخلية، على سبيل المثال، قد كشف، مقصورات المكانية النانو الحيوية التي تسهل مثبطات مضخة البروتون محددة والعمليات الخلوية 2. وبالتالي، فإن القدرة على تحقيق مثبطات مضخة البروتون في النظم البيولوجية لقرارات كافية المكانية والزمانية، خصوصية عالية، وحساسية عالية هو المفتاح لتحقيق فهم الآلية البيولوجيا.

ثنائي الجزيء مضان تكامل (BiFC) هي واحدة من عدد قليل من الأدوات الموجودة لتصور مثبطات مضخة البروتون في زنزانة مع قرار التحت خلوية والتوافق تعيش خلايا 3-5. هذه التقنية بسيطة نسبيا وتتضمن تقسيم البروتين مضان إلى قسمين شظايا غير الفلورسنت. عندما الموسومة راثيا لاثنين من البروتينات التفاعل وجلبت الى القرب، ويمكن أن شظايا بإعادة تشكيل لتشكيل بروتين فلوري كامل، مما أسفر عن إشارة الفلورسنت. عندما تكون مصممة بشكل صحيح، يجب تحقيقات BiFC لا إعادة تكوين تلقائيا في حالة عدم وجود مثبطات مضخة البروتون. على هذا النحو، فإن إشارة مضان في مقايسة BiFC تنشأ إلا في وجود مثبطات مضخة البروتون، والتي تمكن رؤية مباشرة من مثبطات مضخة البروتون مع خصوصية عالية. فوائد إضافية لاستخدام مضان كما قراءات هي حساسية عالية، وقرار التحت خلوية، والتوافق مع سرعة عالية وعالية المقايسات فحص المحتوى وغيرها. لهذه الفوائد، وقد وضعت عددا من تحقيقات BiFC على أساس مختلف البروتينات الفلورية الأم. كما هو الحال في جميع التقنيات الكشف الأخرى على أساس المجهر الضوئي التقليدية، ومع ذلك، فإن القرار المكانية من BiFC يقتصر على ~ 250 نانومتر من حيود الضوء. وهذا يجعل من التحدي لدراسة تنظيم مثبطات مضخة البروتون على مقياس النانو، والتي، كما ألمح في وقت سابق والتي تجسدت الطوافات الدهنية 6 لالثاني nanoclusters رأس 7، هو مقياس طول بالغ الأهمية لفهم العديد من العمليات الخلوية مثل الإشارات.

وقد تم الجمع بين BiFC مع photoactivated المجهر توطين (PALM) 8،9 للتغلب على هذا الحد في التحليل المكاني لتصوير مثبطات مضخة البروتون 10. PALM هو أسلوب superresolution المجهر الأخيرة التي تلتف حول الحد حيود في مجال التصوير مضان من خلال تفعيل العشوائية وتوطين subdiffractive من جزيئات الفلورسنت واحدة. في كل دورة التنشيط، جزيء فلوري تنبعث بضع مئات إلى بضعة آلاف من الفوتونات ويثير صورة جزيء واحد على كاشف. عندما تكون الصورة محدودة حيود (~ 250 نانومتر في العرض)، ويمكن تحديد النقطه الوسطى مع أعلى بكثير من الدقة، عادة في حدود 10-50 نانومتر اعتمادا على عدد من الفوتونات الكشف عنها. من خلال تفعيل وتوطين كل جزيء فلوري في العينة، يمكن إعادة بنائها على صورة عالية الدقة. Performeد على الخلايا الحية، جزيء واحد تتبع (smt-) PALM مزيد من تصاريح اقتناء الآلاف من مسارات البروتين نشرها من خلية واحدة (11). الأهم من ذلك، يستخدم PALM تحقيقات الفلورسنت المتخصصة مثل البروتينات الفلورية photoactivatable (PA-FPS) لتحقيق تفعيل مؤشر ستوكاستيك. لأن كلا BiFC وPALM البروتينات استخدام الفلورسنت، وكانوا جنبا إلى جنب عن طريق تقسيم PAmCherry1، وهي تستخدم عادة PA-FP لPALM، إلى قسمين شظايا بين الأحماض الأمينية 159 و 160.

نظام BiFC على أساس PAmCherry1 الانقسام يظهر إشارة خلفية منخفضة من إعادة عفوية من شظايا اثنين. عندما الموسومة راثيا لزوج من البروتينات التفاعل، شظايا اثنين (RN = بقايا 1-159؛ RC = الأرصاد + بقايا 160-236) أعيد بكفاءة لتشكيل البروتينات PAmCherry1 كاملة حتى عند 37 درجة مئوية وبدون يحتضنها عند انخفاض درجات الحرارة، والتي ليس هذا هو الحال للأزواج BiFC أخرى 12 مثل الوالد mCherry 13. Furthermoإعادة، والبروتين PAmCherry1 أعيد الاحتفاظ خصائص بالفوتونات من PAmCherry1 الأم، مثل نسبة عالية النقيض من ذلك، العائد الفوتون المتوسط، وتنشيط ضوئي سريع، من بين أمور أخرى، التي هي حيوية لدقيقة توطين جزيء واحد وعالية الدقة التصوير PALM.

في هذا البروتوكول، واستخدام BiFC-PALM لتصوير التفاعلات رأس راف في خلايا U2OS باستخدام PAmCherry1 تقسيم (الشكل 1A) يوصف. الخطوة الأولى هي لتصميم بنيات للتعبير عن البروتينات الانصهار بين شظايا PAmCherry1 (أي RN وRC) والبروتينات المثيرة للاهتمام. من الناحية النظرية، لكل زوج من البروتينات مرشح (A و B)، هناك ثمانية أزواج من البروتينات الانصهار لفحصها: RN-A / RC-B. RN-A / B-RC. RC-A / RN-B. RC-A / B-RN. A-RN / RC-B. A-RN / B-RC. A-RC / RN-B. وA-RC / B-RN. كثيرا ما يمكن تبسيط هذه العملية من خلال الأخذ بعين الاعتبار الخصائص الهيكلية أو البيوكيميائية للبروتينات مرشح. في حالة رأس، والبروتينبعد translationally تعديل المربع CAAX-C محطة (C = السيستئين؛ A = الأليفاتية، X = أي)، وبعد ذلك يتم المشقوق عزر AAX خارج. وبالتالي، RN أو RC لا يمكن إلا أن تنصهر إلى N-محطة رأس. وهذا يقلل من عدد من أزواج البروتين الانصهار إلى أربعة (الشكل 1B). لسلاح الجو الملكي البريطاني، المجال رأس ملزم (RBD، بقايا 51-131) يستخدم ويمكن الموسومة على حد سواء. تم إنشاؤها هذه التكوينات الانصهار أربعة: RN-KRAS / RC-راف RBD. RN-KRAS / راف RBD-RC. RC-KRAS / RN-راف RBD. وRC-KRAS / راف RBD-RN.

بالإضافة إلى ذلك، سوف رابط بين الشظايا والبروتينات ذات الاهتمام تحتاج إلى النظر فيها. وغالبا ما يستخدم رابط مرونة من حوالي عشرة الأحماض الأمينية، حيث أنه يوفر الحرية الكافية للتكامل تحدث. واحدة من هذه رابط هو (GGGGS) X2، على الرغم من أن هناك العديد من الآخرين التي تم تطبيقها بنجاح، بما في ذلك تسلسل عشوائي ولدت من موقع استنساخ متعددة (MCS) 14. قد تحتاج طول linkers أن يكون الأمثل dependinز على حجم البروتينات من الفائدة وتوجهاتها عند التعامل.

وترد شظايا PAmCherry1 في العمود الفقري استنساخ صغير مع المرافقة MCSS (انظر قائمة المواد). يمكن إدراج الجينات ذات الاهتمام عبر المواقع تقييد أو مع طريقة ربط مستقل. بعد استنساخ وتسلسل التحقق، يتم تحويل الكاسيت تعبر عن ناقلات التعبير باستخدام رد فعل recombinase، وهي عملية الاستنساخ مع الدقة العالية وكفاءة عالية.

بعد ذلك، و transfected بنيات التعبير مما أدى إلى خط الخلية المستهدفة، أو إذا كان المطلوب هو خط الخلية مستقرة، وتعبئتها في الفيروسة البطيئة لتصيب خط الخلية المستهدفة. ترنسفكأيشن عابر يسمح للمصادقة سريع للتكوينات BiFC، ولكن يجب أن يكون لاحظت المشاكل المحتملة. ترنسفكأيشن استخدام المواد الكيميائية غالبا ما يشدد الخلايا، مما أدى إلى تألق ذاتي عالية. في حين أن استخدام مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) microscoالحمر يمكن أن تخفف هذه إشارة الخلفية عن طريق الحد من حجم الإضاءة، TIRF مثالية عندما تأخذ مثبطات مضخة البروتون مكان على غشاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك، transfections عابرة غالبا ما تؤدي إلى مستويات عالية من بروتين تعبير، تتجاوز بكثير تلك التي من البروتينات الذاتية، والتي قد تسبب القطع الأثرية في الكشف عن مثبطات مضخة البروتون. وبالتالي، فمن المستحسن أن يتم إنشاء خطوط الخلايا مستقرة بعد أن تم تحديد تكوين BiFC المناسب من خلال الاختبارات الأولية. لديها خطوط الخلايا مستقرة أيضا إمكانية للتعبير الانضباطي عبر الدوكسيسيكلين تحريض 15.

بعد الإصابة، يتم تحديد الخلايا مع المضادات الحيوية، وعادة بوروميسين والنيوميسين، واحد لكل بناء. وسيتم وصف الخطوات اللاحقة لإعداد العينات، والحصول على الصور، وتحليل البيانات بالتفصيل في البروتوكولات.

مع هذا النهج، لوحظ تشكيل مجموعات النانو في الصور BiFC النخيل من رأس راف RBD بشكل روتيني (الشكل 2A </ قوي>). باستمرار، مسارات SMT-PALM من رأس راف RBD تظهر التوزيع غير المتجانس في دول الانتشار (الشكل 2B-D). هذه النتائج تشير إلى أن المجمعات رأس راف موجودة في دول متعددة على غشاء الخلية، ويفترض كما أحادية والتجمعات، مع الآثار البيولوجية المحتملة. يوضح هذا العمل قوة BiFC النخيل في التصوير الانتقائي لمثبطات مضخة البروتون في الخلايا مع نانومتر القرار المكانية وحساسية جزيء واحد، والتي سيكون من الصعب الحصول مع BiFC التقليدية، مضان شارك في التعريب، أو مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق).

عند تصميم التجارب BiFC وتفسير النتائج، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن عملية BiFC لا رجعة فيه في معظم الحالات، بما في ذلك PAmCherry1 الانقسام. مرة واحدة شظايا اثنين والجمع بين لتشكل البروتين PAmCherry1 الكامل، والربط بين أجزاء اثنين، وبالتالي PPI يصبح دائم. وهذا يحد من استخدام BiFC وBiFC-PALM لرصد ديناميات مثبطات مضخة البروتون (أي حركية ملزم وليس ديناميكية انتشار مجمع البروتين فور تشكيلها)، وأحيانا يمكن أن تؤدي حتى إلى mislocalization من المجمعات PPI.

عاملا إضافيا في الاعتبار عند تصميم التجارب BiFC-PALM هو التأخير في النضج حامل اللون المتأصل في البروتينات الفلورية. مرة واحدة اثنين من البروتينات تتفاعل وشظايا FP معا، فإنها refold عادة بناء على أمر من ثانية (نصف الوقت من 60 ثانية لEYFP 3). ومع ذلك، لاحقا النضج حامل اللون وإشارة الفلورسنت تطوير بناء على أمر من دقيقة. في حين مضان قد يكون كشفها في غضون 10 دقيقة بعد إعادة تشكيل تقسيم الزهرة، وهي قابلة للطي بسرعة YFP البديل، والوقت غير الشقيق لنضج بشكل عام في كثير من الأحيان حوالي 60 دقيقة 16. ولوحظ انقسام PAmCherry1 لدينا أسعار مماثلة. وبالتالي، BiFC BiFC والنخيل وسوء الاختيارات حاليا لرصد الوقت الحقيقي حركية PPI. لي الآخرينthods، مثل الحنق وdimerization وضعت مؤخرا الفلورسنت تعتمد البروتين 17، قد تكون أكثر ملاءمة لهذا الغرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاستنساخ

  1. تحديد تكوينات لاستنساخ واختيار رابط. البروتينات العلامة مع شظايا على N- أو C-المحطة كما هو موضح أدناه حتى لا يعطل التعريب على نحو سليم. استخدام رابط مرنة مثل (GGGGS) X2.
  2. وراثيا علامة البروتينات التي تهم شظايا PAmCherry1. كما خيار واحد، استخدام البلازميدات استنساخ المدرجة في قائمة المواد التي تحتوي على شظايا RN (بقايا PAmCherry1 1-159) وRC (الأرصاد بالإضافة إلى بقايا PAmCherry1 160-236) مع المرافقة MCS متواليات.
    1. خطي البلازميدات تحتوي على شظايا RN وRC مع معكوس PCR (أو تقييد هضم) عند نقطة الإدراج. يتم سرد الاشعال للمعكوس PCR في الجدول 1. وفيما يلي مثال بروتوكول PCR المستخدمة في المختبر المؤلف (انظر قائمة المواد للمواد الدقيقة المستخدمة في هذا البروتوكول).
      1. خلط رد فعل PCR معا، ترعرعت على الحجم النهائي من 50 ميكرولتر مع الماء: إلى الجدار رقيقةأنبوب إد PCR، إضافة الماء، 25 ميكرولتر من 2X مزيج الرئيسي، 0.5 ميكرولتر كل من الاشعال إلى الأمام وعكس (20 ميكرومتر الأسهم المخفف و 0.2 ميكرومتر تركيز النهائي)، و 1 نانوغرام من القالب. استخدام الدراجات الظروف التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 30 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 7 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. PCR الجينات التي تهم الإدراج إلى البلازميدات خطي تحتوي على RN وRC شظايا. أداء PCR كما في الخطوة 1.2.1 مع تمديد الوقت في 68 ° C. استخدام الاشعال مع يتدلى التي تحتوي على تسلسل رابط مرونة، مثل GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT ل(GGGGS) X2، و 15 قاعدة الزوج التماثل إلى أقاصي RN خطي والبلازميدات RC لإعادة التركيب.
      ملاحظة: يتم عرض يتدلى التمهيدي للبروتينات الفائدة في الجدول 2 إذا باستخدام بادئات في الجدول 1 إلى خطي العمود الفقري البلازميد.
    3. هضم PCRرد الفعل مع Dpn1 للقضاء على قالب PCR. إضافة 0.5 ميكرولتر من Dpn1 (20 U / ميكرولتر) مباشرة إلى 50 ميكرولتر من رد فعل PCR. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والحرارة تعطيل في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إذا استمر قالب الخلفية في خطوات لاحقة، وزيادة كمية الإنزيم أو إطالة وقت الهضم.
    4. تنقية المنتجات PCR عن طريق عمود الدوران كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
    5. إجراء تفاعل ربط مستقل للجمع بين البلازميد خطي يتضمن RN أو جزء RC مع الجينات في المصالح. قياس تركيز من المنتجات PCR المنقى: الجمع بين 50 نانوغرام من البلازميد خطي و 50 نانوغرام من الجينات في المصالح مع 1 ميكرولتر من انزيم بريمكس وجلب الحجم الإجمالي إلى 5 ميكرولتر مع الماء منزوع الأيونات. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ومكان على الجليد، وإضافة 20 ميكرولتر من TE العازلة.
    6. تحويل البلازميدات المؤتلف في البكتيريا المختصة 18.
    7. حدد 4/2 + (حسب الرغبة) مستعمرات لO / N الثقافة. إضافة 5 ملمن LB مرق و 5 ميكرولتر من كانامايسين (50 ملغ / مل الأسهم) إلى 14 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع، وإضافة البكتيريا مستعمرة المحدد مع حلقة بتلقيح تعقيمها. احتضان عند 37 درجة CO / N حين تهتز في 225 دورة في الدقيقة.
    8. تجميد 1 مل من O / N ثقافة الأسهم الجلسرين 19 و miniprep الباقي كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
    9. أداء التسلسل لتحديد استنساخ جيدة. في حالة استخدام البلازميدات استنساخ في قائمة المواد واستخدام M13 إلى الأمام وعكس الاشعال (في تفاعلات منفصلة) عند الضرورة للحصول على التسلسل الكامل للانصهار بناء. مقارنة مع تسلسل المتوقع باستخدام أداة المحاذاة مثل انفجار من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
    10. نقل بنيات-التحقق من التسلسل إلى التعبير البلازميد عن طريق تفاعل recombinase.
      1. إضافة 75 نانوغرام من البلازميد جهة & #8212؛ مثل pcDNA لtransfections عابرة أو pLenti لlentiviral التعبئة والتغليف 20 - و 50 نانوغرام من استنساخ البلازميد المؤتلف إلى 1 ميكرولتر من انزيم بريمكس وإحضار الحجم الكلي إلى 5 ميكرولتر مع الماء منزوع الأيونات. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم إضافة 5 ميكرولتر من TE العازلة.
        ملاحظة: للحصول على التعبئة والتغليف lentiviral وتوليد خط الخلية مستقرة، استخدم البلازميد وجهة مختلفة لكل بناء، على سبيل المثال، واحد مع المقاومة بوروميسين والنيوميسين الآخرين. وهذا يسمح للاختيار مزدوجة من الخلايا transduced. ضع في اعتبارك أيضا المروج لكل منهما، مثل الفيروس المضخم للخلايا المكونة (CMV) مروج لمستويات عالية التعبير، أو CMV مع المشغل TETO لالانضباطي تعبير عن تنظيم الدوكسيسيكلين.
      2. تحويل 5 ميكرولتر إلى البكتيريا المختصة وminiprep البلازميدات كما في الخطوات 1.2.6 إلى 1.2.8، ولكن باستخدام المضادات الحيوية المناسبة (عادة الأمبيسلين).
  3. تحديد الأمثلالتكوين BiFC.
    1. شارك في transfect البلازميدات التعبير في خلايا U2OS (أو خلية من خيار).
      1. إضافة 350 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية وخالية من المضادات الحيوية DMEM تستكمل مع 10٪ FBS في كل بئر من 8 جيد # 1.5 زجاج غرفة أسفل الشريحة. لوحة حوالي 7.5 × 10 4 خلايا لكل بئر الخلايا بحيث حوالي 70٪ -90٪ متكدسة في اليوم التالي.
      2. بعد يوم من البلازميدات الطلاء، وشارك في transfect التعبير مع تكوينات مختلفة في كل بئر باستخدام كاشف المفضل وكما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
        1. لكل بئر، إضافة 125 نانوغرام لكل التعبير البلازميد في 50 ميكرولتر من المصل خالية تخفيض وسائل الاعلام في أنبوب 0.6 مل وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. إضافة 1 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن أسفل وسط الأنبوب ومباشرة في وسائل الإعلام. تستنهض الهمم بلطف لمزج والسماح للرد فعل الجلوس لمدة 30 دقيقة.
        2. الحد من وسائل الإعلام في كل بئر من الشريحة غرفة بمقدار النصف تقريبا. إضافة قطرة قطرة الخليط ترنسفكأيشن إلى الآبار ويهز زمستديم لخلط. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24-48 ساعة. تغيير وسائل الإعلام اليوم بعد ترنسفكأيشن.
    2. خلايا صورة على المجهر مضان كما هو الحال في بروتوكول 2 بدءا من الخطوة 2.1.4.
      ملاحظة: قد يمكن تصوير العينة على المجهر مضان القياسية إذا كانت مستويات التعبير مرتفعة وكاميرا حساسة بما فيه الكفاية لإخراج الفوتون منخفض نسبيا من PAmCherry1. يمكن تنشيط الجزيئات PAmCherry1 المعاد مع مجموعة فلتر الأشعة فوق البنفسجية (405 نانومتر) قبل التصوير مع الإثارة الخضراء (561 نانومتر) مجموعة التصفية.
  4. عند الاقتضاء، إنشاء سيطرة سلبية من قبل، على سبيل المثال، وإدخال طفرة نقطة في واحد من البروتينات ذات الاهتمام الذي يعطل التفاعل. إجراء الطفرات موقع الموجه 21 على البلازميد استنساخ البروتين إلى أن تحور والتكوين الذي تم اختياره.
  5. إنشاء خط الخلية مستقرة خلال تجميع يبني في الفيروسيةالجسيمات وتصيب الخلايا U2OS (أو خط خلية من خيار). النظر في محرض نظام (التتراسيكلين) التعبير 15 لذلك التعبير يمكن أن يتسبب قبل التصوير إذا الرجعة لفترات طويلة من BiFC هو المشكلة، أو إذا كان المطلوب هو التعبير الانضباطي.
    تنبيه: يصنف العمل مع الفيروسات كما السلامة الأحيائية المستوى 2. بينما الأجيال الأخيرة من أنظمة التعبئة والتغليف الفيروسية قد تقلص إلى حد كبير من احتمال إنتاج فيروسات النسخ المختصة، بعض المخاطر لا تزال موجودة. مراجع يمكن العثور عليها في http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
    1. كرر الخطوة 1.2.10 باستخدام lenti- أو فيروسات ناقلات جهة 20. زيادة O / N الثقافة إلى 100 مل لmidiprep وزيادة نقاء البلازميدات.
    2. في يوم 1: لوحة حوالي 2 × 10 6 293T / 17 خلايا في طبق 10 سم لكل بناء ليتم تعبئتها.
    3. يوم 2: إعداد رد فعل ترنسفكأيشن باستخدام هيئة تنظيم الاتصالاتnsfection كاشف الاختيار وكما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
      1. إعداد الخلطة الجاهزة من التعبئة والتغليف البلازميدات مع تركيزات النهائي من 250 نانوغرام / ميكرولتر للتغليف البلازميدات 1 و 2، و 100 نانوغرام / ميكرولتر للتغليف البلازميد 3 في الماء المعقم. إضافة 10 ميكرولتر من بريمكس التعبئة البلازميد و 2.5 ميكروغرام من البلازميد الهدف إلى 1 مل من مصل خالية تخفيض وسائل الاعلام في 5 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. إضافة 20 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن أسفل وسط الأنبوب ومباشرة في وسائل الإعلام.
        1. تستنهض الهمم بلطف لمزج واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة. إزالة ما يقرب من نصف وسائل الإعلام من الخلايا وإضافة الخليط ترنسفكأيشن بطريقة قطرة قطرة. يهز بلطف لمزج واحتضان عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. احتضان 10 مل من وسائل الاعلام في لوحة في أنبوب مع غطاء خففت لدرجة الحرارة وCO 2 موازنة.
      2. يوم 3: بلطف تغيير وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام قبل المحتضنة وreturن الخلايا إلى الحاضنة. احتضان أنبوب آخر من وسائل الإعلام مع غطاء خففت.
        ملاحظة: Syncytia، أو تكوين خلايا الأنوية المتعددة الكبيرة، ويمكن أن يكون علامة على أن التعبئة والتغليف يسير على ما يرام. ومع ذلك، والخلايا في حالة هشة ويمكن فصل بسهولة. عند تغيير وسائل الإعلام، إمالة pipettor بحيث يكون أفقي وإضافة قطرة قطرة وسائل الاعلام الى حافة واحدة من لوحة.
      3. يوم 4: حصاد الفيروس عن طريق إزالة وسائل الإعلام مع حقنة والتصفية من خلال حجم مرشح 0.45 ميكرون المسام نظيفة في أنبوب 50 مل. بلطف استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام قبل المحتضنة.
      4. في يوم 5: حصاد مرة أخرى كما فعلت سابقا في الخطوة 1.5.3.3 والجمع بين الترشيح المشترك في نفس أنبوب 50 مل. إضافة 6 مل من مركزات الفيروس إلى كل أنبوب والمزيج. تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة حتى رواسب الفيروس.
        ملاحظة: اعتمادا على صحة الخلايا، يمكن للفيروس أن تحصد للمرة الثالثة.
      5. تركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي في 1500 x جلمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح طاف و resuspend بيليه في 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام. الفيروس يمكن استخدامها على الفور لعدوى أو تخزينها في 50 مكل في -80 درجة مئوية لمدة سنة واحدة.
      6. لوحة حوالي 3 × 10 5 U2OS (أو الهدف) خلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا (2 مل من DMEM مع 10٪ FBS لكل بئر) للعدوى، والخلايا بحيث حوالي 50٪ متكدسة في وقت الإصابة.
      7. في اليوم التالي، وإزالة ما يقرب من نصف وسائل الإعلام حتى حوالي 1 مل بقايا. Coinfect مع 50 ميكرولتر من فيروس مركزة لكل بناء. إضافة 1 ميكرولتر من polybrene (8 ملغ / مل) إلى كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. تغيير وسائل الإعلام في اليوم التالي واحتضان لاختيار المضادات الحيوية قبل يوم واحد أكثر من ذلك.
        ملاحظة: كمية الفيروس لإضافة يمكن أن تختلف تبعا لمعدل المطلوب من العدوى. الفيروسات يمكن معاير باستخدام QRT-PCR.
      8. إضافة المضادات الحيوية لتحديد الخلايا المصابة. آبار منفصلة مع الخلايا غير المصابة التي لم تشهد السادسمطلوبة روس كما الكناري لاختبار فعالية التحديد. احتضان لمدة 2-7 أيام، أو حتى اختيار كاملة.
        ملاحظة: يجب معاير تركيزات الفعالة في البداية، ولكنها عادة ما تكون 1.0 ميكروغرام / مل بوروميسين و 1.0 ملغ / مل لالنيومايسين.
      9. توسيع الخلايا في أكبر صحن 10 سم والمضي قدما في البروتوكول 2.

2. التصوير الثابتة خلايا

  1. إعداد نموذج للتصوير
    1. تنظيف 8 جيد # 1.5 من الزجاج السفلي غرفة الشريحة من خلال إضافة 250 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم لا يقل عن 1 ساعة ويغسل جيدا مع PBS.
      ملاحظة: يؤدي الشرائح غرفة غير المعالجة عادة في ارتفاع إشارة الخلفية. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون خلايا حساسة للالمتبقي هيدروكسيد الصوديوم وفشل لتنظيف شاملة سطح الزجاج (ما يصل إلى 10X يغسل) قد يجعل التصاق الخلايا صعوبة. إذا لزم الأمر، واحتضان الشريحة غرفة تنظيفها مع PBS O / N بعد الغسيل. لخطوط الخلايا الحساسة، والطلاء في مناطق ذات كثافة أعلى(على سبيل المثال، في 50٪ -60٪ confluency الأولي) قد يساعد.
    2. لوحة حوالي 5.5 × 10 4 من U2OS الخلايا التعبير مستقر لكل بئر في 350 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية DMEM مع 10٪ FBS بحيث الخلايا السليمة ولم تنته متموجة عند التصوير.
    3. أداء العلاجات اللازمة لهذه التجربة، مثل إضافة التتراسيكلين للحث على البروتين التعبير.
    4. إصلاح الخلايا مباشرة قبل التصوير.
      1. قبل التثبيت، وإعداد امتصاص العرق النقي (PFA) حل - 3.7٪ PFA في 1X PHEM بنسبة 0.1٪ غلوتارالدهيد (GA). لمدة 10 مل PFA حل، تزن 0.37 غرام من PFA ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 1 مل من الماء المقطر و 30 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم ودوامة. الحرارة عند 70 درجة مئوية والدوامة كل 1-2 دقائق حتى يذوب تماما PFA.
      2. نقل حل PFA إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وإضافة 3.8 مل من الماء المقطر، 5 مل 2X العازلة PHEM، 20 ميكرولتر من 25٪ غلوتارالدهيد، ودوامة لخلط. الأسهم، 2X العازلة PHEM 120 أنابيب ملي و 50 ملي HEPES 20 ملي EGTA، و 16 ملي MgSO 4، مع تعديل درجة الحموضة إلى 7.0 مع 10 M KOH. ويمكن تخزين هذا الحل تثبيتي في 4 درجات مئوية لعدة أيام.
        تنبيه: PFA وGA كلاهما الخطرة. إعداد الحل في غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية المناسبة عند التعامل مع كل من المواد الكيميائية. تجنب استنشاق أو ملامسة الجلد مباشرة.
      3. إزالة المتوسطة النمو. يغسل بسرعة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميكرولتر من تثبيتي PFA لكل بئر. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT.
    5. إزالة تثبيتي PFA من العينة وإضافة 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو عازلة التصوير (100 ملي تريس مع 30 ملي كلوريد الصوديوم، و 20 ملي MgCl 2، ودرجة الحموضة 8.5) لكل بئر.
    6. دوامة 100 نانومتر جزيئات الذهب لتفريق المجاميع وإضافة 35 ميكرولتر لكل بئر (10X التخفيف النهائي) لتتبع مرحلة الانجراف أثناء التصوير.
  2. الحصول على صور
    1. بدوره على المجهر. السلطة على 405 و 561 نانومتر الليزر، ولكن يبقى مصاريع(داخلي أو خارجي) أغلق عند هذه النقطة. تشغيل الكاميرا EMCCD واتركه ليبرد. ضمان 561 مرشحات نانومتر في مكانها الصحيح.
    2. فتح برنامج الحصول على وتعيين وقت التعرض إلى 100 مللي ثانية وكسب EMCCD إلى 300 (مجموعة 1 - 1000).
    3. إضافة زيت الغمر للهدف وتأمين العينة إلى مرحلة المجهر.
    4. مع أي حقل مشرق أو الليزر 561 نانومتر على (~ 1 كيلو وات / سم 2)، وجلب العينة إلى التركيز.
    5. لتصوير رأس وبروتينات غشاء أخرى، استخدم الهدف TIRF 60X امزيغ مع 1.49 الفتحة العددية وتقديم المجهر في التكوين TIRF. ضبط الليزر الإثارة بحيث يكون خارج تركزت عندما تصل إلى الفتحة الخلفي من الهدف TIRF. هذا يسبب الليزر ليصرف على الوصول إلى عينة. الحفاظ على ضبط الليزر حتى يتم الوصول إلى الزاوية الحرجة ويجري تعكس الليزر الظهر. بحث عن خلية لصورة مع العديد من جزيئات الذهب في الرأي. تحديد المنطقة ذات الاهتمامان يرفق الخلية (أو منطقة داخل الخلية) وجزيئات الذهب.
      ملاحظة: TIRF يقلل من عمق الاختراق من الليزر الإثارة ويقلل من الخروج من إشارة الخلفية التركيز. بالإضافة إلى ذلك، من المرجح أن يكون أكثر دقة عندما مزيد من جزيئات الذهب هي في رأي تصحيح الانحراف.
    6. إذا كانت متوفرة، والانخراط في نظام ضبط تلقائي للصورة لتصحيح انحراف العينة في ض الاتجاه. خلاف ذلك، وضبط التركيز يدويا في جميع أنحاء اكتساب إذا كانت الصورة يخرج من التركيز.
    7. بدء استحواذ مع 405 نانومتر ليزر قبالة والليزر 561 نانومتر على (~ 1 كيلو وات / سم 2) في حالة تفعيل كاف هو ما يحدث بالفعل (عادة إذا كانت مستويات التعبير مرتفعة). خلاف ذلك، بدوره على نانومتر ليزر 405 في وضع أدنى طاقة المصنع (0.02 ميغاواط أو 0.01 W / سم 2) وزيادة تدريجيا (0.1 ميغاواط في وقت واحد) حسب الضرورة حتى هناك عدة عشرات من الجزيئات في الإطار أو حتى جزيئات واحدة يتم فصل جيدا.
    8. مع استمرار الحصول على البيانات، غرادزيادة مثير جنسيا 405 نانومتر قوة الليزر للحفاظ على كثافة بقعة ثابتة تقريبا.
      ملاحظة: في أقل 405 نانومتر قوة الإثارة، يمكن بالفعل تنشيط بعض PAmCherry1. حيث أن هذه الجزيئات photobleach، فإن عدد سكان المتبقية جزيئات PAmCherry1 photoactivatable يتناقص، الأمر الذي يتطلب تدفق الفوتون العالي للحفاظ على نفس كثافة الجزيئات التي ينبعث منها مضان في كل إطار.
    9. مواصلة الحصول على الصور حتى ارتفاع 405 قوة نانومتر (2،5 حتي 10 W / سم 2) لا يتم تنشيط المزيد من الأحداث التنشيط.
      ملاحظة: إجمالي اكتساب الوقت يعتمد على مستوى التعبير وكفاءة تكامل.
  3. معالجة الصور
    ملاحظة: هناك العديد من الخيارات البرمجيات مفتوحة المصدر لمعالجة الصور. ومن الأمثلة على ذلك عاصفة رعدية (https://code.google.com/p/thunder-storm/) وQuickPALM (https://code.google.com/ص / quickpalm /). موضحة إجراءات معالجة البيانات النموذجية هنا بإيجاز باستخدام حزمة ماتلاب مخصص يسمى wfiread معالجة البيانات وPALM كمثال على ذلك. ومع ذلك، المراجعات المستقبلية قد لا يتبع بالضبط ما هو موضح هنا. لمعالجة الصور مع البرامج الأخرى، يرجى الرجوع إلى الوثائق المستخدم.
    1. تحميل برامج معالجة الصور (قانون التكميلي ملف) أو الإصدار الأحدث في http://www.ohsu.edu/nan. فتح مطلب وتحميل البرامج wfiread (التي وضعت بالفعل في المسار الافتراضي).
    2. عرض تسلسل الصور الخام وتحديد المنطقة ذات الاهتمام. حدد منطقة المكدس لتتم معالجتها عن طريق النقر على اليسار وسحب مربع حول المنطقة المطلوبة. إذا لم يقل منطقة الفائدة خلال اقتناء (نحو 256x256 بكسل)، حدد مساحة أصغر لتقليل الوقت حساب. لإلغاء منطقة والعمليات الإطار بأكمله، انقر بزر الماوس الأيمن في أي مكان في اله الصورة.
    3. دخول مجموعة من الإطارات لتتم معالجتها.
    4. حدد الجسيمات الذهب (واحد هو أن عزل وموحدة في الشكل) عن طريق النقر الأيسر على الصورة وسحب مربع صغير من حوله. تحت تتبع الجسيمات، انقر فوق الزر المسار. سيظهر رسم بياني يوضح الموقف من الجسيمات الذهب المختارة عبر كومة من الصور، التي تصور مدى الانحراف.
    5. كرر هذه العملية لتعقب العديد من جزيئات الذهب ممكن، وتحديد تلك التي تتبع معا (الجزيئات سوف يكون لون مشفرة). من الناحية المثالية الانجراف الكلي هو بناء على أمر من بكسل واحد على الأكثر.
    6. فردي تحديد جزيئات الذهب التي تعقب معا في وقت واحد وانقر على زر ماركر إضافة إطار تتبع الجسيمات. سيظهر الصليب الأخضر مما يدل على أنه قد تم إضافته كعلامة وسيتم استخدامها لتصحيح الانحراف.
    7. ضبط المدى سيغما، المدى تجانس وعتبة عند الضرورة عن طريق تغيير القيم قليلا. انقر بحث الجسيماتزر لاختبار الإعدادات. سيتم محاصر الجزيئات التي سيتم تجهيزها وتلك التي لن يتم استبعاده. جزيئات PAmCherry1، الجزيئات التي تكون الجولة نسبيا ومشرق، ويجب أن يكون محددا.
    8. بدء معالجة الصور عن طريق النقر على زر الصنع COORD الملف وحفظ الملف.
      ملاحظة: سيقوم البرنامج تذهب من خلال كل إطار في نطاق الإطار المحدد، والعثور على جميع البقع الفلورسنت، وأداء المناسب الضبابي للعثور على إحداثيات النقطه الوسطى. سيتم إنشاء ملف .cor تخزين جميع الإحداثيات والمعلمات المناسب غيرها من الصور جزيء واحد معالجتها.
  4. بعد عملية الصور وتجعل الصورة PALM
    ملاحظة: برامج أخرى قد تجعل مباشرة على صورة بعد تنسيق الاستخراج.
    1. في Matlab، وإطلاق حزمة 'نخيل' وتحميل الملف .cor بإنشائها.
    2. قبل تقديم صورة PALM باستخدام الإحداثيات، فرز الإحداثيات الفردية (كل من "localizatiعلى الحدث '). قد تختلف القيم المثلى الفرز حسب الإعداد وfluorophore.
      1. لPAmCherry1، استخدم القيم التالية: الجمع بين الإطار - 8؛ الجمع بين المسافة (نانومتر) - 100؛ الحد الأدنى RMS - 4؛ الحد الأدنى صالح الخير - 0.25. وماكس. الانحراف - 1.4. راجع قسم مناقشة تفسيرا إضافيا لهذه المعايير.
    3. انقر فوق الزر الترتيب لإنشاء مجموعة جديدة من الإحداثيات على استعداد لتقديم صور عالية الدقة.
    4. إدخال قيم لتقديم السليم للصورة النهائية مثل حجم الخام بكسل (نانومتر)، وحجم الميزة المطلوبة (نانومتر) في الصورة المقدمة، وحجم بكسل للصورة المقدمة.
      ملاحظة: يجب أن يتم تحديد حجم بكسل الخام لكل الإعداد. يمكن تعيين حجم الميزة المقدمة بشكل تعسفي، ولكن عادة ما يتم تعيين في قيمة أعلى قليلا من متوسط ​​دقة الترجمة. لPAmCherry1، متوسط ​​الدقة توطين حوالي 18 نانومتر، وذلك على حجم سمة من سمات 20-30 نانومتر هو appropriaالشركة المصرية للاتصالات. من المذكرة، تم احتساب دقة الترجمة عن طريق اتخاذ الانحراف المعياري للتعريب من نفس الجزيء عبر عدة إطارات 22 وليس عن طريق قسمة الحد حيود مع الجذر التربيعي لعدد من الفوتونات الكشف. أما بالنسبة لحجم بكسل من الصورة المقدمة، و10 نانومتر هو نقطة انطلاق جيدة. ووضع هذه القيمة منخفضة جدا ينتج في ملفات صورة كبيرة دون داع لوجهات النظر unmagnified.
    5. انقر على زر التقديم لتوليد صورة PALM. استخدام +/- الرموز المكبرة في شريط الأدوات من النافذة الرقم إلى تكبير والتصغير.
    6. اختياري: إجراء تحليل مجموعة من الصورة PALM بناؤها باستخدام اختبار K ريبلي أو آليات أخرى مثل بمساعدة المحاكاة DBSCAN (SAD) 23. ملاحظة: في حزمة النخيل المخصصة، يتم بناؤها على حد سواء ريبلي K وتحليل SAD بالفعل في؛ لإحداثيات الناتجة عن البرامج الأخرى، يمكن إجراء نفس التحاليل مع البرامج النصية المخصصة إضافية.
    5. 3. واحدة تتبع جزيء في الخلايا الحية

    1. علاج السطح زراعة الأنسجة والخلايا لوحة كما هو موضح في البروتوكول 2. منذ درجة الحرارة و / أو CO 2 مرحلة التحكم قد يحتاج الى صحن ثقافة معينة، وضمان من أن ساترة لديه سمك المناسب (0.17 مم) لإعداد المجهري.
      1. Transfect الخلايا إذا فعل تعبير عابر وتنفيذ أي العلاجات اللازمة لهذه التجربة، مثل التتراسيكلين للحث على التعبير، واحتضان عند الضرورة. وهذا أيضا هو نفسه كما هو موضح في البروتوكول 2.
      2. مكان الطبق الثقافة في حاضنة على المسرح. السماح للطبق يستقر على المسرح لبضع دقائق حتى درجة الحرارة وتركيز CO 2 تحقيق الاستقرار في كل مرة بعد تركيب الطبق الثقافة أو الانتقال إلى منطقة جديدة من الفائدة. الليزر كتلة في هذه الخطوة. إذا CO 2 التحكم غير متوفرة، التغيير إلى CO 2 وسائل الإعلام المستقلة الحق قبل التصوير، مثل LeibovITZ في L-15.
        ملاحظة: يوصى المتوسطة مجانا الفينول الحمراء لمضان خلفية كئيبة.
    2. الحصول على صور كما في بروتوكول 2. ومع ذلك، تعيين وقت التعرض المناسب (عادة 25-50 ميللي ثانية لPAmCherry1).
      ملاحظة: يجب أن تكون كثافة جزيء أقل من الخلايا الثابتة بحيث يمكن تسجيل المسارات دون تداخل مع بعضها البعض. عشرات قليلة محددة من الجزيئات هو الحال بالنسبة للاستحواذ 256x256 بكسل في حجم بكسل حوالي 160 نانومتر. تم تعيين كثافة طاقة الليزر 561 نانومتر إلى 0.8 كيلو واط / سم 2 للحفاظ على نسبة جيدة إشارة إلى الضوضاء في حين خفض الضيائية إلى الخلايا وزيادة متوسط ​​طول المسار.
    3. معالجة الصور.
      1. استخراج إحداثيات جزيئات واحدة مع حزمة wfiread كما هو موضح في بروتوكول 2، أو مع حزمة أخرى.
      2. إعادة بناء مسارات الجسيمات واحدة باستخدام مختلف جسيم واحد تتبع (SPT) حزم على أساس خوارزميات مختلفة وجدتفي أماكن أخرى 24. ملاحظة: بدلا من ذلك، فإن هذه الخطوة يمكن إنجازه باستخدام حزمة ماتلاب بنيت المنزل (ربما المتاحة في المراجعات المستقبلية في http://www.ohsu.edu/nan.
      3. اختياري: بعد إعادة الإعمار، استخدم حزمة SPT 24 لحساب تشريد ونشرها الثوابت من مسارات. بالإضافة إلى ذلك، استخدم تباين بايز واحد الجسيمات تتبع (vbSPT) 25 لتحديد الدول نشرها من البروتينات المستهدفة. ويمكن الاطلاع على حزمة vbSPT مطلب والوثائق في موقع سورس موقعها الرسمي: http://vbspt.sourceforge.net/.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

على سبيل المثال BiFC-PALM المبين هو KRAS G12D متحولة التفاعل مع رأس ملزم المجال (RBD) من CRAF (الشكل 1A). كما تمت مناقشته، لم الموسومة RN أو شظايا RC إلى C-محطة رأس لأنه سيعطل توطين الغشاء وبالتالي النشاط البيولوجي للرأس. خفضت هذه التركيبات الممكنة 8-4 (الشكل 1B). وقدم كل من هذه المجموعات الأربع إلى خلايا U2OS باستخدام عدوى lentiviral. تم إصلاح الخلايا كما هو مفصل في البروتوكول، وجرى تقييم الإشارات BiFC باستخدام الإعداد PALM. وقد تم تحديد الخلايا مع الإشارات BiFC إيجابية من الزيادة المفاجئة في مضان عندما تحولت الليزر 405 نانومتر جرا؛ كان ليزر 561 نانومتر في جميع أنحاء تجربة التصوير. ويرجع ذلك إلى تنشيط ضوئي من PAmCherry1 BiFC أعيد عليها الإضاءة مع ليزر 405 نانومتر هذا التغيير المفاجئ في مضان. تم تقييم مناطق متعددة في العينة باستخدام هذا النهجوحسبت كثافة إشارة BiFC عن طريق حساب متوسط ​​الزيادة في كثافة بكسل قبل وبعد نبضة رفيع المستوى من الليزر 405 نانومتر.

كما رأينا في الشكل 1C، للخروج من التشكيلات الممكنة أربعة، اثنين من تكوينات (وهي آكانيوز الراس / RC-راف RBD وRN-رأس / راف RBD-RC) كان إشارات قوية BiFC. وكان آخر التكوين (RC-رأس / راف RBD-RN) إشارة ضعيفة، وكان واحدا أي إشارة. لجميع التجارب اللاحقة، تم استخدام RN-رأس / راف التكوين RBD-RC (الجزء العلوي الأيمن في الشكل 1C). ونتيجة لسيطرة سلبية، وقدم طفرة نقطة (R89L) في المجال رأس ملزم من سلاح الجو الملكي البريطاني وكان اختبار كفاءة BiFC باستخدام نفس التكوين. كانت تعرف هذه الطفرة لعرقلة راف ملزم للرأس. باستمرار، وطفرة تقلص إلى حد كبير إشارة BiFC (1D الشكل).

منذ الجزيئات PAmCherry1 ولدت من خلال BiFC أظهرت خصائص مشابهة لتنشيط ضوئي الأصليPAmCherry1 10، وهذا يسمح للتصوير PALM العينات BiFC باستخدام نفس الإعدادات التجريبية كما هو الحال مع PAmCherry1 الأم. يظهر مثال الصورة PALM الخلايا مع إشارة BiFC قوية بعد الإصابة مع RN-رأس وراف RBD-RC في الشكل 2A.

عند التكبير في (أسفل الشكل 2A اليسار والأشكال، مع تضخيم المناطق محاصر)، والجزيئات الفردية والتوزيع المكاني النانو يمكن مشاهدتها بوضوح. وتجدر الإشارة، كل نقطة في هذه الصور PALM تمثل واحدة المفترض مجمع رأس راف RBD الموسومة مع جزيء PAmCherry1. وعلى سبيل المقارنة، ومحاكاة الجانب الأيمن من الشكل 2B الصور ذات الدقة المنخفضة من نفس الحقول للعرض، حيث أصبحت مجموعات غامضة تماما. مراقبة التجمعات رأس راف RBD تتفق مع الملاحظات السابقة على سلوك تجميع رأس وسلاح الجو الملكي البريطاني.

مع الخلايا الحية معربا عن BiFC إعادة تكوين PAmCherry1، كان SMT-PALM PERFOrmed للحصول على مسارات نشر الفردية المجمعات رأس راف RBD، على غرار الموصوفة سابقا 10. تحت إضاءة مستمرة مع 561 نانومتر و 405 نانومتر أشعة الليزر، وجزيئات PAmCherry1 الفردية تبديل عشوائيا على وتستمر لبعض الأطر قبل دخول الدول الظلام (ويرجع ذلك جزئيا إلى photobleaching من). في هذه الفترة من الزمن، فإن جزيئات أظهرت اثنين على الأقل من السلوكيات نشر مختلفة: دولة متحركة (الشكل 2B، جزيء 1) ودولة النقالة (الشكل 2B، جزيء 2). كلا النوعين من مسارات موجودة بوضوح في (س، ص) مؤامرة هو مبين في الشكل 2C، حيث يتم تسجيل مسارات الجزيئات متعددة. نفس التوزيع غير المتجانس للدول الانتشار ويمكن الاستدلال على ذلك من الرسم البياني للنزوح الجزيئي بين الأطر المتعاقبة. عادة، 10،000 - 100،000 مسارات نشرها يمكن الحصول عليها من كل خلية. هذا عدد كبير يسمح للتحليل الإحصائي أكثر صرامة روقال انه نشر الدول، على سبيل المثال مع الخوارزمية vbSPT 25.

الشكل 1
الشكل 1. BiFC-PALM التصميم التجريبي للتفاعل رأس راف. (A) رأس هو بروتين بغشاء التي تجند راف عندما نشط. عندما تعلق غير الفلورسنت شظايا PAmCherry1 الانقسام إلى رأس وسلاح الجو الملكي البريطاني، والتفاعل يجلب شظايا معا، ويحدث تكامل، مما أدى إلى بروتين فلوري وظيفية. (B) ومنذ وضع علامات رأس في دورته C-محطة سيربك توطين الغشاء، تم تخفيض عدد من التشكيلات اختبار لرأس راف BiFC-PALM 8-4. (C) الصور من الخلايا U2OS معربا عن تكوينات اختبار اتخذت مع المجهر TIRF. لقياس كفاءة BiFC من كل التكوين، يتم إعطاء الخلايا نفس جرعة عالية من 405 نانومتر بينما الضوءيجري متحمس مع 561 ضوء نانومتر. (D) تقديم الطفرة R89L في سلاح الجو الملكي البريطاني RBD تقلص إلى حد كبير إشارة BiFC من التكوين RN-KRAS G12D / CRAF RBD-RC (الجزء العلوي الأيمن في C، ن = 5-8). أشرطة الخطأ هي SEM في (D). الحانات النطاق في (C) و 10 ميكرون. RN = PAmCherry1 N-المحطة جزء، جزء RC = PAmCherry1 C-المحطة، وRBD = رأس نطاق ملزمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. BiFC-PALM الخلايا U2OS معربا عن التكوين RN-KRAS G12D / CRAF RBD-RC. (A) يظهر صورة PALM كامل أعلاه. يمكن تكبيرها لوحات أقل آراء المناطق محاصر في الصورة العليا كما هو مبين. إدراجات أعلىتكبير من المناطق محاصر في وجهات النظر كل المكبرة. الجانب الأيمن من الألواح الدنيا (TIRF المسمى) وتمثيل الصور على يسارهم كما لو اتخذت مع المجهر محدودة الحيود. (B) إطارات متتالية من خلية حية SMT-PALM التجربة التي تصور بطيئة (1) وبسرعة (2) نقل المجمعات رأس راف. (C) ناتج من تجربة SMT-PALM تبين مسارات انتشار المجمعات رأس راف داخل منطقة صغيرة من الخلايا. (D) الرسم البياني للنزوح في إطار مجمعات رأس راف من تجربة SMT-PALM. الحانات النطاق في (A)، و 5 ميكرون أعلى و 500 نانومتر أسفل، 50 إدراجات نانومتر، و (C)، 1 ميكرون. RN = PAmCherry1 N-المحطة جزء، جزء RC = PAmCherry1 C-المحطة، وRBD = رأس نطاق ملزمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تسلسل التمهيدي (5 'إلى 3')
استنساخ البلازميد لإدراجها في N-محطة العكس CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC
RN في N-محطة الأمام GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA
RC في N-محطة الأمام GGCGCCCTGAAGGGCGA
استنساخ البلازميد لإدراجها في C-محطة الأمام TAAAAGGGTGGGCGCGCC
RN من الاتجاه المعاكس C-محطة GTCCTCGGGGTACATCCGCTC
RC من الاتجاه المعاكس C-محطة CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG

الجدول 1. كبسولة تفجير عن linearizing البلازميدات استنساخ تحتوي على شظايا PAmCherry1. البلازميدات استنساخ تحتوي على RN وRC يمكن خطي مع معكوس PCR عند نقطة الإدراج في أي من N- أو C-محطة من شظايا. يتم سرد تسلسل 5 'إلى 3R17 ؛.

يتدلى لجين الاشعال الفائدة (5 'إلى 3')
N-محطة RN الإدراج أو RC إلى الأمام GAGCTCGGTACCATG
N-محطة العكس الإدراج RN ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC
N-محطة الإدراج RC العكس ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC
C-محطة RN الإدراج إلى الأمام ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT
محطة C الإدراج RC إلى الأمام GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT
محطة C الإدراج RN أو العكس RC GCGCCCACCCTTTTA

الجدول 2. يتدلى لجين الاشعال الفائدة التي تطابق الجدول 1 الاشعال. يتم إنشاء أزواج قاعدة 15 من التماثل للتفاعل ربط مستقلةمن يتدلى التمهيدي. بالإضافة إلى ذلك، تشمل يتدلى تسلسل ل(GGGGS) X2 رابط مرونة. ويمكن أن يضاف تسلسل رابط مرنة لالاشعال في الجدول رقم 1 بدلا من ذلك. يتم سرد تسلسل 5 'إلى 3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد BiFC أسلوب يستخدم عادة للكشف عن وتصور مثبطات مضخة البروتون في الخلايا، في حين PALM هو جزيء واحد superresolution تقنية المجهر الأخيرة التي تمكن التصوير النانو العينات البيولوجية سليمة. مزيج من BiFC مع PALM يتحقق التصوير الانتقائي لمثبطات مضخة البروتون داخل زنزانة مع نانومتر القرار المكانية وحساسية جزيء واحد. BiFC النخيل تمتد فائدة كل من التقنيات، وكما هو موضح في هذا العمل، ويظهر وعدا كبيرا في الكشف عن تفاصيل الجزيئية من مثبطات مضخة البروتون في سياق الخلوي الأصلي الخاصة بهم. على وجه الخصوص، القرار نانومتر يسمح لتحقيق مفصل من التنظيم المكاني والزماني لمثبطات مضخة البروتون محددة على المستوى الجزيئي، الذي كان تحديا في مجال البحوث الطبية الحيوية. لكن، وكما ذكرت من قبل، BiFC-PALM محدودة بسبب عدم التراجع عن تكامل وبطيئة حامل اللون النضج.

وقد استخدم الانقسام PAmCherry1 للتدليل على مبدأ وشtility من BiFC النخيل. وقد PAmCherry1 تستخدم على نطاق واسع في التجارب PALM لخصائصه بالفوتونات ممتازة. فائدة إضافية من استخدام PAmCherry1 كما المسبار BiFC هي خلفية منخفضة والنوعية العالية والكفاءة في البروتين إعادة في 37 ° C عندما يقترن إلى مثبطات مضخة البروتون. لهذه الأسباب، ومن المتوقع أن تصبح موردا قيما ينطبق على العديد من التحقيقات البيولوجية المختلفة التي تشمل التصوير عالية الدقة من مثبطات مضخة البروتون الانقسام PAmCherry1 BiFC التحقيق. بالإضافة إلى PAmCherry1، وهو بروتين فلوري photoconvertible، mEos3.2، انقسمت أيضا لBiFC-PALM 26. لأن أطياف انبعاثاتها تتداخل، mEos3.2 وPAmCherry1 لا يمكن استخدامها جنبا إلى جنب، ولكن تم مؤخرا ذكرت الأخضر PA-27 ضباط الإتصال، وفتح إمكانية اللونين النانو superresolution التصوير من مثبطات مضخة البروتون.

كما هو الحال في BiFC التقليدية، خطوة حاسمة في تنفيذ BiFC-PALM هو تصميم والاستنساخ من بنيات الانصهار. حقيقة أن ما يصلإلى ثمانية بنيات التعبير المختلفة يجب أن تكون مستنسخة وثمانية أزواج BiFC يكون لفحصها في كل محاولة لتنفيذ BiFC BiFC والنخيل يمكن أن تكون شاقة، إن لم يكن باهظة، العملية. ومع ذلك، كما هو موضح في المثال رأس راف، والمعرفة المسبقة على الخواص البيوكيميائية والهيكلية للبروتينات ذات الاهتمام في كثير من الأحيان يمكن استخدامها لتوجيه التصميم الأمثل للبنيات الانصهار مع عدد محدود من أزواج BiFC لفحصها. وقال، في الوقت الراهن ليس هناك التوجيهي الشامل لضمان أن BiFC (وبالتالي BiFC-PALM) التجربة ستعمل؛ الكثير منها لا يزال فنا.

في حين BiFC BiFC والنخيل تستخدم عادة للتحقيق في تشكيل مغاير بين اثنين من البروتينات، كما أنه من الممكن لدراسة تشكيل homodimer باستخدام هذه الأساليب، وفي هذه الحالة اثنين من البروتينات مرشح ستكون هي نفسها. ومع ذلك، على هذا النحو، واثنين من البروتينات مع نفس جزء يمكن أن تتفاعل لكنه لن يؤدي في إشارة BiFC. على الرغم من كل بناء بدورمثبط تنافسي إلى أخرى، هذه التفاعلات هي عكسها، في حين أن التفاعلات مما أدى إلى تكامل ناجح سوف تتراكم ويرجع ذلك إلى عدم الرجوع. بشكل عام، يمكن أن يكون هناك انخفاض في إشارة إذا كان هناك اختلاف جذري بين مستويات التعبير عن كل بناء. لذلك، قد تحتاج إلى أن تحدد عند المقارنة بين شدة مضان (على سبيل المثال، بين نوع البرية وعينات homodimer متحولة) في مستويات التعبير الذاتية مستويات التعبير عن ثوابت اثنين. ولعل هذا هو السبب في إجراء التجارب BiFC عادة مع transfections عابرة وoverexpression من بنيات.

أخيرا وليس آخرا، لا بد من تأكيد جميع التجارب BiFC مع ضوابط سليمة. إذا إشارة BiFC موجودة، هناك فرصة أن الإشارة هي غير محددة (أي شظايا يتم إعادة تشكيل بمفردهم وليس بسبب PPI). واحد السيطرة السلبية هي الطفرات في أحدهما أو كليهما البروتينات التي هي معروفةلتعطيل التفاعل، والتي ينبغي أن يؤدي إلى خسائر كبيرة في إشارة BiFC. إذا كان هذا طفرة نقطة غير معروفة، وطرق أخرى يمكن استخدامها، مثل إدخال شريك ملزم تنافسية إلى واحد من البروتينات ومعرفة ما إذا كان هناك انخفاض يصاحب ذلك في إشارة.

الوضع أكثر صعوبة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها عدم وجود إشارة BiFC، أو السلبيات كاذبة. في مثل هذه الحالات، فمن المهم أن تشمل الضوابط الإيجابية خلال عملية الاستنساخ، مثل السيطرة GFP خلال transfections. يمكن تشغيل البقع الغربية للتحقق من التعبير عن ثوابت. إذا كانت هذه العوامل هي طبيعية، قد تحتاج عوامل أخرى يجب أن يتغير، مثل طول رابط و / أو التسلسل، أو ينبغي النظر في تكوين BiFC مختلفة.

أما بالنسبة للجزء PALM، لا بد من النظر في عدد من المعلمات عند معالجة الصور. خطوة 2.4.2.1 توضح المعايير المستخدمة لتصنيف الإحداثيات وتوليد الصورة PALM النهائية. الأولمعلمتين، الجمع بين الإطار والجمع بين المسافة وتحديد إذا حدثين التعريب على حد سواء داخل 100 نانومتر، ويبدو أقل من 8 إطارات (100 ميللي ثانية / الإطار) أو ~ 0.8 ثانية بعيدا كما وصفنا سابقا 23. إذا كان الأمر كذلك، ثم سيتم النظر فيها أن تنشأ من نفس الجزيء، وسوف تكون مجتمعة الإحداثيات الخاصة بها عن طريق حساب متوسط. الدول مظلمة مع أعمار أكبر بكثير من 0.8 ثانية لPAmCherry1 يبدو أن تكون نادرة. كما حال وجود fluorophore يتعافى من حالة الظلام عمرا طويلا لا يمكن تمييزه عن جزيء مختلفة في مضان المسافة القريبة التي ينبعث منها، تعتبر حدثين التعريب أن تنشأ من نفس الجزيء إلا إذا ظهر في عدد معين من الإطارات و المسافة الجسدية. تجريبيا، وهو 'الجمع بين إطار "الإعداد في 12/8 الإطارات (0،8-1،2 ثانية) ويبدو أن الأمثل في ظل الظروف التجريبية لدينا. الحد الأدنى RMS يحدد نسبة الحد الأدنى بين السعة المناسب والانحراف المعياري للضوضاء بقايا بعدتركيب. يتم تسجيل هذه القيم في ملف .cor خلال تنسيق الاستخراج.

باختصار، BiFC-PALM يجمع بين مزايا BiFC والنخيل وتمكن التحقيق من مثبطات مضخة البروتون في التفاصيل أكبر بكثير مما تم إنجازه سابقا. مع اعتبارات العوامل المذكورة أعلاه ومع التجارب الرقابة السليمة، يجب أن يكون BiFC-PALM أداة مفيدة لدراسة مثبطات مضخة البروتون في مجموعة واسعة من إعدادات البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope frame Nikon Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA Nikon CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera Andor iXon Ultra 897
561 nm laser Opto Engine MGL-FN-561
405 nm laser Coherent CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror Semrock  Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter Semrock FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter Semrock NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage Tokai Hit INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS Addgene 60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS Addgene 60546
pcDNA3.2-DEST Life Technologies 12489-019
pLenti-DEST Addgene http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-531
In-Fusion HD Cloning Clontech 639649
LR Clonase Life Technologies 11791
Vira Power Lentivirus Packaging Life Technologies K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent Roche 13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Scientific 155409 #1.5 glass bottom dishes
U2OS cells ATCC HTB-96
293T/17 cells ATCC CRL-11268
DMEM with phenol red Life Technologies 11995
DMEM no phenol red Life Technologies 21063
Fetal bovine serum Life Technologies 10082
Leibovit's L-15, no phenol red Life Technologies 21083-027
Reduced serum medium Life Technologies 31985
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14040
Syringe BD Biosciences 309604
Syringe filter Millipore SLHV033RB
Lentiviral concentrator Clontech 631231
Retroviral concentrator Clontech 631455
10 cm culture dish BD Biosciences 353003
6-well culture plate BD Biosciences 353046
Polybrene Sigma 107689
Puromycin Life Technologies A11138
G-418 Calbiochem 345812 Neomycin
Doxycyline Fisher BP2653
Tris base Fisher BP152
EDTA Sigma EDS
Sodium Hydroxide Sigma S5881
Paraformaldehyde Sigma 158127
Glutaraldehyde Sigma G6257
PIPES Sigma P6757
HEPES Sigma H4034
EGTA Sigma 3777
Magnesium Sulfate Sigma M2643
Potassium Hydroxide Sigma 221473
Sodium chloride Fisher BP358
Magnesium chloride Fisher M33
100 nm gold particles BBI Solutions EM.GC100
Molecular grade water Life Technologies 10977
Dpn1 New England Biolabs R0176
PCR purification kit Qiagen 28104
Miniprep kit Qiagen 27104
Midiprep kit Macherey-Nagel 740410
0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher 05-408-137
15 ml tubes Fisher 05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352059
50 ml tube BD Biosciences 352070
PCR tube GeneMate C-3328-1
SOC medium Life Technologies 15544
LB broth BD Biosciences 244610
Kanamycin sulfate Fisher BP906
Competent cells Life Technologies C4040
Matlab Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
  3. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  4. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  5. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
  6. Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
  7. Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  10. Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
  11. Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
  12. Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
  13. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  14. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  15. Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
  16. Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
  17. Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
  18. Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D (2001).
  19. Morrison, S. L. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Coligan, J. E., et al. Appendix 3, Appendix 3M (2001).
  20. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
  21. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
  22. Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
  23. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  24. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
  25. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  26. Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
  27. Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 106، تفاعل البروتين البروتين، superresolution المجهر، photoactivated توطين المجهر، ثنائي الجزيء تكامل مضان، وتتبع جزيء واحد، PAmCherry، البروتين المجموعات، vbSPT
Photoactivated التعريب المجهري مع ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC-PALM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, A., Huang, T., Lin, L.… More

Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM). J. Vis. Exp. (106), e53154, doi:10.3791/53154 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter