Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn van fundamenteel belang voor de biologie 1 en zijn strak gereguleerd via spatiotemporele mechanismen heel veel tijd en lengteschalen. Studies on cell signaling op het celmembraan, bijvoorbeeld, zijn dynamische, nanoschaal ruimtelijke compartimenten specifieke PPI en cellulaire processen 2 vergemakkelijken geopenbaard. Vandaar dat de mogelijkheid om protonpompremmers in biologische systemen sonde met voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, hoge specificiteit en hoge gevoeligheid is de sleutel tot het bereiken van een mechanistisch begrip van de biologie.
Bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) is één van de weinige bestaande instrumenten voor het visualiseren van PPI's in een cel met subcellulaire resolutie en live-cell compatibiliteit 3-5. De techniek is relatief eenvoudig en omvat splitsing van een fluorescentie-eiwit in twee niet-fluorescerende fragmenten; wanneer genetisch gelabeld twee interagerende eiwitten enin de nabijheid komt, kunnen de fragmenten reconstrueren tot een volledig fluorescent eiwit vormen, waarbij fluorescent signaal. Indien juist ontworpen, mag BiFC probes niet spontaan reconstitueren in afwezigheid van protonpompremmers. Als zodanig zal het fluorescentiesignaal in een BiFC assay alleen voordoen in aanwezigheid van protonpompremmers, die directe visualisatie van protonpompremmers met hoge specificiteit mogelijk maakt. Bijkomende voordelen van het gebruik van fluorescentie als uitlezing zijn hoge gevoeligheid, subcellulaire resolutie, en compatibiliteit met hoge doorvoer en hoge gehalte screeningstesten, onder anderen. Om deze voordelen is een aantal BiFC probes op basis van verschillende bovenliggende fluorescente proteïnen ontwikkeld. Zoals in alle andere detectietechnieken gebaseerd op conventionele lichtmicroscopie echter de ruimtelijke resolutie van BiFC beperkt tot ~ 250 nm door diffractie van licht. Dit maakt het een uitdaging om de regulering van de PPI's bestuderen op nanoschaal, die, zoals eerder gezinspeeld en geïllustreerd door lipid rafts 6 and Ras nanoclusters 7, is een kritische lengte schaal om het begrijpen van vele cellulaire processen zoals signalering.
BiFC is gecombineerd met fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) 8,9 om deze limiet in de ruimtelijke resolutie te overwinnen voor het afbeelden van PPI 10. PALM is een recente superresolutiemicroscopie techniek die de diffractielimiet in fluorescentie beeldvorming door middel van stochastische activering en subdiffractive lokalisatie van enkele fluorescerende moleculen omzeilt. In elke cyclus activatie, een fluorescent molecuul geeft een paar honderd tot een paar duizend fotonen en geeft aanleiding tot een enkel beeld molecule op de detector. Terwijl het beeld buigingsbegrensde (~ 250 nm breed), het zwaartepunt kan worden bepaald met een veel hogere nauwkeurigheid, typisch in de orde van 10-50 nm afhankelijk van het aantal gedetecteerde fotonen. Door het activeren en het lokaliseren van elke fluorescerende moleculen in het monster, kan een hoge resolutie worden gereconstrueerd. Performed op levende cellen, enkel molecuul volgen (smt-) PALM verdere vergunningen overname van duizenden eiwit diffusie trajecten van een enkele cel 11. Belangrijk PALM gebruikt gespecialiseerde fluorescente probes zoals activeerbare fluorescente eiwitten (PA-KP) stochastische activatie bereiken. Aangezien zowel BiFC en PALM gebruik fluorescerende eiwitten, werden zij gecombineerd door het splitsen PAmCherry1, een veelgebruikte PA-FP voor PALM, in twee fragmenten tussen aminozuren 159 en 160.
Het BiFC systeem op basis van split PAmCherry1 toont lage achtergrond signaal van spontane reconstructie van de twee fragmenten. Bij genetisch gelabeld met een paar interagerende eiwitten, de twee fragmenten (RN = residuen 1-159; RC = Met + residuen 160-236) efficiënt gereconstitueerd volledige PAmCherry1 eiwitten ook bij 37 ° C en zonder incubatie bij lagere temperaturen ontstaan, waardoor is niet het geval voor andere BiFC paren 12, zoals de ouder mCherry 13. Furthermoopnieuw, de opgeloste PAmCherry1 eiwit behield de fotofysische eigenschappen van de moedermaatschappij PAmCherry1, zoals hoge contrast ratio, medium foton opbrengst, en snel fotoactivatie, onder anderen, die kritisch zijn voor accurate single molecule lokalisatie en hoge-resolutie PALM beeldvorming zijn.
In dit protocol, het gebruik van BiFC-PALM voor beeldvorming van Ras-Raf interacties in U2OS cellen door het gebruik van split PAmCherry1 (figuur 1A) wordt beschreven. De eerste stap is om de constructen te ontwerpen voor expressie fusieproteïnen tussen PAmCherry1 fragmenten (dat wil zeggen, RN en RC) en de eiwitten van belang. In theorie, voor elk paar kandidaateiwitten (A en B) zijn er acht paren fusie-eiwitten te onderzoeken: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; en A-RC / B-RN. Deze werkwijze kan vaak worden vereenvoudigd door rekening te houden met de structurele of biochemische eigenschappen van de kandidaat eiwitten. Bij Ras, het eiwitpost-translationeel gemodificeerd aan het C-terminale CAAX box (C = Cys; A = alifatisch; X = elk), waarna de AAX motief wordt afgesplitst. Vandaar RN of RC kan alleen worden gefuseerd aan de N-terminus van Ras; dit vermindert het aantal fusieproteïne paren vier (Figuur 1B). Voor Raf, de Ras-bindend domein (RBD; resten 51-131) wordt gebruikt en kan worden gelabeld aan beide zijden. Deze vier fusion configuraties werden gegenereerd: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; en RC-KRAS / Raf RBD-RN.
Bovendien zal de linker tussen de fragmenten en de eiwitten van belang te worden overwogen. Een flexibele linker van ongeveer tien aminozuren wordt vaak gebruikt omdat het voldoende vrijheid complementatie optreden. Een dergelijke linker is (GGGGS) x2, maar er zijn vele anderen die met succes zijn toegepast, met inbegrip van willekeurige sequenties gegenereerd uit een meervoudige kloneringsplaats (MCS) 14. De lengte van de linkers moet mogelijk worden geoptimaliseerd DependinG van de grootte van de eiwitten van belang en de oriëntaties in de omgang.
De PAmCherry1 fragmenten worden opgenomen in een kleine klonen backbone met flankerende MCSs (zie Materials List). Genen van belang kan worden ingebracht via de restrictieplaatsen of een ligatie onafhankelijke methode. Na kloneren en sequentieverificatie, wordt de expressiecassette overgebracht in een expressievector onder toepassing van een recombinase reactie, een klonen met hoge betrouwbaarheid en hoge efficiency.
Vervolgens worden de resulterende expressieconstructen getransfecteerd in de doelwitcellijn of, indien een stabiele cellijn is gewenst, verpakt in lentivirus voor het infecteren van de doelcellijn. Transiënte transfectie maakt een snelle validatie van de BiFC configuraties, maar potentiële problemen worden aangehouden. Transfectie met behulp van chemicaliën vaak benadrukt de cellen, wat resulteert in hoge autofluorescentie; terwijl het gebruik van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) Micrpy kan deze achtergrond signaal te verzachten door het beperken van de verlichting volume, TIRF ideaal wanneer de PPI's vinden plaats op de celmembraan. Bovendien transiënte transfecties leiden vaak tot hoge niveaus van eiwitexpressie, ver boven die van de endogene eiwitten die artefacten in het detecteren van de PPI kan veroorzaken. Daarom wordt aanbevolen dat stabiele cellijnen worden vastgesteld na een passende BiFC configuratie is vastgesteld door de eerste testen. Stabiele cellijnen hebben ook het potentieel voor afstembare expressie via doxycycline inductie 15.
Na infectie worden cellen geselecteerd met antibiotica, meestal puromycine en neomycine, één voor elk construct. De volgende stappen voor de monstervoorbereiding, beeldacquisitie en data-analyse wordt in detail beschreven in de protocollen.
Bij deze benadering worden de vorming van clusters op nanoschaal BiFC-PALM beelden van Ras-Raf RBD routinematig waargenomen (Figuur 2A </ strong>). Consequent, SMT-PALM trajecten van Ras-Raf RBD vertonen een heterogene verdeling in de diffusie staten (figuur 2B-D). Deze resultaten suggereren dat Ras-Raf-complexen bestaan meerdere toestanden op het celmembraan, vermoedelijk als monomeren en clusters, met potentiële biologische implicaties. Dit werk demonstreert de kracht van BiFC-PALM selectieve beeldvorming van protonpompremmers in cellen met nanometer ruimtelijke resolutie en gevoeligheid single molecule, die moeilijk te verkrijgen met gebruikelijke BiFC fluorescentie co-lokalisatie of fluorescentie-energieoverdracht (FRET) zijn.
Bij het ontwerpen van BiFC experimenten en interpretatie van de resultaten, is het belangrijk in het achterhoofd dat de BiFC proces onomkeerbaar is in de meeste gevallen, waaronder split PAmCherry1 te houden. Wanneer de twee fragmenten samen en vormen een volledige PAmCherry1 eiwit, de koppeling tussen de twee fragmenten, en daarmee de PPI permanent wordt. Dit beperkt het gebruik van BiFC en BiFC-PALM toezicht op de dynamiek van de protonpompremmers (bijv bindingskinetiek en niet de diffusie dynamiek van het eiwit complex eenmaal is gevormd) en soms zelfs kan leiden tot mislocalisatie van de PPI complexen.
Een bijkomende factor om te overwegen bij het ontwerpen BiFC PALM-experimenten is de vertraging in rijpingsproces chromofoor die inherent is aan fluorescente proteïnen. Zodra twee eiwitten interageren en de FP fragmenten samenkomen, ze meestal te hervouwen in de orde van seconden (rust van 60 seconden voor EYFP 3). Latere chromofoor rijping en fluorescerend signaal voort in de orde van minuten. Terwijl de fluorescentie detecteerbaar kan zijn binnen 10 minuten na oplossen van split-Venus, een snel vouwen YFP-variant, de half-time voor de rijping in het algemeen vaak rond 60 min 16. Split-PAmCherry1 werd waargenomen op vergelijkbare tarieven. Vandaar BiFC en BiFC-PALM zijn slechte keuzes voor het monitoren van real-time PPI kinetiek; andere methods, zoals FRET en een recent ontwikkelde afhankelijke dimerisatie fluorescent eiwit 17, kunnen meer geschikt voor dit doel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonen
- Bepaal de configuraties te klonen en kies een linker. Tag-eiwitten met de fragmenten op het N- of C-terminus zoals hieronder beschreven zodat ze niet de juiste lokalisatie verstoren. Gebruik een flexibele linker, zoals (GGGGS) x2.
- Genetisch tag de eiwitten van belang aan de PAmCherry1 fragmenten. Als een optie, gebruik maken van de klonen in de materialen lijst met de fragmenten RN (PAmCherry1 residuen 1-159) en RC (Met plus PAmCherry1 resten 160-236) met flankerende MCS sequenties vermeld plasmiden.
- Lineariseren de plasmiden die de fragmenten RN en RC inverse PCR (of restrictiedigestie) op het invoegpunt. Primers voor omgekeerde PCR zijn vermeld in tabel 1. Hieronder is een voorbeeld PCR-protocol dat wordt gebruikt in het lab van de auteur (zie Materials List voor de exacte gebruikte materialen in dit protocol).
- Meng de PCR-reactie samen gebracht tot een eindvolume van 50 pl met water: een dunwandigeed PCR-buis, voeg het water, 25 pi 2x master mix, 0,5 pi van elk van de voorwaartse en achterwaartse primers (20 uM verdund voorraad, 0,2 uM uiteindelijke concentratie) en 1 ng van het template. Gebruik de volgende cycling condities: 98 ° C gedurende 30 seconden, 30 cycli van 98 ° C gedurende 7 seconden en 68 ° C gedurende 2 min, en een uiteindelijke verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min.
- PCR de genen van belang voor insertie met de gelineariseerde plasmiden die RN en RC fragmenten. Voer de PCR zoals in stap 1.2.1 de verlengingstijd bij 68 ° C. Gebruik primers met overhangen die een flexibele linker sequentie bevatten, zoals GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT voor (GGGGS) x2 en 15 basenpaar homologie met de uiteinden van het gelineariseerde RN en RC plasmiden voor recombinatie.
Opmerking: De primer overhangen voor eiwitten van belang zijn in Tabel 2 bij gebruik van de primers die in Tabel 1 de plasmideskelet lineariseren. - Digest de PCRreactie met Dpn1 de PCR-matrijs te elimineren. Voeg 0,5 gl Dpn1 (20 U / ul) direct naar 50 ul PCR reactie. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur en warmte inactiveren bij 80 ° C gedurende 20 min. Als achtergrond sjabloon volhardt in latere stappen, verhoging van het enzym bedrag of het verlengen van de spijsvertering tijd.
- Zuiveren de PCR producten via een spin kolom zoals beschreven door de fabrikant.
- Voer een onafhankelijke ligatie-reactie op een gelineariseerde plasmide dat een RN of RC fragment met het gen van interesse te combineren. Meet de concentratie van de gezuiverde PCR producten: combineer 50 ng gelineariseerde plasmide en 50 ng van het gen van belang met 1 gl enzym premix en breng het totale volume 5 pl met gedeïoniseerd water. Incubeer bij 50 ° C gedurende 15 min, plaats op ijs en voeg 20 ul TE-buffer.
- Transformeren recombinante plasmiden in competente bacteriën 18.
- Selecteer 2-4 + (naar wens) kolonies voor O / N cultuur. Voeg 5 mlLB bouillon en 5 ul kanamycine (50 mg / ml voorraad) in een 14 ml polypropyleen buis met ronde bodem en voeg de gekozen bacterie kolonie met een gesteriliseerde entnaald. Incubeer bij 37 ° CO / N onder schudden bij 225 rpm.
- Freeze 1 ml O / N kweek van glycerol 19 en miniprep de rest als beschreven door de fabrikant.
- Voer sequencing een goede kloon te bepalen. Bij gebruik van plasmiden van de klonen in de Materials List, voorwaartse en achterwaartse M13 gebruiken primers (in afzonderlijke reacties) als nodig is om de volledige sequentie van het fusieconstruct te verkrijgen. Vergelijk met de verwachte volgorde met behulp van een alignment tool zoals BLAST van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Breng de sequentie geverifieerd constructen een expressieplasmide via een recombinase reactie.
- Voeg 75 ng van het plasmide bestemming & #8212; zoals pcDNA voor transiënte transfecties of pLenti voor lentivirale verpakking 20 - en 50 ng van het recombinante plasmide klonen met 1 gl enzym premix en brengen het totale volume 5 pl met gedeïoniseerd water. Incubeer bij 25 ° C gedurende 1 uur, voeg dan 5 ui TE-buffer.
Opmerking: Voor lentivirale verpakking en stabiele cellijn generatie, gebruikt een andere bestemming plasmide per construct, bijvoorbeeld een met puromycine resistentie en andere neomycine. Dit maakt dubbele selectie van getransduceerde cellen. Ook de promotor voor elk, zoals de constitutieve cytomegalovirus (CMV) promoter voor hoge expressieniveaus of CMV de TetO operator afstembare doxycycline-gereguleerde expressie. - Transformeren 5 ul in competente bacteriën en miniprep de plasmiden als in de stappen 1.2.6 tot 1.2.8, maar met de juiste antibiotica (meestal ampicilline).
- Voeg 75 ng van het plasmide bestemming & #8212; zoals pcDNA voor transiënte transfecties of pLenti voor lentivirale verpakking 20 - en 50 ng van het recombinante plasmide klonen met 1 gl enzym premix en brengen het totale volume 5 pl met gedeïoniseerd water. Incubeer bij 25 ° C gedurende 1 uur, voeg dan 5 ui TE-buffer.
- Lineariseren de plasmiden die de fragmenten RN en RC inverse PCR (of restrictiedigestie) op het invoegpunt. Primers voor omgekeerde PCR zijn vermeld in tabel 1. Hieronder is een voorbeeld PCR-protocol dat wordt gebruikt in het lab van de auteur (zie Materials List voor de exacte gebruikte materialen in dit protocol).
- Bepaal de optimaleBiFC configuratie.
- Co-transfecteren expressieplasmiden in U2OS cellen (of een cel van keuze).
- Voeg 350 ul fenol rood-vrij en antibiotica-vrij DMEM aangevuld met 10% FBS in elk putje van een 8-well 1,5 glazen onderkamer slide. Plate ongeveer 7,5 x 10 4 cellen per putje zodat cellen ongeveer 70% -90% confluent de volgende dag.
- De dag na plating, co-transfecteren expressieplasmiden met verschillende configuraties in elk putje met behulp van de geprefereerde reagens en zoals beschreven door de fabrikant.
- Voor elk putje, voeg 125 ng van elk expressieplasmide in 50 gl serumvrij medium gereduceerd in een 0,6 ml buis pipet op en neer te mengen. Voeg 1 ul van het transfectie reagens in het midden van de buis rechtstreeks in de media. Schud voorzichtig te mengen en laat de reactie te zitten voor 30 min.
- Vermindering van de media in elk putje van de kamer dia met ongeveer de helft. Voeg het transfectiemengsel druppelsgewijs aan de putjes en schud gently te mengen. Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24-48 uur. Wijzig de media de dag na transfectie.
- Afbeelding cellen op een fluorescentiemicroscoop zoals in protocol 2 vanaf stap 2.1.4.
Opmerking: Het monster kan worden afgebeeld op een standaard fluorescentiemicroscoop of de expressieniveaus zijn hoog en de camera is gevoelig genoeg voor de relatief lage foton uitgang van PAmCherry1. Opgeloste PAmCherry1 moleculen kunnen worden geactiveerd met een ultra violet filter set (405 nm) voorafgaand aan beeldvorming met een groen excitatie (561 nm) filter set.
- Co-transfecteren expressieplasmiden in U2OS cellen (of een cel van keuze).
- Eventueel maakt een negatieve controle door bijvoorbeeld het introduceren van een puntmutatie in een van de eiwitten van belang dat de interactie verstoort. Voer een plaatsgerichte mutagenèse 21 over het klonen plasmide van het eiwit te muteren en de gekozen configuratie.
- Genereren van een stabiele cellijn door het verpakken van de constructen in viraledeeltjes en infecteren U2OS cellen (of cellijn naar keuze). Overweeg een induceerbare (tetracycline) expressie systeem 15, zodat expressie kan voorafgaand worden aangezet om het afbeelden wanneer langdurig onomkeerbaarheid van BiFC is een probleem, of als afstembare expressie gewenst is.
LET OP: Het werken met virussen is geclassificeerd als Biosafety Level 2. Terwijl recente generaties van virale verpakkingssystemen hebben sterk de kans op het produceren van replicatie-competente virussen verminderd, sommige risico's zijn nog steeds aanwezig. Referenties kan gevonden worden op http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.- Herhaal stap 1.2.10 met een lenti- of retrovirale bestemming vector 20. Verhoging van de O / N kweek tot 100 ml voor een Midiprep en grotere zuiverheid van de plasmiden.
- Op Dag 1: Plate ongeveer 2 x 10 6 293T / 17 cellen in een 10 cm schaal voor elk construct te verpakken.
- Op dag 2: Maak een transfectie reactie met behulp van een transfection reagens keuze en zoals beschreven door de fabrikant.
- Bereid een voormengsel verpakking plasmiden met eindconcentraties van 250 ng / ul verpakken plasmiden 1 en 2 en 100 ng / ul voor het verpakken plasmide 3 in steriel water. Voeg 10 ul van de pakking plasmide voormengsel en 2,5 ug van het plasmide doel om 1 ml serumvrij medium gereduceerd in een 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem en de pipet op en neer te mengen. Voeg 20 ul van transfectie reagens in het midden van de buis rechtstreeks in de media.
- Schud voorzichtig te mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Verwijder ongeveer de helft van de media uit de cellen en voeg de transfectie mengsel in een druppelsgewijze manier. Schud voorzichtig te mengen en incuberen bij 37 ° C en 5% CO2. Incubeer 10 ml van media per plaat in een buis met de dop los voor temperatuur en CO 2 evenwicht brengen.
- Op Dag 3: Verander je media met gepreïncubeerd media en return de cellen naar de incubator. Incubate een andere buis van de media met de dop los.
Opmerking: syncytia of de vorming van grote multi-kernhoudende cellen, een teken dat het verpakkingsmateriaal zal worden. Cellen in een kwetsbare toestand en kan gemakkelijk worden losgemaakt. Ander materiaaltype, kantelt de pipet zodat deze horizontaal en voeg de media druppelsgewijs in een rand van de plaat. - Op dag 4: Oogst het virus door het verwijderen van de media met een spuit en filtreren door een 0,45 urn poriegrootte in een schone 50 ml buis. Vervang het medium voorzichtig met de vooraf geïncubeerd media.
- Op dag 5: Harvest weer zoals eerder gedaan in stap 1.5.3.3 en combineer gemeenschappelijke filtraat in dezelfde 50 ml buis. Voeg 6 ml van het virus concentrator aan elke buis en meng. Bewaar bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur totdat het virus precipitaten.
Opmerking: Afhankelijk van de gezondheid van de cellen, kan een virus 3 keer geoogst. - Concentreer het virus door centrifugeren bij 1500 xggedurende 15 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 pl medium. Virus kan direct worden gebruikt voor infectie of opgeslagen in 50 pi aliquots bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar.
- Plate ongeveer 3 x 10 5 U2OS (of doel) cellen per putje in een 6-wells plaat (2 ml DMEM met 10% FBS per putje) geïnfecteerd, zodat cellen ongeveer 50% confluent op het moment van infectie.
- De volgende dag, verwijder de helft van de media, zodat ongeveer 1 ml overblijft. Coinfect met 50 ul geconcentreerd virus voor elk construct. Voeg 1 ul polybreen (8 mg / ml) aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Wijzig de media de volgende dag en incubeer gedurende één dag voor antibiotische selectie.
Opmerking: De hoeveelheid virus te voegen kan variëren afhankelijk van de gewenste omvang van de besmetting. Virussen kunnen worden getitreerd met behulp van qRT-PCR. - Antibiotica toe te voegen om te selecteren voor geïnfecteerde cellen. Aparte putten met niet-geïnfecteerde cellen die niet hebben gezien virus dienen als kanaries om de werkzaamheid van de selectie te testen. Incubeer gedurende 2-7 dagen of totdat de selectie is voltooid.
Opmerking: Effectieve concentraties moet aanvankelijk worden getitreerd, maar zij typisch 1,0 ug / ml van puromycine en 1,0 mg / ml neomycine. - Uitbreiding van de cellen in een grotere 10 cm schotel en ga verder met Protocol 2.
- Bereid een voormengsel verpakking plasmiden met eindconcentraties van 250 ng / ul verpakken plasmiden 1 en 2 en 100 ng / ul voor het verpakken plasmide 3 in steriel water. Voeg 10 ul van de pakking plasmide voormengsel en 2,5 ug van het plasmide doel om 1 ml serumvrij medium gereduceerd in een 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem en de pipet op en neer te mengen. Voeg 20 ul van transfectie reagens in het midden van de buis rechtstreeks in de media.
2. Imaging Vaste Cellen
- Bereid een monster voor beeldvorming
- Reinig een 8-well 1,5 glazen onderste kamer schuif door toevoeging van 250 gl 1 M NaOH gedurende ten minste 1 uur en grondig wassen met PBS.
Opmerking: Onbehandelde kamer dia's doorgaans resulteren in hoge achtergrond signaal. Bovendien kunnen cellen gevoelig resterende NaOH en het niet het glasoppervlak grondig reinigen (liefst 10x wassen) kan celhechting moeilijk maken. Eventueel incubeer de gereinigde kamer dia met PBS O / N na het wassen. Voor gevoelige cellijnen, plating op een hogere dichtheid(Bijvoorbeeld op 50% -60% aanvankelijke samenvloeiing) kan helpen. - Plate ongeveer 5,5 x 10 4 van de U2OS stabiele expressie cellen per putje in 350 pl fenolrood-vrij DMEM met 10% FBS, zodat cellen gezond en niet meer confluent bij beeldvorming.
- Voer noodzakelijke behandelingen voor het experiment, zoals het toevoegen van tetracycline om eiwitexpressie te induceren.
- Bevestig de cellen onmiddellijk voor beeldvorming.
- Voorafgaand aan de fixatie, voor te bereiden verse paraformaldehyde (PFA) oplossing - 3,7% PFA in 1x PHEM met 0,1% glutaraldehyde (GA). Voor 10 ml PFA oplossing Weeg 0,37 g PFA en overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml gedestilleerd water en 30 gl 1 M NaOH en vortex. Verhit bij 70 ° C en vortex elke 1-2 min totdat PFA volledig is opgelost.
- Transfer opgelost PFA een 15 ml conische buis en voeg 3,8 ml gedestilleerd water, 5 ml 2 x PHEM-buffer, 20 pl 25% glutaaraldehyde en vortex mengen. Voorraad, 2x PHEM buffer 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA en 16 mM MgSO 4, met een pH bijgesteld tot 7,0 met 10 M KOH. Deze fixerende oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende enkele dagen.
LET OP: PFA en Georgië zijn allebei gevaarlijk. Bereid de oplossing in een zuurkast en draag de juiste beschermende uitrusting bij de omgang met beide chemicaliën. Vermijd inademing of direct contact met de huid. - Verwijder het groeimedium. Snel wassen met 500 pi PBS en voeg 250 ul van de PFA fixeermiddel per putje. Incubeer de cellen gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder de PFA fixeermiddel uit het monster en voeg 350 ul PBS of imaging buffer (100 mM Tris met 30 mM NaCl en 20 mM MgCl2, pH 8,5) per putje.
- Vortex 100 nm gouddeeltjes te breken aggregaten en voeg 35 ul per putje (10x de uiteindelijke verdunning) voor het volgen van het podium drift tijdens de beeldvorming.
- Reinig een 8-well 1,5 glazen onderste kamer schuif door toevoeging van 250 gl 1 M NaOH gedurende ten minste 1 uur en grondig wassen met PBS.
- Acquire beelden
- Schakel de microscoop. Macht op de 405 en 561 nm lasers, maar houd de luiken(intern of extern) gesloten op dit moment. Schakel de EMCCD camera en laat het afkoelen. Zorg ervoor dat de 561 nm filters op hun plaats zitten.
- Open de acquisitie software en stel de belichtingstijd tot 100 msec en de EMCCD winst tot 300 (bereik 1 - 1000).
- Voeg immersie olie aan het doel en zet het monster op de microscoop podium.
- Met ofwel helder veld of 561 nm laser op (~ 1 kW / cm2), breng het monster in focus.
- Voor het afbeelden van Ras en andere membraaneiwitten, gebruik dan een 60X Apochromat TIRF doelstelling met 1,49 numerieke opening en breng de microscoop in TIRF configuratie. Stel de excitatie laser, zodat deze off-gecentreerd bij het raken van de achterkant opening van de TIRF doelstelling; Dit zorgt ervoor dat de laser af te buigen bij het bereiken van het monster. Houd het instellen van de laser totdat de kritische hoek bereikt is en de laser wordt teruggekaatst. Zoeken naar een cel om afbeelding met meerdere gouddeeltjes in zicht. Stel een regio van belangdat omsluit de cel (of een gebied in de cel) en de gouddeeltjes.
Opmerking: TIRF vermindert de penetratie diepte van de excitatie laser en vermindert de achtergrond van de focus signaal. Daarnaast drift correctie waarschijnlijk nauwkeuriger worden wanneer gouddeeltjes in het zicht. - Indien beschikbaar, grijpen het autofocussysteem te corrigeren voor sample drift in de z-richting. Anders, de scherpstelling handmatig gedurende de overname als het beeld gaat onscherp.
- Begin verwerving met 405 nm laser uitgeschakeld en de 561 nm laser op (~ 1 kW / cm2) bij voldoende activatie reeds plaatsvindt (gewoonlijk als expressieniveaus zijn hoog). Anders, zet de 405 nm laser aan scherpe fabriek vermogensinstelling (0,02 mW of 0,01 W / cm 2) en geleidelijk te verhogen (0,1 mW per keer) als nodig tot er tientallen moleculen per frame of dat enkele moleculen zijn goed van elkaar gescheiden.
- Als data-acquisitie blijft, gradually verhogen 405 nm laservermogen naar de plek dichtheid ongeveer constant te houden.
Opmerking: Bij lagere 405 nm excitatie kracht, kunnen sommige PAmCherry1 al geactiveerd worden. Omdat deze moleculen photobleach de populatie van resterende licht activeerbare PAmCherry1 moleculen af, die een hogere foton flux dezelfde dichtheid moleculen emitteren fluorescentie in elk frame te behouden. - Doorgaan afbeelding verwerving tot 405 nm hoog vermogen (2,5-10 W / cm2) niet meer activering gebeurtenissen te activeren.
Opmerking: De totale acquisitietijd afhankelijk van het expressieniveau en de efficiëntie van de complementatie.
- Verwerk de afbeeldingen
Let op: Er zijn veel open source software-opties voor beeldverwerking. Voorbeelden zijn onweersbui (https://code.google.com/p/thunder-storm/) en QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). De typische procedures verwerking van gegevens worden hier kort toegelicht met behulp van een aangepaste Matlab pakket genaamd wfiread voor de verwerking van PALM data als voorbeeld. Echter, toekomstige herzieningen niet precies volgen wat hier beschreven. Voor beeldverwerking met andere software, verwijzen wij u naar de gebruiker documentatie.- Download de software voor beeldverwerking (Company Code File) of de laatste versie van http://www.ohsu.edu/nan. Open Matlab en laadt de wfiread software (die al wordt in het standaard pad).
- Bekijk het ruwe beeldsequentie en bepalen van de regio van belang. Selecteer het gebied van de stapel te verwerken door links te klikken en slepen van een kader rond het gewenste gebied. Als de regio van belang niet tijdens de acquisitie (tot ongeveer 256x256 pixels) werd gereduceerd, selecteert u een kleiner gebied op de compute tijd verminderen. Om een gebied te heffen en verwerkt het gehele frame, klik met de rechtermuisknop ergens in thimage e.
- Voer de reeks frames te verwerken.
- Selecteer een gouden deeltje (een die is geïsoleerd en uniform van vorm) door links te klikken op het beeld en het slepen van een kleine doos omheen. Onder Particle Tracking, klikt u op de Track-knop. Een grafiek weergegeven waarin de positie van de geselecteerde gouddeeltje over de stapel afbeeldingen toont, die de omvang van de drift.
- Herhaal dit proces zoveel gouddeeltjes mogelijk te kunnen volgen en bepalen degenen die samen een (de deeltjes wordt kleurcode). Idealiter zou de totale drift in de orde van één pixel maximaal.
- Selecteren individueel de gouddeeltjes die samen gevolgd één tegelijk en klik op de knop Add Marker onder Particle Tracking. Een groene kruis weergegeven dat aangeeft dat is toegevoegd als een merker en wordt gebruikt om te corrigeren voor drift.
- Pas de Sigma Range, Smoothing Range en Drempel zo nodig door het veranderen van de waarden iets. Klik op de Find Particleknop om de instellingen te testen. De deeltjes die worden verwerkt zal worden verpakt en die dat niet zijn zal worden weggelaten. De PAmCherry1 moleculen, deeltjes die vrij rond en helder moeten worden gekozen.
- Beginnen met het verwerken van de beelden door te klikken op de Make Coord knop Bestand en sla het bestand.
Opmerking: Het programma zal gaan door elk frame binnen de gedefinieerde kader range, vind alle fluorescerende vlekken, en het uitvoeren van Gauss passend bij het zwaartepunt coördinaten te vinden. Een .cor bestand wordt gegenereerd opslaan van alle coördinaten en andere passende parameters van de verwerkte enkel molecuul beelden.
- Post-proces imago van de PALM de beelden en maken
Opmerking: Andere software kan direct maken het beeld na het coördineren extractie.- In Matlab, start de 'palm' pakket en laad het .cor bestand zojuist hebt gemaakt.
- Voordat beeld PALM renderen met behulp van de coördinaten, afstand van de individuele coördinaten (elk een 'localizatiOp event '). De optimale sortering waarden kunnen variëren, afhankelijk van de installatie en fluorofoor.
- Voor PAmCherry1, gebruik dan de volgende waarden: Het combineren van Frame - 8; Het combineren Afstand (nm) - 100; Minimum RMS - 4; Minimum Fit Goodness - 0,25; en Max. Excentriciteit - 1.4. Zie de sectie Discussie voor bijkomende uitleg van deze parameters.
- Klik op de knop Sorteren om een nieuwe set coördinaten klaar voor het renderen van beelden met hoge resolutie te genereren.
- Voer waarden in voor de juiste weergave van de uiteindelijke beeld, zoals het ruwe pixelgrootte (nm), de gewenste functie grootte (nm) in het weergegeven beeld en de pixelgrootte van de gerenderde afbeelding.
Opmerking: De ruwe pixelgrootte moet worden bepaald voor elke installatie. De gesmolten feature size kan willekeurig worden ingesteld, maar wordt typisch ingesteld op een waarde iets hoger dan de gemiddelde lokalisatie nauwkeurigheid. Voor PAmCherry1, de gemiddelde lokalisatie precisie is ongeveer 18 nm, zodat een functie grootte van 20 - 30 nm is Aangepast decorte. Opmerkelijk was de lokalisatie nauwkeurigheid berekend door de standaardafwijking van de lokalisaties van hetzelfde molecuul meerdere frames 22 en niet door de diffractielimiet delen met de vierkantswortel van gedetecteerde aantal fotonen. Als voor de pixelgrootte van het weergegeven beeld, 10 nm is een goed uitgangspunt; het instellen van deze waarde te laag zal resulteren in onnodig grote beeldbestanden voor niet vergroot uitzicht. - Klik op de knop Render het imago van de PALM genereren. Gebruik de +/- vergrootglas pictogrammen in de werkbalk van de figuur-venster om in en uit te zoomen.
- Optioneel: Voer cluster analyse van de gereconstrueerde beeld Palm met behulp van Ripley's K-test of andere mechanismen zoals simulatie-aided DBSCAN (SAD) 23. Opmerking: In de aangepaste palm pakket, worden beide Ripley's K en SAD analyse reeds ingebouwd; als coördinaten gegenereerd uit andere software, kunnen dezelfde analyses worden uitgevoerd met aanvullende aangepaste scripts.
3. Single Molecule Tracking in levende cellen - Behandel de weefselkweek oppervlak en de plaat cellen zoals beschreven in protocol 2. Omdat de temperatuur en / of CO 2 gecontroleerde fase kan iets kweekschaal nodig, zorgen ervoor dat het dekglaasje over de juiste dikte (0,17 mm) voor microscopie setup.
- Transfecteren van cellen als het doen van een tijdelijke expressie en alle behandelingen die nodig zijn voor het experiment, zoals tetracycline om expressie te induceren voeren en incubeer nodig. Dit is hetzelfde als beschreven in protocol 2.
- Plaats de cultuur schotel op een on-stage incubator. Laat het gerecht vestigen op het podium voor een paar minuten tot de temperatuur en de CO 2 -concentratie elke keer te stabiliseren na de montage van de cultuur schotel of verhuizen naar een nieuwe regio van belang. Blok lasers bij deze stap. Als CO 2 is niet beschikbaar, veranderen in een CO 2 onafhankelijke media vlak voor beeldvorming, zoals LeibovItz's L-15.
Opmerking: Fenol-rood-vrij medium wordt aanbevolen voor deprimerende achtergrond fluorescentie.
- Acquire beelden zoals in protocol 2. Stel de juiste belichting tijd (meestal 25-50 msec voor PAmCherry1).
Opmerking: De molecule dichtheid moet lager zijn dan voor gefixeerde cellen zodat trajecten kunnen opgenomen worden zonder elkaar overlappen. De gespecificeerde enkele tientallen moleculen typisch is voor een 256x256 pixel verkrijgen met een resolutie van ongeveer 160 nm. De 561 nm laser vermogensdichtheid werd ingesteld op 0,8 kW / cm 2 een goede signaal-ruisverhouding behouden bij een lagere fototoxiciteit cellen en verhoging van de gemiddelde trajectlengte. - Verwerk de afbeeldingen.
- Extract coördinaten van enkele moleculen met de wfiread pakket zoals beschreven in Protocol 2, of met een ander pakket.
- Reconstrueren enkel deeltje trajecten met behulp van verschillende enkel deeltje volgen pakketten (SPT) op basis van verschillende algoritmes gevondenelders 24. Opmerking: Als alternatief kan deze stap worden uitgevoerd met behulp van zelfgebouwde Matlab-pakket (eventueel in toekomstige herzieningen op http://www.ohsu.edu/nan.
- Optioneel: Na de reconstructie, gebruik een SPT pakket 24 tot verplaatsing en diffusieconstanten berekenen op basis van de trajecten. Bovendien gebruiken variationele Bayes single-particle tracking (vbSPT) 25 diffusie staten van de doeleiwitten te bepalen. vbSPT Matlab-pakket en de documentatie is te vinden op de officiële website Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De BiFC-PALM getoonde voorbeeld is Kras G12D mutant interactie met de Ras-bindend domein (RBD) van craf (Figuur 1A). Zoals besproken werden de RN of RC fragmenten niet gelabeld aan de C-terminus van Ras omdat de membraanlokalisatie en dus de biologische activiteit van Ras zou verstoren. Dit verminderde de mogelijke combinaties 8-4 (Figuur 1B). Elk van deze vier combinaties werd ingebracht in cellen met behulp U2OS lentivirale infectie. De cellen werden vastgesteld zoals beschreven in het protocol en de BiFC signalen werden geëvalueerd met behulp van een PALM setup. Cellen met BiFC positieve signalen werden geïdentificeerd door de plotselinge toename in fluorescentie bij 405 nm van de laser is ingeschakeld; de 561 nm laser was gedurende het beeldvormende experiment. Deze abrupte verandering in fluorescentie als gevolg van de fotoactivering van BiFC-gereconstitueerde PAmCherry1 bij belichting met 405 nm laser. Meerdere gebieden van het monster werden geëvalueerd met behulp van deze benaderingEn het BiFC signaalintensiteit berekend door het gemiddelde van de toename pixel intensiteiten voor en na een krachtige puls van de 405 nm laser.
Zoals blijkt uit figuur 1C, van de vier mogelijke configuraties, twee configuraties (namelijk RN-Ras / Raf RC-RBD en RN-Ras / Raf RBD-RC) had sterke BiFC signalen. Een andere configuratie (RC-Ras / Raf RBD-RN) hadden zwak signaal, en men had geen signaal. Voor alle volgende experimenten werd het RN-Ras / Raf RBD-RC configuratie (rechtsboven in figuur 1C) gebruikt. Als negatieve controle werd een puntmutatie (R89L) in het Ras bindingsdomein van Raf geïntroduceerd en de BiFC efficiency met dezelfde configuratie getest. Deze mutatie werd bekend te verstoren Raf binding aan Ras; consequent, de mutatie sterk de BiFC signaal (figuur 1D) verminderd.
Sinds PAmCherry1 moleculen gegenereerd door middel BiFC toonde vergelijkbare fotoactivatie eigenschappen aan de oorspronkelijkePAmCherry1 10, dit zorgt voor PALM beeldvorming van BiFC monsters met dezelfde experimentele instellingen met de ouder PAmCherry1. Een voorbeeld PALM afbeelding van cellen met sterke BiFC signaal na infectie met RN-Ras en Raf RBD-RC is getoond in figuur 2A.
Bij inzoomen (figuur 2A linksonder en bijvoegsels met vergrote gebieden omkaderd), individuele moleculen en nanoschaal ruimtelijke verdeling duidelijk te zien. Van de nota, elk punt in deze PALM beelden vertegenwoordigt een vermeende Ras-Raf RBD complex gelabeld met een PAmCherry1 molecuul. Ter vergelijking, rechts in figuur 2B werd gesimuleerd lage resolutie beelden van hetzelfde gezichtsveld, waarbij de clusters volledig ondoorzichtig werd. De waarneming van Ras-Raf RBD clusters is in overeenstemming met eerdere opmerkingen over de clustering gedrag van Ras en Raf.
Met levende cellen die BiFC opgelost PAmCherry1, SMT-PALM was performed diffusie trajecten van individuele Ras-Raf RBD complexen te verkrijgen, vergelijkbaar met eerder beschreven 10. Onder continue belichting met 561 nm en 405 nm lasers, individuele PAmCherry1 moleculen stochastisch in- en duren een paar frames voordat donker staten (gedeeltelijk te wijten aan fotobleken). In deze periode vertoonde de moleculen ten minste twee verschillende diffusie gedragingen: onbeweeglijke toestand (figuur 2B, molecule 1) en een mobiele toestand (figuur 2B, molecule 2). Beide trajecten zijn duidelijk aanwezig in de (x, y) grafiek getoond in figuur 2C, waarbij de banen van meerdere moleculen zijn opgenomen. Dezelfde ongelijkmatige verdeling van diffusie toestanden kunnen worden afgeleid uit het histogram van moleculaire verplaatsing tussen opeenvolgende frames. Typisch, 10.000 - 100.000 diffusie trajecten kan worden verkregen van elke cel; dit grote aantal zorgt voor meer rigoureuze statistische analyse van tHij diffusie staten, bijvoorbeeld met de vbSPT algoritme 25.
Figuur 1. BiFC-PALM experimenteel ontwerp van Ras-Raf interactie. (A) Ras is een membraaneiwit dat Raf werft wanneer actief. Bij niet-fluorescerende split PAmCherry1 fragmenten verbonden Ras en Raf, de interactie brengt de fragmenten elkaar en complementatie optreedt, resulterend in een functioneel fluorescerend eiwit. (B) Aangezien tagging Ras aan zijn C-terminus zou zijn membraanlokalisatie verstoren, het aantal configuraties getest Ras-Raf-BiFC PALM teruggebracht 8-4. (C) Foto's van U2OS cellen die de geteste configuraties die met een TIRF microscoop. Om de BiFC efficiëntie van elke configuratie te meten, worden de cellen krijgen dezelfde hoge dosering van 405 nm licht, terwijlwordt enthousiast met 561 nm licht. (D) De invoering van de R89L mutatie in de Raf RBD sterk verminderd de BiFC signaal van de RN-KRAS G12D / craf RBD-RC configuratie (rechtsboven in C, n = 5-8). Foutbalken zijn SEM in (D). Schaalbalken in (C), 10 urn. RN = PAmCherry1 N-terminale fragment, RC = PAmCherry1 C-terminale fragment, en RBD = Ras-bindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. BiFC-PALM van U2OS cellen de RN-KRAS G12D / craf RBD-RC configuratie uitdrukken. (A) Een beeld hele PALM is hierboven weergegeven. Onderste panelen worden vergroot uitzicht op de boxed regio's in de bovenste afbeelding zoals aangegeven. Inzetstukken zijn hogervergrotingen van de boxed regio's in de respectieve vergrote uitzicht. De rechterzijde van de onderste panelen (gelabeld TIRF) zijn voorstellingen van de beelden op hun linker alsof genomen met een buigingsbegrensde microscoop. (B) opeenvolgende frames van een live-cell smt-PALM experiment dat langzaam (1) en snel (2) verplaatsen van Ras-Raf complexen verbeelden. (C) Uitvoer van een SMT PALM experiment toont diffusie trajecten van Ras-Raf complexen binnen een klein gebied van een cel. (D) Histogram van verplaatsingen per frame van Ras-Raf-complexen van een SMT-PALM experiment. Schaalbalken in (A), 5 urn bovenkant, onderkant 500 nm, 50 nm bijvoegsels, en (C), 1 micrometer. RN = PAmCherry1 N-terminale fragment, RC = PAmCherry1 C-terminale fragment, en RBD = Ras-bindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primer sequentie (5 'tot 3') | |
| Klonen plasmide voor het inbrengen bij N-terminus reverse | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN bij N-terminus forward | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC bij N-terminus forward | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Klonen plasmide voor het inbrengen in C-terminus forward | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN van de C-terminus omgekeerde | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC van de C-terminus omgekeerde | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabel 1. Primers voor lineariseren kloneringsplasmiden met PAmCherry1 fragmenten. De klonen plasmiden die RN en RC worden gelineariseerd met omgekeerde PCR op het invoegpunt op ofwel het N- of C-uiteinde van de fragmenten. Sequenties worden opgesomd 5 'to 3R17 ;.
| Overhangen voor interessante gen primers (5 'tot 3') | |
| N-terminaal inbrengen RN of RC vooruit | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminaal inbrengen RN omgekeerde | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminaal inbrengen RC omgekeerde | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminaal inbrengen RN forward | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminaal inbrengen RC forward | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminaal inbrengen RN of RC omgekeerde | GCGCCCACCCTTTTA |
Tabel 2. Overhangen voor gen van interesse primers die overeenkomen Tabel 1 primers. De 15 basenparen van homologie van de ligatie-onafhankelijke reactie wordt opgewektvan primer overhangen. Daarnaast heeft de overhangen bevatten de sequentie voor (GGGGS) x2 flexibele linker. De flexibele linkersequentie kan in plaats daarvan worden toegevoegd aan de primers in tabel 1. Sequenties worden opgesomd 5 'tot 3'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC is een veelgebruikte techniek voor het opsporen en visualiseren van PPI in cellen geweest, terwijl PALM is een recente single molecule superresolutiemicroscopie techniek die nanoschaal beeldvorming van intacte biologische monsters mogelijk maakt. De combinatie van BiFC met PALM bereikt selectieve beeldvorming van PPI's in een cel met nanometer ruimtelijke resolutie en single molecule gevoeligheid. BiFC-PALM breidt het nut van beide technieken, en zoals aangetoond in dit werk toont grote belofte in het openbaren van de moleculaire details van protonpompremmers in hun eigen cellulaire context. Vooral de nanometerresolutie maakt grondig onderzoek van de ruimtelijke en temporele regulering van bepaalde protonpompremmers op moleculaire schaal, die een uitdaging bij biomedisch onderzoek geweest. Echter, zoals eerder vermeld, is BiFC-PALM beperkt door de onomkeerbaarheid van de complementatie en trage chromofoor rijping.
Split PAmCherry1 werd gebruikt om het principe te tonen en utility van BiFC-PALM. PAmCherry1 is op grote schaal gebruikt in PALM experimenten om zijn uitstekende fotofysische eigenschappen. Een bijkomend voordeel van het gebruik PAmCherry1 als BiFC probe de lage achtergrond en een hoge specificiteit en efficiëntie eiwit reconstitutie bij 37 ° C wanneer gekoppeld aan PPI. Om deze redenen wordt de gespleten PAmCherry1 BiFC probe naar verwachting een waardevolle bron van toepassing op vele verschillende biologische onderzoeken met hoge resolutie beeldvorming van protonpompremmers worden. Naast PAmCherry1, een photoconvertible fluorescerend eiwit, mEos3.2, werd eveneens gesplitst voor BiFC-PALM 26. Omdat hun emissie spectra overlappen mEos3.2 en PAmCherry1 kunnen niet samen gebruikt, maar groen PA-KP zijn onlangs gemeld 27, zodat het mogelijk is om twee kleuren nanoschaal superresolutie beeldvorming van protonpompremmers.
Zoals bij conventionele BiFC, een cruciale stap in de uitvoering BiFC-PALM is het ontwerp en het klonen van de fusieconstructen. Dat upacht verschillende expressieconstructen moet gekloond en acht BiFC paren moet getest elke poging voeren BiFC en BiFC-PALM kan een vervelende, zo niet prohibitief, proces. Niettemin, zoals geïllustreerd in de Ras-Raf bijvoorbeeld voorkennis van de biochemische en structurele eigenschappen van de eiwitten van belang vaak worden gebruikt om een geoptimaliseerd ontwerp van het fusie constructen begeleiden met een verminderd aantal BiFC paren te testen. Dat gezegd hebbende, op dit moment is er geen universele richtlijn om ervoor te zorgen dat een BiFC (vandaar BiFC-PALM) experiment zou werken; veel van het is nog steeds een kunst.
Terwijl BiFC en BiFC-PALM worden gewoonlijk gebruikt om heterodimeervorming onderzoeken tussen twee eiwitten, is het ook mogelijk om homodimeer vormen met deze benaderingen, waarbij de twee kandidaat-eiwitten hetzelfde zou zijn bestuderen. Echter, als zodanig, twee eiwitten met hetzelfde fragment kan communiceren, maar niet tot BiFC signaal. Ondanks elk construct alseen competitieve inhibitor van de andere dergelijke interacties zijn omkeerbaar, terwijl interacties waardoor succesvolle complementatie zou accumuleren als gevolg van onomkeerbaarheid. In het algemeen kan een daling van het signaal als er een drastisch verschil tussen expressie van elk construct. Daarom kunnen de expressieniveaus van de twee constructen te worden vastgesteld bij het vergelijken van fluorescentie-intensiteiten (bijvoorbeeld tussen wild type en mutante homodimeer monsters) en endogene expressieniveaus. Dit is misschien de reden waarom BiFC experimenten vaak worden uitgevoerd met voorbijgaande transfecties en overexpressie van de constructen.
Last but not least, moeten alle BiFC experimenten worden bevestigd met de juiste controles. Als BiFC signaal aanwezig is, bestaat de kans dat het signaal niet-specifiek is (dat wil zeggen dat de fragmenten reconstrueren op hun eigen en niet vanwege de PPI). Een negatieve controle mutaties in één of beide eiwitten waarvan bekend isde interactie, wat moet leiden tot een aanzienlijk verlies van BiFC signaal verstoren. Als zo'n puntmutatie onbekend is, kunnen andere werkwijzen worden toegepast, zoals de invoering van een competitieve bindende partner aan een van de eiwitten en of er een gelijktijdige verlaging van signaal.
Hoe meer moeilijke situatie is het oplossen van een gebrek aan BiFC signaal, of valse negatieven. In zulke gevallen is het belangrijk om positieve controles tijdens het klonen, zoals een GFP controle tijdens transfecties omvatten. Western blots kunnen worden uitgevoerd om te controleren op expressie van de constructen. Indien deze factoren normaal mogelijk dat andere factoren worden veranderd, zoals de linker lengte en / of sequentie, of een andere configuratie BiFC worden overwogen.
Wat de PALM gedeelte moet een aantal parameters worden overwogen bij het verwerken van de beelden. Stap 2.4.2.1 beschrijft parameters die worden gebruikt voor het sorteren van de coördinaten en het uiteindelijke PALM genereren. De eerstetwee parameters, combineren Frame en combineren afstand, te definiëren als twee lokalisatie gebeurtenissen zowel binnen 100 nm en lijken minder dan 8 frames (100 msec / kader) of ~ 0,8 sec uit elkaar zoals we al eerder 23 beschreven. Zo ja, dan worden zij geacht afkomstig te zijn van hetzelfde molecuul, en hun coördinaten worden gecombineerd door het gemiddelde. Donkere staten met levens veel groter zijn dan 0,8 sec voor PAmCherry1 lijkt zeldzaam te zijn; als bij een fluorofoor herstellen van een langlevende donkere toestand te onderscheiden van een ander molecuul in een proximale afstand emitterende fluorescentie, worden twee lokalisatie events geacht voortkomt uit dezelfde molecule als zij verschenen binnen een bepaald aantal frames en fysieke afstand. Empirisch blijkt een instelling 'maaidorserframe bij 8-12 frames (0,8-1,2 sec) optimaal onder onze experimentele omstandigheden. Minimum RMS definieert de minimale verhouding tussen fitting amplitude en de standaarddeviatie residu lawaai nade fitting. Deze waarden worden opgeslagen in het bestand .cor tijdens coördineren extractie.
Samengevat BiFC-PALM combineert de voordelen van BiFC en PALM en maakt onderzoek van protonpompremmers in veel gedetailleerder dan eerder werd bereikt. Met overwegingen voor de bovengenoemde factoren en met de juiste controle-experimenten, moet BiFC-PALM een nuttig instrument voor het bestuderen van PPI's in een breed scala van biologische instellingen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
- Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
- Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
- Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
- Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
- Seidman, C. E., Struhl, K., et al. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D (2001).
- Morrison, S. L.
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
- Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
- Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).
