Introduction
Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind grundlegende Biologie 1 und dicht über Raum-Zeit-Mechanismen über viele Zeit- und Längenskalen geregelt. Untersuchungen an Zellsignal auf der Zellmembran beispielsweise mit dynamischen nanoskaliger Orts Kompartimente spezifischen PPI und zelluläre Prozesse 2 zu erleichtern enthüllt. Daher ist die Fähigkeit, die PPI in biologischen Systemen mit ausreichender räumlicher und zeitlicher Auflösung, hohe Spezifität und eine hohe Empfindlichkeit Sonde Schlüssel zu einem mechanistischen Verständnis der Biologie.
Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ist einer der wenigen vorhandenen Werkzeugen zur Visualisierung von PPI in einer Zelle mit subzellulärer Auflösung und Live-Zellverträglichkeit 3-5. Die Technik ist relativ einfach und erfordert Aufspaltung eines fluoreszierenden Proteins in zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente; wenn genetisch mit zwei interagierende Proteine markiert undin die Nähe gebracht wird, können die Fragmente zu rekonstituieren, um eine vollständige fluoreszierende Protein zu bilden, wodurch Fluoreszenzsignal. Wenn sie richtig entworfen, sollte BIFC Sonden nicht spontan Rekonstitution in Abwesenheit von PPI. Als solches wird das Fluoreszenz-Signal in einem BiFC Assay nur in Gegenwart von PPI, der die direkte Visualisierung von EPI mit hoher Spezifität ermöglicht auftreten. Zusätzliche Vorteile der Verwendung von Fluoreszenz als Auslese sind hohe Empfindlichkeit, subzelluläre Auflösung, und die Kompatibilität mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt Screening-Assays, unter anderem. Für diesen Vorteilen eine Reihe von BiFC Sonden basierend auf unterschiedlichen Mutter fluoreszierenden Proteinen entwickelt worden. Wie in allen anderen Detektionsverfahren auf der Basis konventioneller Lichtmikroskopie ist jedoch die räumliche Auflösung der BiFC auf ~ 250 nm durch die Beugung des Lichts begrenzt. Dies macht es eine Herausforderung für die Regulierung der PPI im Nanobereich, die, wie bereits angedeutet und durch Lipid Rafts 6 eine beispielhaft zu studierennd Ras Nanocluster 7, ist eine kritische Längenskala für das Verständnis vieler zellulärer Prozesse wie Signalisierung.
BIFC mit photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) 8,9 kombiniert, um diese Grenze der räumlichen Auflösung für die Abbildung PPI 10 zu überwinden. PALM ist eine neue Superresolution Mikroskopie-Technik, die die Beugungsgrenze in der Fluoreszenzbildgebung durch stochastische Aktivierung und subdiffractive Lokalisierung der einzelnen fluoreszierenden Molekülen umgeht. In jedem Aktivierungszyklus emittiert ein fluoreszierendes Molekül zu einigen tausend Photonen einige hundert und führt zu einem einzigen Molekül Bild auf dem Detektor. Während das Bild beugungsbegrenzt (~ 250 nm in der Breite), dessen Schwerpunkt mit einer wesentlich höheren Genauigkeit typischerweise in der Größenordnung von 10-50 nm in Abhängigkeit von der Anzahl der detektierten Photonen bestimmt werden. Durch Aktivieren und Lokalisieren jedes Fluoreszenzmolekül in der Probe kann eine hohe Bildauflösung zu rekonstruieren. Performed auf lebende Zellen, einzelnes Molekül Verfolgung (SMT-) PALM gestattet weiterhin Erwerb der Tausende von Proteindiffusionsbahnen von einer einzelnen Zelle 11. Wichtig ist, verwendet PALM Fachfluoreszenzsonden wie photoaktivierbare fluoreszierende Proteine (PA-RP), um stochastische Aktivierung zu erreichen. Da sowohl BIFC und PALM Verwendung fluoreszierender Proteine, werden sie durch die Spaltung von PAmCherry1, eine häufig verwendete PA-FP für PALM, in zwei Fragmente zwischen den Aminosäuren 159 und 160 zusammengefasst wurden.
Die BIFC System auf Basis von Split PAmCherry1 zeigt geringe Hintergrundsignal von spontanen Wiederherstellung der beiden Fragmente. Bei genetisch an ein Paar von interagierenden Proteinen markiert, die beiden Fragmente (RN = Reste 1-159; RC = Met + Reste 160-236) effizient rekonstituiert, um eine vollständige PAmCherry1 Proteine auch bei 37 ° C und ohne Inkubation bei niedrigeren Temperaturen zu bilden, die nicht der Fall für andere BiFC Paare 12 wie der Mutter mCherry 13. Furthermore, die rekonstituierte PAmCherry1 Protein behielt die photophysikalischen Eigenschaften der Mutter PAmCherry1 wie hohes Kontrastverhältnis, mittlere Photonenausbeute, und schnelle Photoaktivierung, unter anderem, die entscheidend für eine genaue Einzelmolekül-Lokalisierung und hochauflösende Bildgebung PALM sind.
In diesem Protokoll die Verwendung BiFC-PALM zum Abbilden Ras-Raf-Interaktionen in U2OS-Zellen unter Verwendung von geteilten PAmCherry1 (1A) beschrieben wird. Der erste Schritt besteht darin, die Konstrukte für die Expression von Fusionsproteinen zwischen PAmCherry1 Fragmente (dh, RN, RC) und die Proteine von Interesse zu entwerfen. Theoretisch für jedes Paar von Kandidatenproteinen (A und B) gibt es acht Paare von Fusionsproteinen getestet: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; und A-RC / B-RN. Dieser Prozess kann oft unter Berücksichtigung der strukturellen oder biochemischen Eigenschaften der Kandidatenproteine vereinfacht werden. Im Fall der Ras ist das Proteinpost-translational an dem C-terminal modifizierten CAAX-Box (C = Cys ist, A = aliphatische, X = beliebiger), wonach der AAX-Motiv abgespalten. Daher RN oder RC kann nur an den N-Terminus von Ras kondensiert sein kann; Dies reduziert die Anzahl der Fusionsprotein-Paare zu vier (1B). Für Raf, die Ras-Bindungsdomäne (RBD; Reste 51-131) verwendet und kann an beiden Enden versehen werden. Diese vier Fusionskonfigurationen generiert: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf-RBD RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; und RC-KRAS / Raf RBD-RN.
Zusätzlich wird der Linker zwischen den Fragmenten und den interessierenden Proteine zu berücksichtigen. Ein flexibler Linker von etwa zehn Aminosäuren wird häufig verwendet, da es eine ausreichende Freiheit für die Komplementierung auftreten. Einen solchen Linker (GGGGS) x2, obwohl es viele andere, die erfolgreich eingesetzt worden sind, einschließlich der Zufallsfolgen von einer multiplen Klonierungsstelle (MCS) 14 erzeugt wird. Die Länge der Linker können müssen dependin optimiertg von der Grße der interessierenden Proteine und ihre Orientierungen bei der Interaktion.
Die PAmCherry1 Fragmente werden in einem kleinen Klonen Backbone mit flankierenden MCSs enthalten (siehe Materialliste). Gene von Interesse kann über die Restriktionsschnittstellen oder einem ligationsunabhängiges Verfahren eingefügt werden. Nach der Klonierung und Sequenzüberprüfung wird die Expressionskassette ein Expressionsvektor unter Verwendung eines Rekombinase-Reaktion, ein Klonierungsverfahren mit hoher Genauigkeit und hoher Effizienz übertragen.
Als nächstes wurden die resultierenden Expressionskonstrukte werden in das Zielzelllinie oder zur Infektion der Zielzelle transfiziert, wenn eine stabile Zelllinie zu erzeugen, in Lentivirus verpackt. Transiente Transfektion ermöglicht eine schnelle Validierung der BIFC Konfigurationen, aber mögliche Probleme zu beachten. Transfektion unter Verwendung von Chemikalien oft betont, die Zellen, was zu hohen Eigenfluoreszenz; während die Verwendung von interner Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) microscopy können dieses Hintergrundsignal zu mildern durch Begrenzung der Beleuchtungsvolumen, TIRF ideal, wenn die PPI auf der Zellmembran statt. Zusätzlich transienten Transfektionen führen oft zu hohe Proteinexpressionsniveaus, die weit über denen der endogene Proteine, die Artefakte bei der Erfassung der PPIs verursachen können. Daher ist es empfehlenswert, dass stabile Zelllinien etabliert, nachdem ein geeigneter BiFC Konfiguration hat erste Test wurde bestimmt. Stabile Zelllinien haben auch das Potenzial für durchstimmbare Expression über Doxycyclin Induktions 15.
Nach der Infektion werden die Zellen mit Antibiotika ausgewählt, typischerweise Puromycin und Neomycin, eine für jedes Konstrukt. Die nachfolgenden Schritte für die Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenanalyse wird im Detail in den Protokollen beschrieben.
Mit diesem Ansatz werden die Bildung von Nanoclustern in BiFC-Handabdrücken von Ras-Raf RBD routinemßig beobachtet (2A </ strong>). Konsequent, smt-PALM Flugbahnen von Ras-Raf-RBD zeigen eine heterogene Verteilung der Diffusionszustände (2B-D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ras-Raf-Komplexe existieren in mehreren Staaten an der Zellmembran, vermutlich als Monomere und Clustern, mit möglichen biologischen Auswirkungen. Diese Arbeit zeigt die Macht der BIFC-PALM in selektiven Abbildung von PPI in Zellen mit Nanometer-Ortsauflösung und Einzelmolekül-Empfindlichkeit, die nur schwer mit herkömmlichen BIFC, Fluoreszenz-Co-Lokalisation, oder Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) erhalten würde.
Bei der Gestaltung BIFC Experimente und der Interpretation der Ergebnisse ist es wichtig zu beachten, dass die BIFC Vorgang ist irreversibel in den meisten Fällen, einschließlich Split PAmCherry1 halten. Sobald die beiden Fragmente kombiniert und bilden eine komplette PAmCherry1 Protein, die Bindung zwischen den beiden Fragmenten und damit die PPI permanent wird. Dies schränkt die Verwendung von BIFC und BIFC-PALM für die Überwachung der Dynamik der PPI (dh Bindungskinetik und nicht die Diffusion Dynamik des Proteinkomplexes, sobald sie gebildet ist) und manchmal sogar zu Fehllokalisation der PPI-Komplexe führen.
Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor bei der Gestaltung BIFC-PALM-Experimente ist die Verzögerung bei der Chromophor Reifung, die innewohnende fluoreszierende Proteine ist. Einmal zwei Proteine interagieren, und die FP-Fragmenten zusammenkommen, werden sie rückfalten typischerweise in der Größenordnung von Sekunden (Halbwertszeit von 60 sec für EYFP 3). , Anschließende Chromophor Reifung und Fluoreszenzsignal zu entwickeln jedoch in der Größenordnung von Minuten. Während Fluoreszenz nachweisbar innerhalb von 10 Minuten nach Rekonstitution des Split-Venus, einer schnell Falten YFP-Variante zu sein, ist die Halbwertszeit für die Reifung im Allgemeinen oft rund 60 min 16. Split-PAmCherry1 beobachtet ähnliche Preise haben. Daher BIFC und BIFC-PALM liegen noch schlechte Wahl für die Überwachung der Echtzeit-PPI-Kinetik; andere michthoden wie FRET und einem kürzlich entwickelten Dimerisierung abhängigen Fluoreszenzprotein 17 kann mehr für diesen Zweck geeignet sein.
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Protocol
1. Klonierung
- Bestimmen Sie die Konfigurationen zu klonen, und wählen Sie einen Linker. Tag-Proteine mit den Fragmenten auf der N- oder C-Terminus, wie unten beschrieben, so dass sie ihre eigentliche Lokalisation zu stören. Verwenden Sie einen flexiblen Linker, wie beispielsweise (GGGGS) x2.
- Genetisch markieren die Proteine von Interesse für die PAmCherry1 Fragmente. Als eine Option, verwenden Sie die in der Materialliste, die die Fragmente RN (PAmCherry1 Reste 1-159) und RC (Met zzgl PAmCherry1 Reste 160-236) mit flankierenden MCS-Sequenzen aufgeführt Klonierungsplasmide.
- Linearisieren die Plasmide, die die Fragmente RN und RC mit inverse PCR (oder Restriktionsverdau) an der Stelle der Insertion. Primer für die inverse PCR sind in Tabelle 1 aufgeführt. Unten ist ein im Labor des Autors verwendet, beispielsweise PCR-Protokoll (siehe Materialien Liste genau die Materialien in diesem Protokoll verwendet).
- Mischen Sie die PCR-Reaktion miteinander bis zu einem Endvolumen von 50 ul mit Wasser gebracht: zu einem dünnwandigened PCR-Röhrchen, fügen Sie das Wasser, 25 ul 2x Mastermix je 0,5 ul der Vorwärts- und Rückwärtsprimer (20 & mgr; M verdünnt Lager, 0,2 uM Endkonzentration) und 1 ng Matrizen. Mithilfe der folgenden Zyklusbedingungen: 98 ° C für 30 sec, 30 Zyklen bei 98 ° C für 7 Sekunden und 68 & deg; C für 2 min, und einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min.
- PCR der Gene von Interesse zur Insertion in den linearisierten Plasmiden, RN, RC Fragmente. Führen Sie die PCR, wie in Schritt 1.2.1 mit der Verlängerungszeit bei 68 ° C. Verwenden von Primern mit Überhängen, die eine flexible Linker-Sequenz enthalten, wie zum Beispiel für GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT (GGGGS) x2 und 15 Basenpaarhomologie zu den Enden des linearisi RN, RC Plasmide zur Rekombination.
Anmerkung: Die Primer Hängen für die interessierenden Proteine sind in Tabelle 2, wenn unter Verwendung der Primer in Tabelle 1, um das Plasmidrückgrat linearisiert dargestellt. - Verdauen die PCRReaktion mit Dpn1 um die PCR-Matrize zu entfernen. Mit 0,5 ul Dpn1 (20 U / ul), die direkt auf die 50 & mgr; l PCR-Reaktion. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h und Wärme Inaktivierung bei 80 ° C für 20 min. Wenn Hintergrund-Vorlage besteht in späteren Schritten, erhöhen Sie die Enzymmenge oder verlängern die Aufschlusszeit.
- Aufreinigung der PCR-Produkte über eine Spin-Säule wie vom Hersteller beschrieben.
- Führen eine Ligierung unabhängiger Reaktion zur Bildung einer linearisierten Plasmids, enthaltend ein RN oder RC-Fragment mit dem Gen von Interesse zu verbinden. Messung der Konzentration der gereinigten PCR-Produkte: Kombinieren 50 ng linearisierte Plasmid und 50 ng des Gens von Interesse mit 1 ul Enzymvormischung und bringt das Gesamtvolumen auf 5 & mgr; l mit entionisiertem Wasser. Inkubation bei 50 ° C für 15 min, auf Eis, und fügen Sie 20 ul TE-Puffer.
- Transform rekombinanten Plasmide in kompetente Bakterien 18.
- Wählen Sie 2-4 + (nach Wunsch) Kolonien für O / N-Kultur. 5 mlLB-Brühe und 5 ul Kanamycin (50 mg / ml Stamm) in einem 14 ml Polypropylen-Rundrohr, und fügen Sie die ausgewählten Bakterienkolonie mit einer Impföse sterilisiert. Bei 37 ° CO / N unter Schütteln bei 225 Umdrehungen pro Minute.
- Gefriert 1 ml O / N-Kultur für Glycerinstamm 19 und Miniprep den Rest als vom Hersteller beschrieben.
- Führen Sequenzierung, um eine gute Klon zu bestimmen. Wenn mit Hilfe der Klonierungsplasmide in der Materialliste, verwenden M13 Vorwärts- und Rückwärtsprimer (in getrennten Reaktionen) als notwendig, um die vollständige Sequenz des Fusionskonstrukt zu erhalten. Vergleichen Sie mit der erwarteten Sequenz unter Verwendung eines Ausrichtungswerkzeug wie BLAST aus dem National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Übertragen Sie die Sequenz-verifiziert Konstrukte, um ein Expressionsplasmid über eine Rekombinase Reaktion.
- In 75 ng der Ziel-Plasmid & #8212; wie pcDNA für transiente Transfektionen oder pLenti für lentiviralen Verpackungs 20 - und 50 ng des rekombinanten Klonen Plasmid zu 1 ul Enzymvormischung und rufen Sie das Gesamtvolumen auf 5 & mgr; l mit entionisiertem Wasser. Inkubation bei 25 ° C für 1 Stunde, dann fügen Sie 5 ul TE-Puffer.
Anmerkung: Für lentiviralen Verpackungs und stabile Zellinie Generation verwenden ein anderes Ziel Plasmid für jedes Konstrukt, beispielsweise ein mit Puromycin-Resistenz und das andere Neomycin. Dies ermöglicht eine doppelte Auswahl an transduzierten Zellen. Auch an die Promotor für jede wie die konstitutiven Cytomegalovirus (CMV) Promotor für hohe Expressionsniveaus oder CMV mit TetO Operator für abstimmbare Doxycyclin-regulierten Expression. - Verwandeln Sie 5 ul in kompetente Bakterien und Miniprep die Plasmide wie in den Schritten 1.2.6 bis 1.2.8, aber mit dem entsprechenden Antibiotikum (typischerweise Ampicillin).
- In 75 ng der Ziel-Plasmid & #8212; wie pcDNA für transiente Transfektionen oder pLenti für lentiviralen Verpackungs 20 - und 50 ng des rekombinanten Klonen Plasmid zu 1 ul Enzymvormischung und rufen Sie das Gesamtvolumen auf 5 & mgr; l mit entionisiertem Wasser. Inkubation bei 25 ° C für 1 Stunde, dann fügen Sie 5 ul TE-Puffer.
- Linearisieren die Plasmide, die die Fragmente RN und RC mit inverse PCR (oder Restriktionsverdau) an der Stelle der Insertion. Primer für die inverse PCR sind in Tabelle 1 aufgeführt. Unten ist ein im Labor des Autors verwendet, beispielsweise PCR-Protokoll (siehe Materialien Liste genau die Materialien in diesem Protokoll verwendet).
- Bestimmen Sie die optimaleBIFC Konfiguration.
- Co-Transfektion von Expressionsplasmiden in U2OS-Zellen (oder Zelle der Wahl).
- Fügen Sie 350 ul der Phenolrot-frei und antibiotikafreies DMEM mit 10% FBS in jede Vertiefung einer 8-well # 1.5 Glasbodenkammer Rutsche. Platte etwa 7,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung so Zellen sind etwa 70% bis 90% konfluent waren am nächsten Tag.
- Am Tag nach der Plattierung, Co-Transfektion von Expressionsplasmiden mit unterschiedlichen Konfigurationen in jeder Vertiefung unter Verwendung der bevorzugten Reagens und, wie vom Hersteller beschrieben.
- Für jeden gut, fügen Sie 125 ng jedes Expressionsplasmids in 50 ul Serum-freien reduziert Medien in einer 0,6-ml-Röhrchen und Pipette auf und ab zu mischen. 1 ul des Transfektionsreagenz in der Mitte des Rohres und direkt in die Medien. Man schüttelt sanft zu mischen und lassen Sie die Reaktion zu sitzen für 30 Minuten.
- Reduzieren Sie die Medien in jeder Vertiefung der Kammerschieber um etwa die Hälfte. Fügen Sie das Transfektionsgemisch tropfenweise in die Vertiefungen und schütteln gständig zu mischen. Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24-48 Std. Ändern Sie den Medien am Tag nach der Transfektion.
- Bildzellen auf einem Fluoreszenzmikroskop, wie in Protokoll 2 beginnend mit Schritt 2.1.4.
Anmerkung: Die Probe kann auf einem Standard-Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden, wenn die Expressionsniveaus hoch sind und die Kamera ist empfindlich genug, um die relativ niedrige Ausgang PAmCherry1 Photon. Rekonstituierte PAmCherry1 Moleküle können mit einem UV-Filter-Set (405 nm) vor dem mit einem grünen Anregung (561 nm) Filtersatz Abbilden aktiviert werden.
- Co-Transfektion von Expressionsplasmiden in U2OS-Zellen (oder Zelle der Wahl).
- Gegebenenfalls ein Negativ Kontrolle durch beispielsweise die Einführung einer Punktmutation in einem der Proteine von Interesse, die die Wechselwirkung stört. Durchführen einer ortsgerichteten Mutagenese 21 auf dem Klonierungsplasmid des Proteins zu mutierenden und der gewählten Konfiguration.
- Generieren Sie eine stabile Zelllinie durch Verpacken der Konstrukte in viralePartikel und infizieren U2OS-Zellen (oder Zelllinie der Wahl). Betrachten Sie einen induzierbaren (Tetracyclin) Expressionssystem 15, so kann die Expression vor induziert, um die Abbildung, wenn längerer Unumkehrbarkeit BIFC ist ein Thema, oder wenn abstimmbaren Expression gewünscht werden.
ACHTUNG: Arbeiten mit Viren als Biosafety Level 2 eingestuft Während den letzten Generationen von Virusverpackungssysteme haben erheblich die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von replikationskompetenten Viren reduziert, gibt einige Risiken noch vorhanden ist. Referenzen finden Sie unter http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.- Wiederholen Sie Schritt 1.2.10 mit einem Lenti- oder retroviralen Zielvektor 20. Erhöhen Sie die O / N-Kultur auf 100 ml für eine Midiprep und größere Reinheit der Plasmide.
- An Tag 1: Platte etwa 2 × 10 6 293T / 17-Zellen in eine 10 cm-Schale für jedes Konstrukt zu verpackenden.
- Am Tag 2: Bereiten Sie eine Transfektion Reaktion unter Verwendung eines transfection Reagens der Wahl und wie durch den Hersteller beschrieben.
- Vorbereitung einer Vormischung aus Verpackungs Plasmide mit Endkonzentrationen von 250 ng / ul für die Verpackung von Plasmiden 1 und 2 und 100 ng / ul für Verpackungsplasmid 3 in sterilem Wasser. Zugabe von 10 ul des Verpackungs Plasmid Vormischung und 2,5 ug des Zielplasmid zu 1 ml Serum-freien Medien reduziert in einem 5 ml-Polypropylen-Rundrohr und Pipette auf und ab, um zu mischen. Mit 20 ul Transfektionsreagenz in der Mitte des Rohres und direkt in die Medien.
- Man schüttelt sanft zu mischen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 30 min. Entfernen Sie etwa die Hälfte der Medien aus den Zellen und fügen Sie das Transfektionsgemisch tropfenweise. Vorsichtig schütteln zu mischen und bei 37 ° C und 5% CO 2. Inkubieren 10 ml Medium pro Platte in einem Röhrchen mit Kappe für Temperatur und CO 2 Äquilibrierung gelockert.
- Am Tag 3: die Medien mit den vorinkubierten Medien ändern und retur Gentlyn den Zellen in den Inkubator. Inkubieren Sie ein anderes Rohr von Medien mit der Kappe gelockert.
Anmerkung: Syncytien, oder die Bildung von großen Multi-kernhaltigen Zellen, kann ein Zeichen, dass die Verpackung läuft gut sein. Allerdings sind Zellen, die in einem fragilen Zustand und kann leicht abgenommen werden. Beim Wechsel Medien, neigen Sie die Pipette, so dass sie horizontal liegt und fügen Sie den Medientropfenweise in einem Rand der Platte. - Am Tag 4: Ernte des Virus durch Entfernen der Medien mit einer Spritze und Filtrieren durch ein 0,45 um Porengrße-Filter in ein sauberes 50-ml-Röhrchen. Gently ersetzen Sie die Medien mit den vorinkubierten Medien.
- Am Tag 5: Ernte wieder wie zuvor in Schritt 1.5.3.3 durchgeführt und kombinieren gemeinsamen Filtrat in den gleichen 50-ml-Tube. 6 ml Virus Konzentrators zu jedem Röhrchen zugeben und mischen. Lagerung bei 4 ° C für mindestens 24 Stunden, bis die Viren Niederschläge.
Hinweis: Je nach der Gesundheit der Zellen können Virus ein drittes Mal geerntet werden. - Konzentrieren des Virus durch Zentrifugieren bei 1.500 xgfür 15 min bei 4 ° C. Saugt den Überstand und das Pellet in 250 ul Medium. Virus kann sofort zur Infektion verwendet werden oder in 50 & mgr; l Aliquots bei -80 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden.
- Platte etwa 3 x 10 5 U2OS (oder Ziel) Zellen pro Vertiefung in eine Platte mit 6 Vertiefungen (2 ml DMEM mit 10% FBS pro Mulde) für eine Infektion, so Zellen etwa 50% konfluent waren zum Zeitpunkt der Infektion.
- Am folgenden Tag, entfernen Sie etwa die Hälfte der Medien so ca. 1 ml verbleibt. Coinfect mit 50 ul konzentrierte Virus für jedes Konstrukt. 1 ul Polybren (8 mg / ml) in jede Vertiefung. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Medien am nächsten Tag und Inkubation für einen Tag, bevor Antibiotika-Selektion.
Anmerkung: Die Menge an Virus zu addieren kann abhängig von der gewünschten Rate der Infektion variieren. Viren können mit qRT-PCR titriert werden. - In Antibiotika für infizierte Zellen auszuwählen. Separate Vertiefungen mit nicht infizierten Zellen, die nicht gesehen haben virus benötigt, wie Kanarienvögel die Wirksamkeit der Auswahl, um zu testen. Inkubation für 2-7 Tage, oder bis Auswahl abgeschlossen ist.
Hinweis: Wirksame Konzentrationen sollten anfänglich titriert werden, aber sie sind typischerweise 1,0 & mgr; g / ml Puromycin und 1,0 mg / ml Neomycin. - Erweitern Sie die Zellen in einen größeren 10 cm Teller und fahren Sie mit Protokoll 2.
- Vorbereitung einer Vormischung aus Verpackungs Plasmide mit Endkonzentrationen von 250 ng / ul für die Verpackung von Plasmiden 1 und 2 und 100 ng / ul für Verpackungsplasmid 3 in sterilem Wasser. Zugabe von 10 ul des Verpackungs Plasmid Vormischung und 2,5 ug des Zielplasmid zu 1 ml Serum-freien Medien reduziert in einem 5 ml-Polypropylen-Rundrohr und Pipette auf und ab, um zu mischen. Mit 20 ul Transfektionsreagenz in der Mitte des Rohres und direkt in die Medien.
2. Imaging fixierten Zellen
- Bereiten Sie eine Probe für die Bildgebung
- Reinigen Sie eine 8-well # 1.5 Glasbodenkammer Schieber durch Zugabe von 250 ul 1 M NaOH für mindestens 1 h und gründlich mit PBS.
Hinweis: Unbehandelte Kammer-Objektträgern in der Regel in der hohen Hintergrundsignal führen. Zusätzlich können Zellen empfindlich auf Rest NaOH und Miss gründlich zu reinigen die Glasoberfläche (so viele wie 10x Waschanlagen) kann Zelladhäsion schwierig machen. Falls erforderlich, Inkubation der gereinigten Kammer Objektträger mit PBS O / N nach dem Waschen. Für empfindliche Zelllinien, Überzug mit einer höheren Dichte(Beispielsweise bei 50% -60% Anfangs Konfluenz) kann helfen. - Platte etwa 5,5 x 10 4 der U2OS stabile Expression Zellen pro Vertiefung in 350 & mgr; l Phenolrot-freiem DMEM mit 10% FBS, so daß gesunde Zellen nicht über konfluente bei der Abbildung sind.
- Aufgrund erforderlicher Behandlungen für das Experiment, wie das Hinzufügen von Tetracyclin um die Proteinexpression zu induzieren.
- Befestigen Sie die Zellen unmittelbar vor der Bildgebung.
- Vor der Fixierung, bereiten Sie frisches Paraformaldehyd (PFA) Lösung - 3,7% PFA in 1x PHEM mit 0,1% Glutaraldehyd (GA). Für 10 ml PFA-Lösung, wiegt 0,37 g PFA und Transfer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser und 30 ul 1 M NaOH und vortexen. Hitze bei 70 ° C und Wirbel alle 1-2 min bis PFA vollständig gelöst ist.
- Transfer gelöst PFA zu einem 15 ml konischen Röhrchen und fügen Sie 3,8 ml destilliertes Wasser, 5 ml 2x PHEM Puffer, 20 ul 25% Glutaraldehyd und Wirbel zu mischen. Lizenz ist 2x PHEM Puffer 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, und 16 mM MgSO 4, mit pH-Wert mit 10 M KOH auf 7,0 eingestellt. Diese Fixierungslösung können bei 4 ° C für mehrere Tage gelagert werden.
ACHTUNG: PFA und GA sind beide gefährlich. Bereiten Sie die Lösung in einem Abzug und tragen Sie geeignete Schutzausrüstung beim Umgang mit beiden Chemikalien. Einatmen oder direktem Hautkontakt vermeiden. - Entfernen Sie das Wachstumsmedium. Schnell Waschen mit 500 ul PBS und fügen Sie 250 ul der PFA Fixiermittel pro Vertiefung. Inkubieren der Zellen für 20 min bei RT.
- Entfernen des PFA Fixiermittel von der Probe und mit 350 ul PBS oder Imaging-Puffer (100 mM Tris mit 30 mM NaCl und 20 mM MgCl 2, pH 8,5) pro Mulde.
- Vortex 100 nm Goldpartikeln Aggregate zu zerstören, und fügen Sie 35 ul pro Vertiefung (10x Endverdünnung) für die Verfolgung der Bühne Drift während der Bildgebung.
- Reinigen Sie eine 8-well # 1.5 Glasbodenkammer Schieber durch Zugabe von 250 ul 1 M NaOH für mindestens 1 h und gründlich mit PBS.
- Bilder erwerben
- Schalten Sie das Mikroskop. Schalten Sie die 405 und 561 nm-Laser, aber halten die Fensterläden(intern oder extern) verschlossen ist an dieser Stelle. Schalten Sie das EMCCD Kamera und lassen Sie ihn abkühlen. Stellen Sie sicher, die 561 nm-Filter sind an Ort und Stelle.
- Öffnen Sie die Erfassungssoftware und stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms und die EMCCD Gewinn auf 300 (Bereich 1 - 1.000).
- In Immersionsöl auf die objektive und sichern Sie die Probe auf den Mikroskoptisch.
- Entweder mit Hellfeld oder der 561-nm-Laser auf (ca. 1 kW / cm 2), bringen die Probe in den Fokus.
- Zum Abbilden Ras und andere Membranproteine, mit einem 60X Apochromat TIRF Ziel mit 1,49 numerischer Apertur und bringen Sie das Mikroskop in die TIRF-Konfiguration. Stellen Sie die Anregungslaser, so dass es außermittig, wenn Schlagen der Rückseite Apertur des TIRF Ziel ist; dies bewirkt, dass der Laser bei Erreichen der Probe abzulenken. Halten des Lasers anpassen, bis der kritische Winkel erreicht wird, und der Laser wird wieder reflektiert. Suchen Sie nach einer Zelle, die dem Bild mit mehreren Goldpartikel im Blick. Legen Sie einen Bereich von Interessedaß umschließt die Zelle (oder eine Region innerhalb der Zelle) und der Goldpartikel.
Hinweis: TIRF verringert sich die Eindringtiefe des Anregungslasers und reduziert den Hintergrund unscharf Signal. Zusätzlich ist die Driftkorrektur wahrscheinlich genauer zu sein, wenn mehr Goldpartikel sind in der Ansicht. - Falls verfügbar, greifen die Autofokus-System für Probendrift in der z-Richtung zu korrigieren. Andernfalls manuelle Scharfeinstellung vor der gesamten Akquisition, wenn das Bild wird unscharf.
- Beginnen Sie Erwerb mit der 405-nm-Laser ab und die 561-nm-Laser auf (ca. 1 kW / cm 2) für den Fall, ausreichende Aktivierung ist bereits vorkommenden (in der Regel, wenn die Expressionsniveaus hoch sind). Ansonsten schalten Sie den 405-nm-Laser auf dem niedrigsten Werksleistungseinstellung (0,02 mW bzw. 0,01 W / cm 2) und erhöhen Sie nach und nach (0,1 mW auf einmal) wie nötig, bis es gibt mehrere Dutzend Moleküle pro Frame oder so, dass einzelne Moleküle gut getrennt sind.
- Da die Datenerfassung weiter, gradually erhöhen 405 nm Laserleistung, um den Spotdichte etwa konstant zu halten.
Hinweis: Bei niedrigeren 405 nm Erregerleistung können einige PAmCherry1 bereits aktiviert werden. Da diese Moleküle photobleach, die Bevölkerung der übrigen photoaktivierbare PAmCherry1 Moleküle ab, die eine höhere Durchfluss Photonen, die gleiche Dichte der Moleküle emittieren Fluoreszenz in jedem Rahmen zu halten. - Weiter Bilderfassung bis 405 nm hoher Leistung (2,5 bis 10 W / cm 2) nicht mehr Aktivierungsereignisse zu aktivieren.
Hinweis: Die Gesamtaufnahmezeit ist abhängig von der Expressionsniveau und die Effizienz der Komplementation.
- Verarbeiten die Bilder
Hinweis: Es gibt viele Open-Source-Software-Optionen für die Bildverarbeitung. Beispiele sind Gewitter (https://code.google.com/p/thunder-storm/) und QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Die typischen Datenverarbeitungsverfahren werden hier kurz mit einem benutzerdefinierten Matlab-Paket namens wfiread für die Verarbeitung von PALM Daten als ein Beispiel veranschaulicht. Jedoch können künftige Änderungen nicht genau folgen, was wird hier beschrieben. Für die Bildverarbeitung mit anderer Software finden Sie in den Benutzer Dokumentationen beziehen.- Laden Sie die Bildverarbeitungssoftware (Supplemental-Code-Datei) oder die aktuelle Version auf http://www.ohsu.edu/nan. Öffnen Sie Matlab und laden Sie das wfiread-Software (die bereits in der Standardpfad gesetzt wird).
- Sehen Sie sich die rohen Bildfolge und bestimmen den Bereich von Interesse. Wählen Sie den Bereich des Stapels durch einen Linksklick und Ziehen Sie einen Rahmen um den gewünschten Bereich bearbeitet werden. Wenn die Region von Interesse wurde nicht während der Erfassung (bis etwa 256x256 Pixel) reduziert wird, wählen Sie eine kleinere Fläche, um die Rechenzeit zu verringern. Um einen Bereich deaktivieren und verarbeitet den gesamten Rahmen, direkt auf eine beliebige Stelle in the Bild.
- Geben Sie den Bereich von Frames verarbeitet werden.
- Wählen Sie ein Goldpartikel (eine, die isoliert und einheitlich in der Form) mit einem Linksklick auf das Bild und ziehen Sie eine kleine Box um ihn herum. Unter Particle Tracking, klicken Sie auf die Schaltfläche Status. Eine Kurve wird angezeigt, daß die Position der ausgewählten Goldpartikel über den Stapel von Bildern zeigt, das das Ausmaß der Drift.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, um so viele Goldpartikel wie möglich verfolgen und bestimmen Sie diejenigen, die gemeinsam zu verfolgen (die Partikel werden farbcodiert). Idealerweise ist die Gesamtdrift in der Grßenordnung von einem Pixel bei den meisten.
- Einzeln auswählen die Goldpartikel, die zusammen ein zu einer Zeit verfolgt und klicken Sie auf die Schaltfläche Add Marker unter Particle Tracking. Ein grünes Kreuz erscheint bedeutet, dass sie als Marker aufgenommen worden und werden verwendet, um die Drift zu korrigieren.
- Stellen Sie die Sigma Range, Glättung Bereich und Threshold nach Bedarf durch Ändern der Werte geringfügig. Klicken Sie auf die Suche Particleum die Einstellungen zu testen. Die Partikel, die verarbeitet werden, werden verpackt werden und diejenigen, die nicht weggelassen werden wird. Die PAmCherry1 Moleküle, Partikel, die relativ rund und hell sind, sollten ausgewählt werden.
- Starten Sie die Verarbeitung der Bilder durch Klicken auf die Schaltfläche 'Jetzt Coord Datei und speichern Sie die Datei.
Hinweis: Das Programm wird über jeden Rahmen innerhalb des definierten Bildbereich zu gehen, finden Sie alle Fluoreszenzpunkte, und führen Gaußsche Anpassung, um die Schwerpunktkoordinaten zu finden. Ein .cor Datei speichert alle Koordinaten und andere Anpassungsparameter der verarbeiteten Einzelmolekül-Bilder erzeugt werden.
- Post-Prozess die Bilder und machen das PALM Bild
Hinweis: Andere Software kann direkt rendern das Bild nach der Koordinaten Extraktion.- In Matlab, starten Sie die "Palme" Paket und laden Sie die Datei .cor gerade erstellt haben.
- Vor dem Rendern der Palme unter Verwendung der Koordinaten, sortieren Sie die einzelnen Koordinaten (jeweils von einem 'localizatiam Ereignis "). Die optimalen Sortier Werte können je nach Aufbau und Fluorophore variieren.
- Für PAmCherry1, verwenden Sie die folgenden Werte: Die Kombination Frame - 8; Die Kombination Entfernung (nm) - 100; Mindest RMS - 4; Mindest Fit Güte - 0,25; und Max. Exzentrizität - 1.4. Siehe die Diskussion Abschnitt für zusätzliche Erklärung dieser Parameter.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Sortieren, um einen neuen Satz von Koordinaten bereit für die Wiedergabe hochauflösende Bilder zu erzeugen.
- Werte für die ordnungsgemäße Erbringung der endgültige Bild Geben Sie wie dem rohen Pixelgröße (nm), die gewünschte Strukturgröße (nm) im gerenderten Bild, und der Pixelgröße für den gerenderten Bild.
Hinweis: Die rohen Pixelgröße muss für jedes Setup bestimmt werden. Die gerenderten Strukturgröße kann beliebig eingestellt werden, jedoch wird in der Regel bei einem Wert etwas höher als die durchschnittliche Lokalisierungsgenauigkeit eingestellt. Für PAmCherry1 ist die mittlere Lokalisierungspräzision etwa 18 nm, so dass eine Strukturgröße von 20 - 30 nm ist? Fallte. Bemerkenswerterweise wurde die Lokalisierungsgenauigkeit, indem die Standardabweichung der Lokalisierungen des gleichen Moleküls über mehrere Rahmen 22 und nicht durch Teilung der Beugungsgrenze mit der Quadratwurzel der erfassten Anzahl der Photonen berechnet. Wie für die Pixelgröße des gerenderten Bild ist 10 nm ein guter Ausgangspunkt; Setzen Sie diesen Wert zu niedrig, wird unnötig große Bilddateien für nicht vergrößerte Ansichten führen. - Klicken Sie auf den Render-Taste, um die PALM Bild zu erzeugen. Verwenden Sie die +/- Vergrößerungs Symbole in der Werkzeugleiste der Figur Fenster, um zu vergrößern oder verkleinern.
- Optional: Führen Sie die Clusteranalyse des rekonstruierten PALM Bild entweder Ripleys K-Test oder andere Mechanismen wie simulationsgestützte DBSCAN (SAD) 23. Hinweis: In der benutzerdefinierten palm-Paket sind sowohl Ripleys K und SAD-Analyse bereits eingebaut; für Koordinaten von anderen Software erzeugt wird, können die gleichen Analysen mit zusätzlichen benutzerdefinierten Skripts ausgeführt werden.
3. Single Molecule Tracking-in lebenden Zellen - Behandeln Sie den Gewebekulturfläche und die Platte, die Zellen wie im Protokoll 2. Da die Temperatur und / oder CO 2 gesteuert Stufe beschrieben, kann eine gewisse Kulturschale, sicherzustellen, dass das Deckglas sicher, über die entsprechende Dicke (0,17 mm) für die Mikroskopie-Setup.
- Transfektion von Zellen, wenn dadurch eine vorübergehende Expression und nimmt alle Behandlungen für das Experiment erforderlich ist, wie Tetracyclin, um die Expression zu induzieren, und Inkubieren nach Bedarf. Dies ist ebenfalls die gleiche wie in Protokoll 2 beschrieben.
- Legen Sie die Kulturschale auf einem auf der Bühne Inkubator. Lassen Sie die Schale auf der Bühne niederzulassen für ein paar Minuten, bis die Temperatur und CO2-Konzentration zu stabilisieren jedes Mal nach der Montage der Kulturschale oder Umzug in eine neue Region von Interesse. Block Laser bei diesem Schritt. Wenn CO 2 Steuerung nicht verfügbar ist, zu einer CO 2 unabhängige Medien direkt vor Bildgebung, wie Leibov ändernitz der L-15.
Hinweis: Phenol-Rot-freies Medium für deprimierenden Hintergrundfluoreszenz zu empfehlen.
- Bilder zu erfassen, wie in Protokoll 2. Setzen Sie jedoch eine geeignete Belichtungszeit (in der Regel 25 bis 50 ms für PAmCherry1).
Anmerkung: Die Moleküldichte muss kleiner sein als für die fixierten Zellen, so dass Trajektorien können, ohne einander zu überlappen aufgezeichnet. Die genannten einigen zehn Molekülen ist typisch für ein 256x256 Pixelerfassung bei einer Pixelgröße von etwa 160 nm. Die 561 nm Laserleistungsdichte auf 0,8 kW / cm 2 eingestellt, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, während eine Verringerung der Phototoxizität, um Zellen und Erhöhung der durchschnittlichen Trajektorie Länge. - Verarbeiten Sie die Bilder.
- Auszug Koordinaten einzelner Moleküle mit dem wfiread Packung nach Protokoll 2, oder mit einem anderen Paket beschrieben.
- Rekonstruieren Einzelpartikelbahnen unter Verwendung verschiedener Einzelpartikelverfolgung (SPT) Pakete basierend auf verschiedenen Algorithmen gefundenan anderer Stelle 24. Hinweis: Alternativ können Sie diesen Schritt mit Haus gebaut Matlab-Paket (möglicherweise in zukünftigen Revisionen an erreicht werden http://www.ohsu.edu/nan.
- Optional: Nach der Rekonstruktion, verwenden Sie eine SPT-Paket 24, um eine Verschiebung und Diffusionskonstanten von den Flugbahnen berechnen. Darüber hinaus verwenden Variations Bayes Einzelpartikelverfolgung (vbSPT) 25 bis Diffusionszustände der Zielproteine zu bestimmen. : vbSPT Matlab-Paket und Dokumentation kann bei seiner offiziellen Sourceforge-Website gefunden werden http://vbspt.sourceforge.net/.
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Representative Results
Das gezeigte BIFC-PALM Beispiel ist KRAS-mutierten G12D Interaktion mit den Ras-Bindungsdomäne (RBD) von Craf (Abbildung 1A). Wie diskutiert, wurden die RN oder RC-Fragmente nicht an den C-Terminus von Ras markiert, weil es die Membranlokalisierung und daher die biologische Aktivität von Ras unterbrechen. Dies reduziert die möglichen Kombinationen von acht auf vier (1B). Jede dieser vier Kombinationen wurde in U2OS-Zellen unter Verwendung von lentiviralen Infektion eingeführt. Die Zellen wurden fixiert, wie im Protokoll aufgeführt und die BIFC Signale wurden mit einem PALM-Setup ausgewertet. Zellen mit positiven BIFC Signale wurden durch die abrupte Anstieg der Fluoreszenz identifiziert, wenn die 405-nm-Laser eingeschaltet wurde; die 561-nm-Laser war auf der gesamten Imaging-Experiments. Diese abrupte Änderung in der Fluoreszenz ist durch die Photoaktivierung von BiFC rekonstituierten PAmCherry1 bei Beleuchtung mit der 405 nm-Lasers. Mehrere Regionen in der Probe wurden mit diesem Ansatz bewertetUnd die BiFC Signalintensität wurde durch Mittelung der Zunahme der Pixelintensitäten vor und nach einem Hochleistungsimpulses von der 405-nm-Laser ermittelt.
Wie in 1C zu sehen ist, aus den vier möglichen Konfigurationen, zwei Konfigurationen (nämlich RN-Ras / RC-Raf RBD und RN-Ras / Raf RBD-RC) hatten starke BIFC Signale. Eine weitere Konfiguration (RC-Ras / Raf-RBD RN) hatte schwaches Signal, und man kein Signal hatten. Bei allen nachfolgenden Experimenten wurde die RN-Ras / Raf-RBD RC-Konfiguration (oben rechts in Figur 1C) verwendet wird. Als Negativkontrolle wurde eine Punktmutation (R89L) in der Ras-Bindungsdomäne von Raf eingeführt und die BiFC Effizienz unter Verwendung der gleichen Konfiguration wurde getestet. Diese Mutation wurde bekannt, zu stören Raf-Bindung an Ras; konsequent, die BIFC Signal (1D) stark reduziert die Mutation.
Seit über BIFC erzeugt PAmCherry1 Moleküle zeigten ähnliche Photo Objekte, die dem Original-PAmCherry1 10 ermöglicht dies PALM Bildgebung BiFC Proben unter Verwendung der gleichen experimentellen Bedingungen wie bei der Mutter PAmCherry1. Ein Beispiel PALM Bild der Zellen mit starker BiFC Signal nach einer Infektion mit RN-Ras und Raf-RBD RC ist in 2A gezeigt.
Wenn gezoomt (2A links unten und -einsätze, mit vergrößerten Bereichen boxed), einzelne Moleküle und ihre räumliche Verteilung im Nanobereich ist deutlich zu erkennen. Zu beachten ist, jeder Punkt in diesen PALM Bilder stellt eine putative Ras-Raf-RBD-Komplex mit einem PAmCherry1 Molekül markiert. Zum Vergleich wurde die rechte Seite der Figur 2B Bildern mit niedriger Auflösung aus den gleichen Sichtfelder, in denen die Cluster wurde vollständig verdecken simuliert. Die Beobachtung von Ras-Raf-RBD-Cluster steht im Einklang mit früheren Beobachtungen über die Clustering-Verhalten von Ras und Raf.
Mit Live-exprimierenden Zellen BIFC rekonstituiert PAmCherry1, smt-PALM war perfoRMED diffusions Trajektorien einzelner Ras-Raf RBD-Komplexe erhalten, ähnlich wie zuvor beschrieben 10. Unter kontinuierlicher Beleuchtung mit 561 nm und 405 nm Laser, einzelne Moleküle PAmCherry1 stochastisch einschalten und halten ein paar Bilder vor dem Eintritt in Dunkelzustände (zum Teil auf Photobleaching). In diesem Zeitraum werden die Moleküle zeigten mindestens zwei unterschiedlichen Diffusionsverhalten: einen unbeweglichen Zustand (2B molecule 1) und einen beweglichen Zustand (2B Molekül 2). Beide Arten von Flugbahnen in der (x, y) in 2C, wobei die Bahnen von mehreren Molekülen aufgezeichnet gezeigt Parzelle deutlich vorhanden. Die gleiche heterogene Verteilung der Diffusionszustände können aus dem Histogramm von Molekülverschiebung zwischen aufeinanderfolgenden Bildern abgeleitet werden. Typischerweise 10.000 - 100.000 Diffusions können Trajektorien aus jeder Zelle erworben werden; Diese Vielzahl ermöglicht strengere statistische Analyse der ter Diffusion Zustände, beispielsweise mit dem vbSPT Algorithmus 25.
Abbildung 1. BIFC-PALM experimentellen Design von Ras-Raf-Wechselwirkung. (A) Ras ist ein membrangebundenes Protein, das Raf rekrutiert, wenn aktiv. Wenn nicht fluoreszierenden Spalt PAmCherry1 Fragmente an Ras und Raf angebracht ist, die Wechselwirkung bringt die Fragmente zusammen und Komplementation auftritt, was in einer funktionellen Fluoreszenzprotein. (B) Da Tagging Ras an seinem C-Terminus würde seine Membranlokalisierung zu stören, wurde die Anzahl von Konfigurationen für die Ras-Raf-BiFC PALM getestet von acht auf vier reduziert. (C) Bilder von U2OS Zellen, die die getesteten Konfigurationen mit TIRF-Mikroskop aufgenommen. Um die BIFC Effizienz der einzelnen Konfigurations abzuschätzen, werden die Zellen die gleiche hohe Dosierung von 405 nm Licht, während gegebenmit 561 nm Licht angeregt. (D) Einführung in das R89L Mutation in das Raf RBD die BIFC Signal des RN KRAS-G12D / Craf RBD-RC-Konfiguration stark reduziert (oben rechts in C, n = 5-8). Fehlerbalken sind SEM-in (D). Maßstabsbalken in (C), 10 & mgr; m. RN = PAmCherry1 N-terminale Fragment, R = PAmCherry1 C-terminale Fragment und RBD = Ras-Bindungsdomäne. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. BIFC-PALM von U2OS-Zellen die RN-KRAS G12D / Craf RBD-RC-Konfiguration zum Ausdruck. (A) ein ganzes Bild PALM ist oben dargestellt. Unteren Platten sind vergrößerte Ansichten der boxed Regionen im oberen Bild, wie angegeben. Einsätzen höherVergrößerungen der boxed Regionen in den jeweiligen vergrößerte Ansichten. Die rechte Seite der unteren Platte (bezeichnet TIRF) sind Darstellungen der Bilder auf ihrer linken Seite wie mit einem beugungsbegrenzten Mikroskop aufgenommen. (B) aufeinander folgenden Rahmen aus einer lebenden Zelle smt-PALM-Experiment, die langsam (1) und schnell (2) bewegen Ras-Raf-Komplexe darstellen. (C), das von einem SMT-PALM Experiments, Diffusions Trajektorien Ras-Raf-Komplexe in einem kleinen Bereich der Zelle. (D) Histogramm von Verschiebungen pro Rahmen des Ras-Raf-Komplexe aus einem SMT-PALM-Experiment. Maßstabsbalken in (A), 5 & mgr; m-Top, 500 nm unten, 50 nm-Einsätze, und (C), 1 & mgr; m. RN = PAmCherry1 N-terminale Fragment, R = PAmCherry1 C-terminale Fragment und RBD = Ras-Bindungsdomäne. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Primer Sequenz (5 'bis 3') | |
| Klonen Plasmid zur Insertion in N-Terminus Rückwärts | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN am N-Terminus nach vorne | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC am N-Terminus nach vorne | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Klonen Plasmid zur Insertion am C-Terminus nach vorne | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN aus C-Terminus Rückwärts | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC vom C-Terminus Rückwärts | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabelle 1. Primer zur Linearisierung Klonierungsplasmide enthalten PAmCherry1 Fragmenten. Die Klonierungsplasmide RN, RC enthält, kann mit inverser PCR an der Stelle der Insertion entweder am N- oder C-Terminus der Fragmente linearisiert werden. Sequenzen werden 3R aufgeführten 5 '17 ;.
| Überhängen für das interessierende Gen-Primer (5 'nach 3') | |
| N-terminale Insertion RN oder RC vorne | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminale Insertion RN Rückwärts | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminale Insertion RC Rückwärts | ACTTCCACCTCCACCACTACCTCCACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminale Insertion RN vorne | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminale Insertion RC vorne | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminale Insertion RN oder RC Rückwärts | GCGCCCACCCTTTTA |
Tabelle 2. Überhängen für interessierende Gen-Primer, die Tabelle 1 Primer entsprechen. Die 15 Basenpaare der Homologie für die Ligation-unabhängigen Reaktion erzeugtvon Primer Überhänge. Zusätzlich können die Überhänge umfassen die Sequenz für ein (GGGGS) x2 flexible Linker. Der flexible Linker-Sequenz kann der Primer in Tabelle 1 anstelle zugesetzt werden. Sequenzen aufgelistet sind von 5 'nach 3'.
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Discussion
BiFC hat eine allgemein verwendete Technik zur Erfassung und Visualisierung PPIs in Zellen, während PALM ist ein neues einzelnes Molekül Auflösungs Mikroskopietechnik, die nanoskalige Abbildungs intakter biologischer Proben ermöglicht. Die Kombination von BIFC mit PALM erreicht selektiven Abbildung von PPI in einer Zelle mit Nanometer-Ortsauflösung und Einzelmolekülempfindlichkeit. BIFC-PALM erweitert den Nutzen der beiden Techniken, und wie in dieser Arbeit gezeigt, ist äußerst viel versprechend bei der Aufdeckung der molekularen Details von PPI in ihrem nativen zellulären Kontext. Insbesondere ermöglicht die detaillierte Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Regulierung der spezifischen PPI auf molekularer Ebene, die eine Herausforderung für die biomedizinische Forschung hat sich die Nanometer-Auflösung. Aber wie bereits erwähnt, BIFC-PALM wird von der Unumkehrbarkeit der Komplementierung und langsam Chromophorbildung begrenzt.
Split PAmCherry1 wurde verwendet, um das Prinzip zu demonstrieren und utz der BIFC-PALM. PAmCherry1 wurde häufig in Experimenten PALM für seine ausgezeichnete photophysikalischen Eigenschaften verwendet. Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung von PAmCherry1 als BIFC Sonde ist die niedrige Hintergrund und eine hohe Spezifität und Effizienz der Protein Rekonstitution bei 37 ° C, wenn sie PPIs gekoppelt. Aus diesen Gründen wird die Spaltung PAmCherry1 BIFC Sonde erwartet, eine wertvolle Ressource für viele verschiedene biologische Untersuchungen, die hochauflösende Bildgebung von PPI zu werden. Neben PAmCherry1, einem Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein, mEos3.2, wurde auch für BIFC-PALM 26 aufgeteilt. Weil ihre Emissionsspektren überlappen, kann mEos3.2 und PAmCherry1 nicht zusammen verwendet werden, aber grün PA-FPs wurden kürzlich berichtet, 27, Eröffnung der Möglichkeit für zweifarbige nanoskaligen Superresolution Imaging von PPI.
Wie bei herkömmlichen BiFC ein kritischer Schritt bei der Implementierung BiFC Palm ist die Konstruktion und das Klonieren der Fusionskonstrukte. Die Tatsache, dass sichzu acht verschiedene Expressionskonstrukte müssen geklont werden und acht BIFC Paare müssen in jedem Versuch, zu implementieren und BIFC BIFC-PALM kann eine mühsame, wenn nicht unerschwinglich, Prozesses getestet werden. Dennoch, wie in den Ras-Raf dargestellten Beispiel können Vorkenntnisse über die biochemischen und strukturellen Eigenschaften der interessierenden Proteine oft verwendet, um eine optimierte Konstruktion der Fusionskonstrukte mit einer reduzierten Anzahl von BiFC Paare zu prüfenden leiten. Das heißt, derzeit gibt es keine universelle Richtlinie, um sicherzustellen, dass ein BIFC (daher BIFC-PALM) Experiment funktionieren würde; vieles davon ist noch eine Kunst.
Während BiFC und BiFC-PALM werden typischerweise zur Heterodimerbildung zwischen zwei Proteinen zu untersuchen, ist es auch denkbar, die Homodimerbildung Verwendung dieser Ansätze, wobei die zwei Kandidatenproteine wären dieselben zu untersuchen. Jedoch als solche zwei Proteine mit dem gleichen Fragment interagieren kann, nicht aber in BiFC Signals. Trotz jedes Konstrukt als amtierenderein kompetitiver Inhibitor zu den anderen, solche Wechselwirkungen reversibel sind, während die Wechselwirkungen, die zu erfolgreichen Ergänzung wäre aufgrund der Irreversibilität akkumulieren. Im Allgemeinen könnte es eine Verringerung der Signal sein, wenn es einen drastischen Unterschied zwischen Expressionsniveaus von jedem Konstrukt. Daher muss die Expressionsniveaus der beiden Konstrukte beim Vergleich von Fluoreszenzintensitäten (zB zwischen Wildtyp und Mutante Homodimer Proben) zu endogenen Expressionsniveaus zu bestimmen. Dies ist vielleicht, warum BiFC Experimente werden gewöhnlich mit transienten Transfektionen und Überexpression der Konstrukte durchgeführt.
Und nicht zuletzt müssen alle BIFC Experimente mit entsprechenden Kontrollen bestätigt werden. Wenn BiFC Signal vorhanden ist, gibt es eine Chance, dass das Signal nicht-spezifische (dh werden die Fragmente auf ihre eigenen Wiederherstellung und wegen der PPI). Eine negative Kontrolle ist Mutationen in einem oder beiden Proteinen, die bekannt sind,die Wechselwirkung, was zu einem erheblichen Verlust an BiFC Signals führen sollte stören. Wenn eine solche Punktmutation nicht bekannt ist, können auch andere Verfahren verwendet werden, wie die Einführung eines kompetitiven Bindungspartner zu einem der Proteine und zu sehen, ob es eine begleitende Abnahme des Signals.
Die schwierigere Situation der Behebung eines Mangels an BIFC Signal oder falsch negative Ergebnisse. In solchen Fällen ist es wichtig, die positive Kontrollen während des Kopiervorgangs wie beispielsweise eine GFP Steuerung während Transfektionen enthalten. Western-Blots ausführen können, um die Expression der Konstrukte zu überprüfen. Wenn diese Faktoren normal sind, müssen möglicherweise andere Faktoren geändert werden, wie zum Beispiel die Linker-Länge und / oder Sequenz oder eine andere BiFC Konfiguration in Betracht gezogen werden.
Wie für die Handflächenabschnitt, muss eine Reihe von Parametern berücksichtigt werden, wenn die Verarbeitung der Bilder ist. Schritt 2.4.2.1 beschreibt die Parameter für die Sortierung der Koordinaten und die Erzeugung des endgültigen Bildes PALM verwendet. Der Erstezwei Parameter, die Kombination von Rahmen und die Kombination Entfernung, zu definieren, wenn zwei Lokalisierungs Ereignisse sind beide innerhalb von 100 nm und erscheinen weniger als 8 Frames (bei 100 ms / frame) oder ~ 0,8 sec auseinander, wie wir zuvor 23 beschrieben. Wenn ja, dann werden sie in Betracht gezogen werden, um von dem gleichen Molekül auftreten, und deren Koordinaten werden durch Mitteln kombiniert werden. Dunkelzustände mit Lebensdauern viel größer als 0,8 sec für PAmCherry1 scheint selten zu sein; das Ereignis eines Fluorophors der Genesung von einer langlebigen Dunkelzustand nicht von einem anderen Molekül zu einem proximalen Abstand Fluoreszenz emittiert werden zwei Lokalisierungs Ereignisse betrachtet, von dem gleichen Molekül, die sich nur dann, wenn sie innerhalb einer bestimmten Anzahl von Frames erschienen und physische Distanz. Empirisch, erscheint ein 'kombinieren frame' Einstellung bei 8-12 Rahmen (0,8-1,2 sec) unter unseren experimentellen Bedingungen optimal. Minimale effektive definiert das minimale Verhältnis zwischen Fitting Amplitude und der Standardabweichung der Rückstand Rauschen nachdie Armatur. Diese Werte werden in der .cor Datei während der Koordinatenextraktions aufgezeichnet.
Zusammenfassend kombiniert BIFC-PALM die Vorteile BIFC und PALM und ermöglicht Untersuchungen von PPI bei sehr viel näher als das, was bisher erreicht wurde. Mit Überlegungen zu den Faktoren, die oben und mit der richtigen Kontrollexperimenten sollte BIFC-PALM ein nützliches Werkzeug für das Studium PPI in einer breiten Palette von biologischen Einstellungen sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope frame | Nikon | Ti-U | |
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm laser | Coherent | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25x36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
References
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