Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Måling TCR-pMHC Binding Published: October 30, 2015 doi: 10.3791/53157
Automatic Translation
1, 1, 2
1Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, 2Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

Introduction

Et mere grundlæggende forståelse af, hvordan T-celler genkender antigener kræver ser på det rigtige sted, det vil sige inden for den immunologiske synapse dannet mellem T-cellen og APC. Her bliver molekylære bindende kinetik ikke kun bestemt af de iboende biokemiske egenskaber af interaktion involverede partnere, men afhænger i vid udstrækning af cellulære parametre, herunder cellulære kræfter, membran arkitektur og laterale interaktioner mellem membranproteiner samt synapse-specifikke geometriske begrænsninger 3. Biokemiske metoder er begrænset i opløsningsevne da de nødvendiggør afbrydelse af mindst en af ​​de synaptiske membraner, der er involveret. Af denne grund et FRET-baseret imaging metode blev udviklet til at overvåge binding af TCR til antigene pMHCs 2. Her T-celler er dekoreret med en rekombinant og site-specifikt mærket TCRβ-reaktivt enkelt kæde antistoffragment (SCF V) og konfronteret med planen AR glas-understøttet lipiddobbeltlag (SLBs), som huser MHC klasse II-molekyler fyldt med en fluorescens-mærket antigen peptid, costimulerende molekyler og adhæsion proteiner. Synaptic binding mellem farvestof-mærket TCR og farvestof-mærket pMHC resultater i FRET, som kan overvåges på en bulk og enkelt molekyle niveau ved total intern refleksion Fluorescens (TIRF) mikroskopi.

I denne artikel er det forklaret i detaljer, hvordan man udnytter SLBs til analysering T-celle synapser, verificere deres integritet gennem en funktionel T-celle calcium-flux assay, adfærd FRET målinger i bulk og med enkelt molekyle følsomhed, og analysere de indsamlede data. Anbefalinger udbydes til at producere ordentligt var i overensstemmelse proteiner, der kræves for dobbeltlag funktionalisering. For mere specifik information om dobbeltlagsformation og opsætning af en egnet TIRF mikroskop henvises til en ekstra offentlig adgang JOVE publikation udgivet ryg mod ryg 4.

telt "> Nature of SLBs

Funktionaliserbare SLBs kan let genereres ud fra unilamellare vesikler (SUV'er), der indeholder de to lipider 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-phosphocholin (kort: POPC, 90-99%) og 1,2-dioleoyl- sn - glycero-3 - {[N (5-amino-1-carboxypentyl) -iminodieddikesyre] succinyl} (kort: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUV'er spredt på rene objektglas til at danne en sammenhængende plan dobbeltlag 4. DGS-NTA-Ni tjener til at forankre polyhistidin-mærkede proteiner via polyhistidin-medieret kompleks-dannelse med den syntetiske NTA-Ni-holdige hovedgruppe (figur 1A). For stabil associering man erstatter typisk det native transmembrane domæne og den cytoplasmatiske hale af adhæsionsproteinet ICAM-1 og costimulerende molekyle B7-1 med en tag indeholder tolv histidiner (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) (figur 1B) . Peptid-belastet klasse II-molekyle IE k indeholder to membran-embedded (α og β) polypeptidkædes. De transmembrane / cytoplasmatiske domæner af begge kæder skal udskiftes med et mærke, der indeholder seks histidiner hver (IE k α 6H β 6H eller IE k -2x6H). Som et alternativ, udvidelse af α-kæde med tolv histidiner og forlader det ekstracellulære domæne af β-kæden umærket (giver anledning til IE k α 12H β 0H eller IE k -12H) giver anledning til tilfredsstillende resultater (figur 1B).

Site-specifik mærkning af pMHCs

Det er vigtigt at mærke pMHC støkiometrisk og stedspecifikt med henblik på at kunne konvertere målt FRET udbytter i meningsfulde ligevægtsbindingskonstanter. Dette kan opnås ved kemisk mærkning af et syntetisk peptid, der er indlæst i peptidbindende kløft af rekombinant histidin-mærket MHC klasse II-molekyler 2,5. Peptidet omfatter alle rester af T-celle-epitop som well som en kort C-terminale linker (GGS) efterfulgt af cystein (fx i møl cytochrom c (MCC) peptid ANERADLIAYLKQATK- GGSC linkeren er markeret med fed). Denne cystein anvendes til at mærke peptidet støkiometrisk med anvendelse af maleimid-dye derivater. På dette tidspunkt ekstra pleje bør afsættes til en kontrol af kvantitativ dye-kobling til cystein-holdige peptid. HPLC-oprensning af peptid-farvestof addukt anbefales og skal følges ved elektrospray ioniseringsmassespektroskopi. Eventuelle optagede masser, der svarer til peptidet edukt (uden farvestof) afspejler ufuldstændig mærkning. Hvis dette er sandt, skal HPLC-oprenset peptid underkastes på hinanden følgende runder af farvestof-mærkning indtil mærkning anses kvantitativt. Bemærk, at MALDI-TOF massespektroskopi bør undgås, da denne metode involverer laserstråling for prøve ionisering. Denne behandling opløses vedlagte følsomme fluoroforer før peptidmasse udlæses og dermed underrepre terer grader af farvestof-konjugering.

Indirekte endnu stedspecifik mærkning af cellebundne TCR'er med anvendelse af monovalente enkeltkædede Fv-fragmenter

Det er stadig en udfordring at knytte farvestoffer til celleoverflade-associerede proteiner af levende celler i en stedspecifik måde. For at overvinde denne forhindring for overfladeeksponerede TCR'er, har en monovalent enkelt kæde udgave (SCF V) fra generne af TCRβ reaktivt monoklonalt antistof H57-197 2 blevet konstrueret. Krystalstrukturen af ​​dette antistof i kompleks med TCR tillader rationelt at designe en version, hvor en serinrest i umiddelbar nærhed af den C-terminale ende af MHC-associerede peptid (hvor den tilsvarende FRET-partner farvestof er fastgjort) er substitueret for en cysteinrest. Denne mutant cystein derefter fungerer som en acceptor for farvestof konjugation (figur 2).

Metoder til at optage FRET

nt "> Bulk FRET værdier er bedst egnet til at kontrollere forholdet mellem udvalgte inter-dye afstande og FRET effektivitet målt i denne TCR-pMHC bindende systemet 2. Desuden bulk-FRET målinger afslører kvalitative og kvantitative forskelle i synaptiske TCR-pMHC tilhørsforhold ( se nedenfor og protokol afsnit 3.2). Forskellige metoder til kvantificering FRET effektivitet er blevet indført i litteraturen 6. I denne artikel FRET registreres via

(a) donor bedring efter acceptor blegning, og via

(b) sensibiliserede FRET acceptor emission.

Den første metode (a) kræver brug af et FRET-acceptor, der let kan Lysblegede og en donor, som er temmelig fotostabile. Desuden er det vigtigt at sikre, at Lysblegede acceptor ikke længere er i stand til standsning af donorfluorescensen. Da den samme afsløring kanal (donor) anvendes til kvantificering, ingen korrektionsfaktorer end ingen kromatisk aberration skal overvejes, hvilket gør denne metode enkel og pålidelig. Dog kan kvantitative målinger ikke gentages på samme prøve stedet og kan ikke optages ændringer i FRET over tid. For at undgå virkninger forårsaget af molekylær diffusion eller cellulære motilitet et hurtigt blegning skridt bør være rettet til, hvilket minimerer den tid der går mellem det første FRET donor (før acceptor blegning) og den anden FRET donor billedoptagelse (efter FRET acceptor blegning). Det anbefales at anvende en kraftig laser lyskilde af FRET acceptor excitationsbølgelængde for at minimere belysning og blegning gange.

I modsætning hertil i tilgangen til måling sensibiliseret FRET emission (b) FRET donor er spændt og observeres emissionen af ​​FRET acceptor i FRET acceptor kanal. Ændringer i FRET acceptor signal kan registreres over tid, men emissionen af ​​FRET donor i rødforskudt acceptor kanal (termed bleedthrough) og FRET acceptor cross-excitation via donor excitation skal nøjagtigt bestemmes og trækkes fra den indspillede FRET acceptor-kanal. Til dette de tilsvarende FRET donor og FRET acceptor billeder skal rumligt linie.

Påvisning af enkelt molekyle (sm) FRET begivenheder

Med brugen af ​​lasere som excitationskilde, et følsomt kamera og støj svækkede TIRF mikroskopi fluorescensen af ​​enkelte fluoroforer kan let spores over tid. Tilsvarende gælder for påvisning af intermolekylære smFRET begivenheder. Dog kan komplikationer være forårsaget af FRET donor bleedthrough og på tværs af excitation af FRET acceptor, og dermed stor omhu skal tages ved justering fluoroforen tætheder i smFRET eksperimentet.

I den protokol nedenfor (protokol afsnit 4) TCR blev valgt som FRET donor i high overflod og pMHC som FRET acceptor i lav overflod. For at dæmpe FRET donor bleedthrough tilstrækkeligt, dekorere 10-30% af TCR'er med fluorescerende sCF V og 90-70% af TCR'er med ikke-fluorescerende sCF V. Her blev FRET acceptor kanal valgt som enkelt molekyle kanal, fordi det er konfokal med enkelt molekyle FRET kanal. Dette medvirker til at tilpasse smFRET begivenheder med enkelt molekyle FRET acceptorer, hvilket er grundlaget for smFRET validering.

Udpakning synaptiske off-satser gennem smFRET målinger

Fotoblegning af både FRET donor og FRET acceptor skal regnskabsmæssigt når udvinding halveringstiden af ​​interaktioner fra enkelt molekyle FRET spor. Antallet af observerbare FRET-signaler i begyndelsen af deres udseende som enkelt donor-acceptor parret N (0) reduceres over tid ved begge uforpligtende af receptoren-ligand kompleks og fotoblegning. Antallet af overlevende komplekser på et givet tidspunkt N (t) kan matematisk udtrykkes som følger:

I fotoblegning sigt exp (-t / τ blegemiddel) tiden t beskrives som produktet af antallet af observationer n og belysningstiden t syge på grund af den ikke-kontinuerlige, diskret observation tilstand (dvs. blegning forekommer kun under belysning ). Inden den kinetiske sigt exp- (t / τ off) tiden t er produktet af antallet af observationer n og tiden t lag for en enkelt FRET observation (dvs. sker kontinuerligt kinetisk uforpligtende). Ligning 1 kan udtrykkes som:

Ligning 2

Udtrykket τ blegemiddel / τ syg describes antallet af observationer indtil blegning opstår og defineres som forventningen værdi <n blege> sin eksponentiel funktion. Ligning 2 kan forenkles som følger:

Ligning 3

Forventningen værdi <n (t forsinkelse)> fra antallet af billeder N (t) med observerbare FRET-begivenheder efter tiden t er direkte bestemt ud fra forsøget. Det afhænger af den indstillelige tid mellem observationer (t lag) valgt i eksperimentet, og de ​​ukendte værdier for τ fra (den inverse af off-rate k off) og <n blege>, forventningen værdien af antal observationer før blegning sker .

Således beregning af forventningsværdien <n (t lag)> i mindst to værdier af t <n blege> og τ off.

Ekstraktion synaptiske 2D-K-værdier ved FRET-målinger

Måling TCR belægningsprocent a, dvs. forholdet mellem bundne TCR'er og de ​​samlede TCR'er, er centralt for fastlæggelsen synaptiske 2D-K D værdier. Ifølge ligning 4 dette udtryk er direkte proportional med den målte FRET udbytte så længe TCR'er fungerer som FRET donor og pMHCs som FRET acceptorer.

Ligning 4

med en = TCR belægning, C = omregningsfaktor

C er en konstant, som afhænger af det system FRET og fluorophorer anvendes. Det kan bestemmes eksperimentelt som vist nedenfor. a kan omdannes til et 2D-KD ifølge ligning 5, nårindledende densitet af TCR ligander før tilsætning af T-celler til dobbeltlaget er kendt. Dette er på grund af den høje mobilitet SLB grupperne proteiner, og også fordi SLBs giver en næsten uudtømmelig reservoir af ligander 2.

Ligning 5

med [pMHC oprindelige] = indledende densitet af pMHC før tilsætningen af T-celler

Med ligningerne 4 og 5, kan man nu nemt bestemme den synaptiske 2D-K D mellem TCR og pMHC. Dette er mest pålideligt gjort med FRET målinger baseret på donor bedring efter acceptor blegning (se protokol afsnit 3.1).

Men for at måle C forholdet mellem FRET intensitet jeg FRET (korrigeret for baggrund, FRET donor bleedthrough og FRET acceptor cross-excitation) og TCR belægning en skal bestemmes. Til dette, enbrug for at vide forholdet R mellem den gennemsnitlige fluorescensintensitet af enkelt TCR-associerede FRET donor fluoroforer (f.eks Cy3 eller AF555) sm I FRET donor og den gennemsnitlige intensitet enkelt molekyle FRET begivenheder sm I FRET. R afhænger af systemets FRET pågældende emissionsfiltre og kamera bruges til fluorescens detektion.

TCR belægning en kan derefter bestemmes direkte ifølge ligning 6.

Ligning 6

med R = sm I FRET donor / sm I FRET

R blev bestemt som 1,45 for H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 systemet fører til:

a = hovedparten I FRET / hovedparten I TCR-Cy3 • 1,45

Forholdet mellem TCR belægning a og udbyttet FRET kan bestemmes ved FRET donor genvindey efter acceptor blegning. Til dette begge parametre er plottet mod hinanden for et antal TCR microclusters som vist i figur 4A .Den hældning af den lineære fit angiver omregningsfaktoren C (fra ligning 4).

Som vist i figur 4A, C udgør for (a) H57 sCF V - Cy3 / pMHC-Cy5 FRET-system og (b) den anvendte mikroskop systemkonfiguration til 1.995. TCR belægning a kan let udledes som følger:

TCR belægning a = FRET udbytte • 1.995

Protocol

1. Protein Produktion

1.1. Dobbeltlag-resident proteiner: B7-1, ICAM-1, pMHC (f.eks IE k / peptid)

  1. B7-1 -12H, ICAM-1-12H
    1. Express B7-1-12H og ICAM-1-12H konstruktioner i høje mængder som udskilles native proteiner ved hjælp af en baculovirusekspressionssystem.
    2. Oprense proteiner fra kultursupernatanter via Ni-NTA affinitetskromatografi, efterfulgt af MonoQ anionbytningskromatografi og S200 gelpermeationskromatografi.
    3. Mærk en aliquot af det oprensede protein med aminreaktive farvestoffer, såsom NHS succinimidyl-ester præparater af Alexa Fluor 488 (eller FITC), Alexa Fluor 555 (eller Cy3), Alexa Fluor 647 (eller Cy5).
    4. Efter S200 gelpermeationskromatografi bestemme mærkning graden af ​​monomere proteiner ifølge dye-producentens specifikationer ved at sammenligne protein absorption ved 280 nm, og farvestoffet absorption ved 488 nm (Alexa Fluor 488, FITC), 555 eller 552 nm(Alexa Fluor 555 eller Cy3) eller 647 nm (Alexa Fluor 647 eller Cy5).
      Bemærk: Dette forhold vil senere blive nødvendigt at bestemme protein densitet på SLB fra hovedparten fluorescenssignal af farvestoffet-mærkede protein.
    5. Opbevar umærkede og fluorofor-mærkede proteiner ved -20 ° C i PBS plus 50% glycerol.
  2. pMHC (her: IE k -2x6H eller IE k -12H)
    1. Refolde MHC klasse II fra inklusionslegemer udtrykt i E. coli i nærvær af en langt billigere UV-peptidlinker erstatning, som senere kan kvantitativt udveksles med en fluorofor-konjugeret peptid valg 5, 7.
    2. Renses genfoldet pMHC komplekser ved standardteknikker (Ni-NTA-affinitetskromatografi, MonoQ anionbytningskromatografi, S200 gel filtration).
    3. Udveksle UV peptidlinker med fluorescerende peptid 5, 7.
    4. Rens monomere fluorescerende pMHC komplekser finally ved S200 gelfiltrering. Et repræsentativt kromatogram er vist i figur 3.
    5. Bekræft kvantitative peptid belastning ved spektrofotometri.
    6. Store proteiner ved -20 ° C i PBS / 50% glycerol.

1.2. Dannelse af enkeltkædede antistoffragmenter (SCF V s), indførelse af cysteiner for site-specifik mærkning

  1. Refolde sCF V s fra inklusionslegemer udtrykt i E. coli. Her en protokol udviklet af Tsumoto og kolleger 8 følges, hvor inklusionslegemer først udfoldes i 6 M guanidiniumchlorid, fuldt reduceret og derefter genfoldet i løbet af en uge ved gradvist at reducere koncentrationen af ​​proteinet udfoldelse guanidiniumchlorid.
  2. Koncentrer korrekt foldet sCF V ved hjælp af molekylære filteranlæg med en molekylær afskæring på 10 kDa.
  3. Oprens koncentratet ved S200 gelfiltrering.
  4. Label monomere sCF (TCEP) med Alexa Fluor 647 umiddelbart efter oprensning. Mærkningsreaktionen klarer sig bedst ved et molforhold af protein: farvestof på ikke mere end 1: 2 ved stuetemperatur i længere end 2 timer.
    Bemærk: TCEP er en phosphat- baseret reduktionsmiddel og ikke reagerer med maleimider ved disse koncentrationer 9. Det kan således være til stede under mærkningsreaktionen at holde den uparrede sulfhydryl reduceret steder, før den reagerer med farvestoffet-maleimidderivat.
  5. Rens mærket monomere sCF V endelig via S75 gelfiltrering. Et repræsentativt kromatogram er vist i figur 3.
  6. Bestem farvestoffet: protein-forholdet spektrofotometrisk.
  7. Store proteiner ved -20 ° C i PBS / 50% glycerol.

2. calciumflux Målinger

  1. Tag en frisk hætteglas indeholdende 50 ug Fura-2-AM og opløse den i 50 pi vand-fri DMSO.
  2. Spin ned 10 6 T-celler i en 5 ml polypropylen rundbundet rør i 2 minutter ved 250-400 g.
  3. Resuspender T-celler i 200 pi billeddannende medie indeholdende Hanks Balanced Salt Solution plus calcium / magnesium og 1% ovalbumin ved stuetemperatur, tilsættes 1 pi Fura-2-AM stamopløsning (1: 200 fortynding), bland cellesuspensionen og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
  4. Vask T-cellerne en gang i billeddannelse buffer. Til dette fylde røret indeholdende cellerne med billeddannelse buffer ved stuetemperatur og pelletere cellerne som beskrevet i trin 2. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 pi puffer billeddannelse (dvs. ved en endelig celletæthed på 5 x 10 6 celler ml-1). Celler kan umiddelbart anvendes til calciummålinger eller opbevares på is i op til 3 timer.
  5. Place celler på en funktionaliseret SLB i imaging buffer (37 ° C). Så snart T-celler begynder at kontakte SLB erhverve sig følgende sæt af billeder hver 15 til 30 sek i 30 minutter:
    excitation ved 340 +/- 5 nm, afsløring emission ved 510 +/- 40 nm
    excitation ved 380 +/- 5 nm, afsløring emission ved 510 +/- 40 nm
    DIC (valgfrit)
    Bemærk: Respektive eksponeringstider afhænger af intensiteten af ​​excitationslyskilden. Tilfredsstillende resultater opnås, når pixel intensiteter af 340 nm (380 nm) kanal udgør omkring en fjerdedel (halvdelen) af den maksimalt mulige intensitetsværdi. Husk, at Fura-2-værdier ophidset ved 340 nm vil stige, og de begejstrede ved 380 nm, vil falde på T-celle aktivering.
  6. 20-25 min i løb, tilføjer 50-100 pi det foropvarmede anti-pMHC blokerende antistof ved en slutkoncentration på 20-50 ug ml-1. Antistoffet mætter alle pMHCs og som en konsekvens T-celler vil ophøre med at genkende antigen og stoppe flus calcium. Fortsæt med optagelse af billeder til en anden 5 - 10 min. Til at erhverve grundlinjen af ​​den intracellulære calciumkoncentration, hvilket svarer til den ikke-aktiverede tilstand af T-cellerne < / li>
  7. Bestem den gennemsnitlige baggrund fluorescenssignal ved 340 nm og 380 nm excitation inden for et område af interesse på mindst 1000 pixels, som indeholder ingen celle. Baggrund-trække alle målte Fura-2 billeder ophidset ved 340 nm og 380 nm og beregne 340 nm / 380 nm intensitet forhold mellem de enkelte celler eller en gruppe af celler. Normalisere intensitetsforhold ved at dividere alle forhold ved forholdet mellem de fem sidste tidsrammer (dvs., med komplet antistof-blokade af pMHC).
  8. Plot normaliseret Fura-2 nøgletal mod tiden. Bemærk: Når celler og dobbeltlag er i god stand, Fura-2 340 nm / 380 nm intensitet nøgletal vedtager typisk værdier mellem 2 og 5, 15-45 sek efter celler har taget kontakt med dobbeltlaget. Forhold derefter falde til en værdi mellem 1,6 og 2, hvor de opholder sig konstant i mindst 20 min eller længere. Værdier skal falde til 1 efter tilsætning af anti-pMHC antistoffer. Et typisk eksempel er vist i figur 5.
"> 3. Bulk FRET Målinger

3.1. TCR dekoration med H57scF V

  1. Spin ned 10 6 T-celler i en 5 ml polypropylen rundbundet rør i 2 minutter ved 250-400 g.
  2. Dekanteres medierne, flick cellepelleten forsigtigt og tilsæt 0,3 pi sCF V (koncentration ~ 1 mg / ml) til cellesuspensionen. For bulk FRET målinger beskæftiger kun farvestofmærkede scFv'et. For enkelt molekyle FRET målinger bruger en blanding af umærket scFv- (5 til 9 dele, indeholder ingen uparrede cystein) og farvestof-mærket scFv- (1 del, indeholder et uparret farvestof-koblede cystein).
  3. Inkubér cellerne på is i 15 min og vask cellerne to gange gennem successive centrifugering under anvendelse af iskold puffer billeddannelse.
    Bemærk: Celler kan opbevares på is uden signifikant tab af bundet sCF V (t 1/2 SCF V dissociation ved 0 ° C ~ 4 timer 2). Renheden af ​​primære T-celler afledt af TCR-transgene (og eventuelt også Rag-1/2 deficiente mus) og stimuleret in vitro er højere end 98% siden T-celler er de eneste celler prolifererende (op til 7 celledelinger) som reaktion på peptidet, der er tilsat til stimulering af T-celle-kultur. B-celler undergår apoptose og ikke længere er i live efter 7-10 dages dyrkning. Et par dendritiske celler overlever endnu let kan diskrimineret, ikke kun på grund af deres særskilte morfologi men også fordi de ikke retligt bindende for H57 anti-TCR-beta scFV fragment.

3.2. FRET måling via donor bedring efter acceptor blegning

Bemærk: Husk, at halveringstiden af TCR-H57 SCF V komplekser beløber sig til 4 timer på is, til 50 min ved 22,5 ° C og til 6,8 minutter ved 37 ° C (og til ca. 4 timer på is) 2. Så længe H57 sCF V fungerer som FRET donor, målt FRET udbytterne ikke er følsomme over for H57 sCF V dissociation imidlertid signalet til støjforhold stigermed øget H57 dissociation.

  1. Udarbejde en SLB indeholder AF647 / Cy5-mærkede pMHCs samt umærket ICAM-1 og B7 ifølge Axmann et al. 4..
  2. Udveksle PBS for afbildningskammeret med billeddannende medium indeholdende Hanks Balanced Salt Solution plus calcium / magnesium og 1% ovalbumin. Til dette pipette 400 pi imaging puffer i brønden, blandes omhyggeligt og fjern 400 pi fra brønden. Gentag denne procedure 3-4 gange. Udsæt ikke SLB til luft til enhver tid.
  3. Placer imaging kammer på mikroskop scenen og justere fokus, indtil fluorescerende (AF647, Cy5) SLB kommer i frit udsyn.
  4. Nedsat TIRF belysning ved at oversætte den fokuserede stråle parallelt med den optiske akse til periferien af ​​objektivets fokusplan via flytning af periskop s translationelle fase.
  5. At finjustere excitation laserstråler i TIRF tilstand, tilføjer T-celler dekoreret med AF555 / Cy3 mærket sCF V
  6. Erhverve sig følgende seks billeder i den angivne rækkefølge og hurtigt efter hinanden (figur 6):
    (i1, valgfrit) hvidt lys, for at tage et billede af cellen,
    (i2, ekstraudstyr) 647 nm excitation (lav effekt) for at tage et billede af FRET acceptor (pMHC) forud for blegemiddel puls,
    (i3) 514 nm excitation (lav effekt) for at tage et billede af FRET donor (TCR) forud for blegemiddel puls,
    (i4) 647 nm excitation (høj effekt) til foto-blegemiddel FRET acceptor, /> (I5) 514 nm excitation (lav effekt) for at tage et billede af FRET donor (TCR) efter blegemiddel impuls,
    (i6) 647 nm excitation (lav effekt) for at kontrollere fuldstændig FRET acceptor blegning.
  7. Hold tiden gik mellem billeder (i3) og (i5) så kort som muligt for at kunne korrelere billeder til senere analyse. Hold FRET donor blegning på et minimum ved at anvende excitation ved den lavest mulige effekt, som stadig giver mulighed for korrekt billeddannelse af T-cellerne.
  8. Pick et område af interesse (ROI), fx en hel synapse eller en individuel TCR microcluster, fastlægge dens gennemsnitlige intensitet i (i3) (= I (3)), og i (i5) (= I (5)). For baggrundssubtraktion, vælge en ROI af samme dimension uden for belysning stedet i (3) eller (5) og bestemme dens gennemsnitlige intensitet (I (baggrund)). For at bestemme udbyttet FRET udføre følgende handling:
    g "/> (ligning 7)
    Bemærk: Det skal bemærkes, at i forhold til den absolutte FRET niveau, kan det være nødvendigt at korrigere for donor blegning mellem billeder (i5) og (i3).

3.3. FRET måling via sensibiliserede emission

  1. Udfør rumlig donoren og acceptoren kanal tilpasning til anvendelsen af ​​flerfarvede perler, der fluorescerer i alle emission kanaler. Den rumlige skift mellem de to kanaler på grund af kromatisk aberration kan bestemmes ved super-positionering enkelte perler, og har der skal anvendes for korrektion af en af de to kanaler for alle følgende 2-farve image-par 10.
  2. Bestemme graden af ​​donor bleedthrough med anvendelse af en SLB indeholdende FRET donorfluoroforen alene. Det er også muligt at anvende FRET-donor-mærkede T-celler på et lipiddobbeltlag med umærket pMHC. Baggrund først bestemmes uden for det belyste synsfelt og derefter trukket fra begge kanaler. På denne måde den gennemsnitlige ba GGRUND-korrigeret intensiteter af to tilsvarende ROI'er (jeg donor-kanal og jeg acceptor kanal) bestemmes. Beregn bleedthrough koefficient (BTC) som følger:
    Ligning 8 (ligning 8)
    Bemærk: Dette BTC er en konstant for en bestemt farvestof og filtersæt-kombination.
  3. Beregn FRET donor bleedthrough billedet som følger:
    Ligning 9 (ligning 9)
  4. Bestem acceptor cross-excitation ved at excitere en SLB indeholdende FRET acceptor fluorofor alene (f.eks IE k / MCC-Alexa Fluor 647) først med FRET donor excitationslys (f.eks., 514 nm) og derefter med acceptor excitationslys (f.eks 647 nm). Brug baggrundssubtraktion billeder i FRET acceptor kanal til beregning af cross-excitation koefficient (CEC) på følgende måde:
    ftp_upload / 53157 / 53157eq10.jpg "/> (ligning 10)
  5. Som CEC afhænger af laserintensiteten anvendes til donor excitation, fastlægge den på hver måling dag. Brug den resulterende CEC til at beregne billedet udelukkende genereres gennem cross-excitation.
    Ligning 11 (ligning 11)
  6. Beregn FRET billedet korrigeret for bleedthrough og cross-excitation som følger:
    Ligning 12 (ligning 12)
    Bemærk: Absolut FRET signal (men ikke den relative udbytte FRET) er følsom over for dissociation af H57 sCF V fra T-cellemembranbundet TCR. For at undgå overdrevent tab af TCR-FRET probe, har til formål at udføre målinger ved 37 ° C inden for de første 2 minutter efter tilsætning af T-celler til dobbeltlaget. Målinger med kvantitative (≥ 95%) TCR mærkning er kun mulige ved eller under 22,5 ° C inden for de første 3 minutter eftertilsætning af T-celler til dobbeltlaget.

4. Single Molecule FRET Målinger

  1. Justere effekten af begge lasere til at give anledning til en intensitet på 1-5 kW / um 2 ved prøven. For yderligere oplysninger henvises til Axmann et al. 4..
  2. Label T-celler som skitseret ovenfor med en blanding af umærket sCF V (5-9 dele) og Cy3 / AF555-mærket sCF V (1 del). Bemærk: På denne måde kun en brøkdel af TCR'er er markeret med FRET-donor. Dette reducerer antallet af påviselige interaktioner, men støj fra donor bleedthrough også markant (med omkring 5 1/2 til 10 1/2), hvilket er kritisk, når afvikle individuelle enkelt molekyle FRET begivenheder.
    Bemærk: dissociation af H57 scFV sonden fra TCR påvirker ikke målingerne, som det forekommer i et meget større tidsinterval (minutter til timer) end dissociation af TCR fra SLB-bundne pMHC (sub-sekund til sekundinterval).
  3. Placer en SLB featuring AF647-mærket pMHCs samt ICAM og B7 på mikroskopet scenen og justere fokus således, at dobbeltlaget kommer i frit udsyn.
  4. Valgfrit: Indsæt en spalteåbningen i excitation pathway (som vist i Axmann et al. 4) for at maskere de fleste inden for belysning bortset synapsen. Denne måde ubleget IE k / MCC (C) -Alexa Fluor 647 FRET acceptormolekyler molekyler kan bevæge sig ind i området af belysning.
  5. Tilføj H57 sCF V dekorerede T-celler til dobbeltlaget (med billedbehandling buffer), og vente, indtil synapser vises i synsfeltet.
  6. Tag i hurtig rækkefølge en sekvens på 10 til 20 billedsæt hjælp 2-farvet detektion:
    i1) excitation 514 nm
    i2) excitation 647 nm
  7. Udsætte billeder i 1 til 5 ms og erhverve som et sæt af billeder.
  8. For at vurdere identiteten af ​​enkelt molekyle FRET begivenheder, anvende den samme korrektion vedrørende donor bleedthrough og acceptor cross-excitation. Desuden enkelt molekyle FRET begivenheder nødt til at tilpasse med enkelte acceptormolekyler og bør dukke op og forsvinde i ét trin (se også Figur 7).
  9. Off-rate bestemmelse
    1. Optag spor af enkelt molekyle FRET arrangementer for flere erhvervelse tidsrammer.
      Bemærk: I dette eksempel (i kursiv) off-satsen mellem 5c.c7 TCR og IE k / K3 måles ved 25 ° C med fire forskellige forsinkelsestider (42 msek, 490 ms, 1007 ms 1989 ms).
    2. Liste FRET spor efter deres spor længder som vist i tabel 1.
    3. Konverter tabel 1 i en inverse kumulative henfaldsfunktion (tabel 2) som vist (farvede tal er taget fra tabel 1).
    4. At normalisere den resulterende henfaldsfunktion, dividere antallet af spor af tabel 2 med summen af ​​alle spor i den pågældende gruppe. Plot de normaliserede værdier mod antallet af tidsrammer. Når udelade sidste tidsramme, som indeholder et nul, kan henfaldene læsesily udstyret med en enkelt eksponentialfunktion (figur 8A).
    5. Som vist i figur 8B, plotte forventningsværdien <n (t lag)>, dvs., den negative inverse af eksponenten af henfaldsfunktion fastlagt ovenfor mod den anvendte forsinkelsestid t lag (i dette eksempel: x = t lag = 0,042 s og y = <n (t LAG)> = 1 / 0,662 = 1,511, x = 0,49 s og y = 1 / 0,902 = 1,101, x = 1.007 s og y = 1 / 1.131 = 0,884, x = 1.989 s og y = 1 / 1,591 = 0,629).
    6. Fit τ ud og <n blege> baseret på ligning 3. Dette kan gøres ved hjælp af en ikke-lineær tilpasning funktion af et videnskabeligt dataanalyse program som Origin.
      Bemærk: Den bedste pasform vist i dette eksempel giver en τ ud af 2,12 +/- 0,23 s og en <n blege> på 1,53 +/- 0,06 sek.
    7. Beregn half liv i interaktionen t 1/2 af med t 1/2 off = τ fra • ln (2) (i dette eksempel: 1,47 s).
  10. 2D-KD bestemmelse
    1. Bestem omregningsfaktor C for FRET farvestof par anvendes ved brug af ligning 6 og som beskrevet ovenfor (figur 4A).
    2. Bestem FRET udbytter for de enkelte TCR microclusters eller hele synapser (figur 3B og 5).
    3. Ved hjælp af ligning 4 konvertere alle individuelle FRET udbytter i TCR occupancies (figur 4C).
    4. Anvend ligning 11 til at konvertere alle TCR occupancies i 2D-KD s. Som det er angivet nedenfor, synaptisk binding er inhomogen. Et meningsfuldt mål for synaptisk K D s er medianen (angivet med rødt) af alle målte microclusters (Figur 4D).
  11. Beregning af 2D-k på s
    1. Beregn k på med loven af masse action med k på = k off / K D og den eksperimentelt bestemte k off og K D værdier.
      Bemærk: Den synaptiske k off for eksperimentet vist i figur 4 (IE k / MCC interagere med 5c.c7 TCR ved 25 ° C) er 0,41 s -1. Derfor KD plot (figur 4D) kan omdannes til ak på plot som vist i figur 4E.

Representative Results

Registreringen af intracellulært calcium via Fura-2 calcium farvestof samt den efterfølgende celleanalyse at kontrollere stimulerende styrke og dermed funktionalitet SLBs er vist i figur 4. Som bliver tydeligt, calcium stiger i T-celler (udtrykt som normaliseret fura-2 340 nm / 380 nm-forholdet med baseline var 1) umiddelbart, så snart de rette på stimulerende SLBs. Calcium niveauer vender tilbage til baseline niveau kort efter tilsætning af et antistof, som blokerer pMHCs fra TCR engagement og som afslutter T-celle aktivering.

Figur 6 viser et typisk forsøg med FRET donor bedring efter acceptor blegning, som anvendes til måling af FRET udbytter, og som tjener til at beregne 2D-K-værdier (vist i figur 4). Bemærk stigningen i FRET donor intensitet, som repræsenterer TCR mærket via AF555, efter hurtig og fuldstændig ablation af FRET encceptor arter (her: AF647 forbundet med pMHCs). Også klart er den stærke reduktion i FRET-kanal, dvs. FRET-acceptor kanal under FRET donor excitation, efter FRET acceptor blegning. Den knap synlige resterende signal svarer til at ærgre donor bleedthrough. FRET udbytter i de enkelte TCR microclusters eller hele synapser er beregnet på grundlag af de angivne målte intensitetsværdier (figur 6B).

Figur 7 viser en bane og tidsforskydning af en enkelt FRET begivenhed synlige i to tidsrammer molekyle. Som beskrevet ovenfor i indledningen sådan adfærd er forårsaget af både henfald af synaptisk TCR-pMHC binding og fotoblegning. At skelne mellem disse to bidrag, de eksperimentelle erhvervelse tidsrammer skal varieres i varighed: mens fotoblegning forbliver en konstant, indregnes ændringer i FRET begivenhed bane længde kun forårsaget af de bindende kinetik. En kvantificering af tracelengths, w hich danner grundlag for beregningen af off-rates og blegning vist i figur 7, er tilvejebragt i tabel 1 til 3.

Bestemmelse af 2D-KD s kræver registrering af bulk FRET udbytter for FRET-donor-mærkede TCR'er. Med brugen af eksperimentelt udledte konstanten C (figur 4), kan et udbytte FRET målt for en TCR microcluster eller en hel synapse omdannes til TCR belægning a, dvs., forholdet mellem pMHC-engagerede og samlede TCR'er (figur 4C) . Med kendte pMHC densiteter til stede på SLB før tilsætning af T-celle, kan a-værdier anvendes til at bestemme synaptiske 2D-K-værdier (figur 4D). On-satser kan beregnes med loven af masse action (2D-k på = 2D-k off / 2D-K D) fra det bestemt synaptiske off-rate og 2D-KD-værdier.

1 "src =" / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk oversigt over lipiddobbeltlaget systemet plane glas-understøttet (SLB). (A) SLBs er sammensat af POPC (90-99%) og den syntetiske lipid DGS Ni-NTA (1-10%) og dannes spontant, når rene glasoverflader debiteres med små unilamelblærer (SUV'er) bestående af de tilsvarende lipider. (B) Når det er dannet, kan sådanne SLBs funktionaliseres med opløselige polyhistidin-mærkede ekstracellulære dele afledt fra pMHCs, costimulerende B7-1 proteiner og ICAM-1 adhæsionsproteiner, at tjene som APC'er til T-celler. For mere information om at forberede SLBs refererer til Axmann et al. 4.. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figu Ad 2. Förster Resonance Energy Transfer-baseret assay til kvantificering af TCR-pMHC binding in situ. (A) en kompositstruktur af et TCR kompleks med en enkelt kæde H57 fragment indgreb med en pMHC illustrerer FRET tilgang beskrevet heri. Bemærk den korte afstand på ca. 41a adskiller de to tilsvarende fluoroforer undergår FRET. Acceptorsites for fluoroforen-maleimider er angivet i grøn og rød. (B) Princippet om påvisning af TCR-pMHC interaktioner i stedet er illustreret. Kun sCF V -Dekorerede TCR'er og pMHCs (her IE k), som danner specifikke komplekser, giver anledning til en målelig FRET signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

"/>
Figur 3. kromatogrammer af den endelige gelfiltreringstrin giver anledning til monomere sCF V s og peptidbelastede IE k -2x6H molekyler. X-akserne repræsenterer retentionsvolumen i ml, Y-akserne angiver absorbans ved 280 nm i arbitrære enheder (AU) . (A) H57 sCF V stedspecifikt mærket med Alexa Fluor 555 maleimid blev underkastet S75 kromatografi for at adskille uomsat farvestof fra proteinet (trin 1.2.5). Fraktioner svarende til fastholdelse interval 14 til 15 ml (stiplede linier) repræsenterer mærket monomere H57 sCF V. (B) IE k -2x6H molekyler kompleks med UV-spaltelige ANP-space holder peptid havde været UV-bestrålet, inkuberes med site-specifikt Alex 647 maleimid-mærket peptid og endelig underkastes S200-kromatografi for at adskille proteinet fra frit peptid (trin 1.1.2.4). Intervallet mellem de stiplede linier indeholder korrekt foldet og monomere pMHCs. (A, B) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Bestemmelse 2D-K D s og 2D-k på s. (A) Sammenhængen mellem udbyttet FRET som bestemt af donor opsving efter acceptor blegning og TCR belægning blev målt eksperimentelt. TCR belægning kan bestemmes for individuelle TCR microclusters som forklaret i afsnit 4.2. En lineær tilpasning af dataene vises af linjen, hvis hældning er lig med forholdet mellem TCR Cbelægning og udbyttet FRET. C er en konstant bestemt for systemet FRET og fluorophorer (her Cy3 og Cy5) anvendes. I dette eksempel er det viste 1.988. (B) FRET udbyttedata blev bestemt for individuelle TCR microclusters (N = 187, temperatur = 24 ° C) gennem donor genvinding af acceptor blegning. Nedenstående histogram søjler angiver den øvre grænse i intervallet. (C) Konvertering af data vist i (B) ved at gange målt FRET udbytter med konstanten C bestemmes i (A). Tallene under søjler angiver den øvre grænse i intervallet. (D) Histogram (todelt logaritmisk, bund = 4) skildrer fordelingen af 2D-K D s målt for enkelte TCR microclusters. Den mediane 2D-K D er vist med blåt. Tallene under søjler angiver den øvre grænse i intervallet. (E) vist i (D) histogram blev konverteret intOA 2D-k på -histogram (todelt logaritmisk, bund = 4) ansætte den synaptiske k slukket i 24 ° C (0,41 s -1). Den bestemmes mediane 2D-k på værdi er angivet i blåt. Data blev oprindeligt udgivet i Huppa et al. 2 og visualiseres her i et nyt format. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Funktionel validering af SLBs ansat til T-celle stimulering og billeddannelse. (A) TCR-transgene T-celle blaster fyldt med fura-2 blev konfronteret med stimulerende SLB huser antigene pMHCs, ICAM-1 og B-7. Cellular fura-2 emission ophidset ved 340 nm og 380 nm samt DIC billeder blev optaget. Som angivet, forholdsværdier af emissionsintensiteter exciteres ved 340 og 380 nm er vist i højre panel. Tilsætning af pMHC blokerende antistoffer 14 min i forsøgskørsel resulterede i et fald i intracellulære calciumniveauer sammenlignes med hvilende T-celler. (B) En typisk tidsmæssigt profil gennemsnitlige Fura-2-forhold i T-celler i kontakt stimulerende SLBs er kendetegnet af en en indledende stigning i intracellulært calcium, som er 2 til 4 gange højere sammenlignet med ikke-aktiverede T-celler eller T-celler berøvet antigen efter antistofmedieret blokade. Grønne cirkler angiver tidspunkter illustreret i (A). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Bulk FRET udbytter målt gennem FRET donor bedring efter FRET acceptor blegning. et al 4). Den er vist i venstre DIC image line viser grænsen af ​​T-celle synapser. Bemærk tabet i intensitet i FRET acceptor kanalen samt er stigningen i intensitet i FRET donor kanalen, efter FRET acceptor blegning (trin 4). (B) FRET effektivitet kan kvantificeres som angivet for individuelle synaptiske områder eller til hele synapser. For inspektion, bliver billederne før og efter FRET acceptor blegning vist med brug af to opslagstabeller (LUT'er, grønne og fysik). Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 7
Figur 7. enkelt molekyle FRET begivenheder og forsvinder insingle trin og er perfekt afstemt med en enkelt FRET acceptor fluorfor. Tidspunktet bortfald af enkelt molekyle FRET begivenhed er vist. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en back-belyst EMCCD kamera. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Bestemmelse τ off = 1 / k off fra de målte smFRET baner. (A) De normaliserede kumulative summer af observerbare FRET signaler (afledt af H57 sCF V -AF555 dekoreret 5c.c7 TCR transgene T-celle blaster genkender IE <sup> k / K3-AF647 ved 24 ° C) i fire forskellige tidsintervaller (42 msek, 490 msek, 1.007 ms, 1989 ms) blev afbildet som en funktion af det samlede antal observationer. Mono-eksponentiel fit funktioner giver anledning til tilsvarende negative inverse af forventning værdier <n (t LAG)>. (B) Forventning værdier blev plottet mod forsinkelser t lag og monteres med ligning <n (t forsinkelse)> = τ off / {(T off / <n blege>) + t forsinkelse} at give τ ud og <n blege>. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Måling af protein-protein-interaktioner in situ er meget ønskeligt, især når det drejer sig lav affinitet interaktioner, såsom TCR-pMHC bindende 11. Dette skyldes, at den sats, samt stabiliteten af ​​sådanne interaktioner påvirkes betydeligt af de særlige omstændigheder, hvorunder binding finder sted. Minimalt invasive FRET-baserede imaging tilgange er dermed i princippet perfekt egnet til sådanne opgaver, men indebærer en række forhindringer, der skal først overvindes. Støj fra cellulær autofluorescens begrænser følsomheden af ​​målingerne og bør derfor holdes på et minimum. TIRF mikroskopi tjener dette behov meget godt 12, men kræver, at funktionalisering af glas-objektglas, helst i form af et plant glas-understøttet lipiddobbeltlag dekoreret med proteiner af valg 13-15. En anden fordel ved et delvist reconstitutive fremgangsmåde er, at rekombinante dobbeltlag-hjemmehørende FRET partnere kan være meget mmalm let mærkes i en kvantitativ, stedspecifik og rationel måde med mindre og lysere fluoroforer, end det ville være muligt med celleoverflade-udtrykte proteiner. TCR'er er kodet med rekombinant sCF V s, som ikke påvirker T-celle-genkendelse, som blev testet tidligere 2. Desuden proteinet sammensætningen af ​​SLB, f.eks densitet pMHCs og valget af tilbehør faktorer kan justeres til ens specifikke behov. Vi har tidligere udført forsøg med varierende tætheder af stimulerende pMHCs, men har ikke påvist signifikante forskelle i 2D-k off og 2D-KD 2.

Indtil videre her anerkendelse af MHC klasse II-molekyler er blevet behandlet alene, hovedsagelig på grund af arten af ​​deres peptid bindende kløft, som er åben i begge ender, og dermed plads til større peptider, herunder en linker til fluorophor vedhæftet fil. I nogle tilfælde sådan tilgang kan også arbejde for mærkning MHC CLAss I molekyler 16, men stor forsigtighed bør tages for at kontrollere deres anvendelse i eksperimenter. Følsomheden af T-celler mod antigener, der kan måles via T-celleproliferationsassays, samt pMHC-TCR bindingskinetik målt in vitro ved overfladeplasmonresonans bør ikke påvirkes af tilsætningen af linkeren og fluorofor til peptidet. Alternativt kan MHC klasse I molekyler sig mærkes på en stedspecifik måde med indførelsen af ​​en uparret cystein i sekvensen af ​​den tunge kæde (upublicerede observationer).

Med brugen af ​​passende molekylære prober som helst synaptiske protein-protein-interaktion kan i princippet blive undersøgt på en måde, der er beskrevet heri. Sådanne sonder, f.eks, bør sCF V s eller Oprettet ankyrin Gentag Proteiner (DARPins) 17, være monovalent og bør binde deres mål stabilt uden at påvirke interaktionen af interesse. Selvfølgelig strukturelle INFORMATIOn er meget ønskeligt for en rationel probe design, men ikke absolut nødvendigt. Ved etablering af et nyt par FRET partnere, anbefales det at registrere og analysere FRET i bulk først. Lokaliteter af etiket vedhæftet fil kan varieres betydeligt for at maksimere signalet FRET og også til at kontrollere, at målte FRET udbyttet varierer baseret på inter-farvestof afstand. Når systemet er optimeret, enkelt molekyle FRET signaler kan registreres ved at begrænse mærkningen af ​​store overflod FRET partner til 10-30% og blegning lav tæthed FRET partner, indtil enkelte molekyler er opløselige inden for belysning.

Sidst men ikke mindst skal det bemærkes, at SLBs tilnærme nogle, men ikke alle aspekter af en fysiologisk plasmamembranen. Egenskaber som membran krumning og fleksibilitet, domæne opdelingen, cytoskelet-omlejringer og cellemotilitet samt en høj række overfladeudtrykte membranproteiner ikke er repræsenteret ved SLBs men kunne have indflydelse tHan behandler under efterforskning. Stor indsats skal investeres for at etablere billeddiagnostiske modaliteter, der tillader overvågning protein-protein interaktioner med enkelt molekyle opløsning i fysiologiske synapser, som er utilgængelige for TIRF billeddannelse.

Acknowledgments

MA blev understøttet af en Schrödinger fællesskab af Austrian Science Fund (FWF, J3086-B11) og tak Max-Planck-Society for finansiel og administrativ støtte. GS og JH blev støttet af Wien Videnskab og Teknologi Fund (WWTF, LS13-030).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB-media Fisher Scientific 10000713 bacterial expression
Sf900 II Life Technologies 10227402 insect cell media for baculo virus production
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) Fisher Scientific 10564038 insect cell media for baculo virus expression
Sf9 cells Life Technologies 11496-015 cells for virus production and expansion
High Five Cells Life Technologies B855-02 cells for potein expression
LB-media Fisher Scientific 10000713 bacterial expression
Centramate System Pall protein concentartion from large volumes
Centramate cassette 10kDa cutoff Pall OS010T12 protein concentartion from large volumes
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC900308 protein concentartion
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC800308 protein concentartion
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL EMD Millipore 5123 protein concentartion
Äkta pure 25L GE Healthcare 29-0182-24 protein purification
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 17-5175-01 protein purification
Superdex 75 10/300 GL GE Healthcare 17-5174-01 protein purification
Mono Q 5/50GL GE Healthcare 17-5166-01 protein purification
Ni Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-5318-01 protein purification
Tricorn 10/20 column GE Healthcare 28-4064-13 protein purification
Gilson HPLC system Gilson purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size Agilent A6000250X212 purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size Agilent A6000050G212 purificationof fluorochrome-coupled peptides
Tricorn 10/20 column  GE Healthcare 28-4064-13 protein purification
Gilson HPLC system Gilson purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size Agilent A6000250X212 purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size Agilent A6000050G212 purificationof fluorochrome-coupled peptides
Cy3 maleimide GE Healthcare PA23031 site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Cy5 maleimide GE Healthcare PA25031 site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide Life Technologies A-20346 site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Life Technologies A-20347 site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Fura-2, AM, cell permeant Life Technologies F-1221 calcium-sensitive dye for cell labeling
dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich 151874 for dissolving fura-2 am
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium Fisher Scientific 10225362 imaging buffer
PBS Life Technologies 14190-136
Bovine Serum Albumin lyophilized powder Sigma Aldrich A2153 supplement for imaging buffer
14-4-4S antibody affimetrix eBioscience 14-5980-81 blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)
5 ml polypropylene round-bottom tube Becton Dickinson FALCON 352063
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit EMD Millipore UFC30GV0S
Syringe filter 0.2µm Millipore GVWP04700
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Life technologies T-7279
Microscope for fura-2-based calcium measurements  LEICA DMI4000B
Microscope for (single molecule) FRET measurements LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
planar supported lipid bilayers for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
RPMI 1640, with L-Glutamine Life Technologies 11554416 T-cell media
non-essential amino acid 100X Hyclone SH30238.01 T-cell media supplement
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x Life Technologies 12000226 T-cell media supplement
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 T-cell media supplement
mouse interleukin-2 recombinant protein BPS Bioscience 90185-B T-cell media supplement
Research Grade Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03 T-cell media supplement
Origin (analysis program) OrigenLab http://www.originlab.com/ non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple. Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).
  2. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature.. 463, 963-967 (2010).
  3. Huppa, J. B., Davis, M. M. The interdisciplinary science of T-cell recognition. Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).
  4. Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers. Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158 (2015).
  5. Xie, J., et al. Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC. Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).
  6. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).
  7. Toebes, M., et al. Design and use of conditional MHC class I ligands. Nat Med. 12, 246-251 (2006).
  8. Tsumoto, K., et al. Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment. J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).
  9. Ruegg, U. T., Rudinger, J. Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine. Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).
  10. Ruprecht, V., Brameshuber, M., Schütz, G. J. Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes. Soft Matter. 6, 568-581 (2010).
  11. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).
  12. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
  13. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  14. Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).
  15. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
  16. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).
  17. Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins. J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).

Tags

Bioengineering T-celle antigen-genkendelse receptor-ligand interaktion kinetik immunologisk synapse Calcium flux måling enkelt molekyle mikroskopi Förster Resonance Energy Transfer
Måling TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Ved hjælp af et FRET-baseret assay Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Axmann, M., Schütz, G. J.,… More

Axmann, M., Schütz, G. J., Huppa, J. B. Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay. J. Vis. Exp. (104), e53157, doi:10.3791/53157 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter