Introduction
De ontdekking van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) heeft een revolutie op het gebied van regeneratieve geneeskunde, die een haalbare methode voor het genereren van patiënt-specifieke stamcellen 1-3. hiPSCs succes gegenereerd uit verschillende somatische celtypen, waaronder fibroblasten 4,5, 6,7 hematopoëtische cellen, epitheelcellen van nier urine 8 en keratinocyten 9,10. Tot op heden huidfibroblasten en hematopoietische cellen zijn de meest gebruikte cel voor het genereren van patiëntspecifieke iPSCs. Dit is wellicht te wijten aan het feit dat de huid biopten en bloedafname zijn routinematige medische procedures en grote biobanken van de patiënt bloed of huidmonsters hebben in veel landen vastgesteld.
In tegenstelling tot bloedcellen en de huid fibroblast die invasief extractie vereisen, keratinocyten vormen een gemakkelijk toegankelijke celtype voor iPSC generatie. Keratinocytes zijn keratine-rijke epitheliale cellen die de buitenkant epidermale barrière van de huid te vormen en zijn ook gevonden in nagels en haren 11. In het bijzonder kunnen keratinocyten te vinden op de buitenste wortelschacht (BHS) van haarfollikels, een uitwendige cellaag die de haarschacht bedekt met de binnenste schede (IRS) cellen (12, figuur 1). Zoals haar collectie is een eenvoudige procedure die de hulp van medisch personeel niet vereist, het biedt een mogelijkheid voor patiënten te verzamelen en sturen hun eigen haar monsters naar laboratoria, die sterk het verzamelen van monsters van patiënten voor iPSC generatie zou vergemakkelijken. Epidermale keratinocyten hebben ook een hogere efficiëntie en snellere herprogrammering herprogrammering kinetiek vergeleken met fibroblasten, waardoor de voordelen van het gebruik keratinocyten als uitgangspunt cellen voor iPSC productie 9,13. Bovendien kan hiPSCs ook opgeroepen met andere celpopulaties in de haarfollikel,waaronder de dermale papilla cellen aan de onderkant van de haarfollikel 14,15.
Vorige meldingen van iPSC generatie met behulp van haar afgeleide cellen gebruiken vaak retrovirale of-lentivirale gebaseerde herprogrammering methoden 9,14,15. Echter, deze virale methoden introduceren ongewenste genomische integratie van buitenlandse transgenen tijdens het herprogrammeren. Ter vergelijking, het gebruik van episomale vectoren vertegenwoordigt een mogelijke, niet-virale herprogrammering methode-integratie vrije iPSCs 4 te genereren. We hebben eerder ontwikkelde een eenvoudige, kosteneffectieve en non-virale methode om efficiënt herprogrammeren keratinocyten in hiPSCs middels episomale vectoren 13. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het genereren van uit keratinocyt verkregen hiPSCs, waaronder de afleiding van keratinocyten uit geplukt haren, uitbreiding en onderhoud van de keratinocyten en daaropvolgende herprogrammering hiPSCs genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De collectie van menselijk haar steekproef van individuen vereist ethische goedkeuring door het menselijk onderzoek ethische commissie in de ontvangende instellingen en moet worden gedaan in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
1. Isolatie van keratinocyten uit geplukt Hair
- Thaw extracellulaire matrix (ECM) oplossing (dat wil zeggen, Matrigel) op ijs O / N.
- Met voorgekoeld pipetpunten, voeg 200 ul ECM oplossing 12 ml koud DMEM / F12 medium. Coat een 12-wells plaat met 1 ml verdunde ECM oplossing in elk putje. Incubeer de gecoate plaat O / N bij 37 ° C. Was de beklede plaat met voorverwarmde DMEM / F12-medium vóór gebruik.
- Verzamel primaire menselijke haren uit het hoofd van het individu door het plaatsen van de vingers dicht bij de wortel van het haar en het plukken van het haar in een snelle en vloeiende beweging. Controleer bevestigen dat elke verzamelde haar bevat een haarfollikel intact en bepaalt de groeifase van het haar under een dissectie microscoop (Figuur 1).
- Verzamel 5-10 anagene haren van ieder individu om keratinocyten te halen. Werkwijze geplukt haren zo spoedig mogelijk succesvolle afleiding van keratinocyten waarborgen.
Opmerking: Figuur 1 illustreert de morfologie van haren in verschillende fasen van de groeicyclus. Anagene haren in de groeifase, een zichtbare buitenlaag van epitheel rond de lengte van het haar, zogenaamde ORS. Anderzijds, telogen haar vertegenwoordigt haar in de rustfase en heeft geen zichtbare ORS, maar een duidelijke klompje cellen die de wortel van het haar, zogenaamde telogene bobbel.
- Verzamel 5-10 anagene haren van ieder individu om keratinocyten te halen. Werkwijze geplukt haren zo spoedig mogelijk succesvolle afleiding van keratinocyten waarborgen.
- Plaats de haarmonsters in een petrischaal met 10 ml van antibiotica Mix te wassen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Met behulp van gesteriliseerde schaar en pincet, afgesneden overmatige haarschacht, waardoor er een haar-fragment met een intact haarfollikel en rond 0,5-1 cm van de haarschacht.
- Zorgvuldig transfer 1 haar fragment in elk putje van de ECM-gecoate plaat met behulp van een tang.
- Met behulp van een pipet 1 ml, voeg ongeveer 3 druppels Knockout Serum Vervangende (KSR) medium (~ 100-200 ul) om het haar monsters.
Let op: Houd het haar fragmenten in nauw contact met de plaat oppervlak mogelijk te maken voor bevestiging en de daaropvolgende keratinocyten uitgroei. Schade aan het medium toevoegen van deze stap kan het haar veroorzaakt fragmenten te drijven en vermindert de kans op succesvolle hair attachment. - Incubeer de haarmonsters in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 en laat de haarzakjes O bevestigen / N. De volgende dag, voeg voorzichtig nog 3 druppels KSR medium (~ 100-200 ul) aan de haarmonsters vochtig.
- Observeer het haar monsters dagelijks te bevestigen dat de haarzakjes met succes hebben aangesloten. In het algemeen bevestiging van de haarzakjes blijkt binnen 1-3 dagen. Dikke haren zijn meestal gemakkelijker te hechten vergeleken met fijne haartjes, zoals fijne haartjes hebben een hogereneiging om te drijven die het hechtingsproces belemmeren.
- Zodra het haar aan de beklede plaat zijn bevestigd, voeg 500 pl KSR medium naar de bron. Wees extra voorzichtig bij het toevoegen van het medium als haren monsters niet goed kan zijn bevestigd. Vanaf dit punt, verandert de media om de 2 dagen.
Opmerking: Keratinocyte uitwassen moet zichtbaar zijn van de ORS regio van het haar fragment na 3-7 dagen (Figuur 2A-B). Laat de keratinocyten te groeien tot 14 dagen vóór passage van de cellen zoals beschreven in de volgende paragraaf.
- Zodra het haar aan de beklede plaat zijn bevestigd, voeg 500 pl KSR medium naar de bron. Wees extra voorzichtig bij het toevoegen van het medium als haren monsters niet goed kan zijn bevestigd. Vanaf dit punt, verandert de media om de 2 dagen.
2. Onderhoud en passage van keratinocyten
- Pre-coat een 6-wells plaat met de bekledingsmatrix Kit. Voeg 680 ul van het verdunningsmiddel uit de set aan elk putje, gevolgd door 6,8 pi matrixoplossing Coating. Schud de plaat om een gelijkmatige verdeling van de coating Matrix oplossing op de plaat te garanderen.
- Laat de beklede platen incuberen gedurende 30 min bij kamertemperatuur. VerwijderenCoating Matrix oplossing vóór de beplating van keratinocyten.
- Dissociëren keratinocyten in een enkele celsuspensie met 500 pi 0,25% trypsine per putje gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Inactivatie van het trypsine met 500 pl medium dat serum (bijvoorbeeld, foetaal runderserum (FBS) gemiddeld) en verzamelen in een steriele 15 ml buizen. Verwijder het haar fragment gebruikt gesteriliseerde pincet.
- Bepaal het aantal geoogste cellen met een hemocytometer.
- Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 200 x g. Was de cellen met PBS en herhaal centrifugeren. Zuig het PBS en resuspendeer de cel pellet in verse Keratinocyte medium.
- Plaat naar beneden 4 × 10 4 keratinocyten in een put van ECM-gecoate plaat in de aanwezigheid van Keratinocyte medium. Bewaar de keratinocyten in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 (figuur 2C). Wijzig de media elke dag en passage cellen wanneer de cultuur is ~ 80% confluent, which kan ongeveer 2-7 dagen duren, afhankelijk van de passage nummer en proliferatie snelheid van de keratinocyten. De afgeleide keratinocyten moet worden uitgebreid om voldoende bevroren voorraden te genereren met behulp van standaard slow-bevriezing cryopreservatie methodes 16.
Opmerking: De beschreven kweekomstandigheden ondersteunen de uitbreiding van homogene bevolking van keratinocyten met typische geplaveide morfologie (figuur 2C). Af en toe, kan een paar gedifferentieerde keratinocyten, met grote en platte morfologie en replicatieve potentieel hebben verloren, worden waargenomen in cultuur. Karakterisering van keratinocyten kan door immunokleuring met behulp van antilichamen tegen cytokeratine 14 zoals eerder beschreven 17. Gevestigde cellijnen keratinocyt moet worden getest mycoplasma na 1-3 passages in de handel verkrijgbare kit.
3. Generatie van hiPSCs uit keratinocyten behulp Episomaal Vectoren
- Pre-coat a 6-well plaat met0,1% gelatine (2 ml / putje). Laat gelatine coaten ten minste 20 min bij kamertemperatuur.
- Herprogrammering experiment gebruikt keratinocyten uiterlijk passage 6. keratinocyten dissociëren tot een enkele celsuspensie met 1 ml van 0,25% trypsine per putje gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Inactiveer trypsine met 1 ml medium met serum (bijv FBS media) en laat in een 15 ml buis.
- Centrifugeer cellen gedurende 3 minuten bij 200 xg en resuspendeer cellen in Keratinocyte medium. Plaat 1 × 10 5 -1,5 × 10 5 keratinocyten per putje in een verstijfselde plaat O / N.
- Op de volgende dag (dag 0), controleer dan de plaat om ervoor te zorgen cellen 50-60% confluent.
Opmerking: Als keratinocyten minder dan ~ 50% confluent ze misschien niet goed groeien na transfectie. - Op dag 0, voert transfectie van episomale vectoren herprogrammering van de keratinocyten, met een verhouding van 8 ul transfectie reagens 2 ug totaal plasmide DNA.
- Neem 0,5 ug van elk van de 4 plasmiden (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) en verdund in 100 ui verlaagde serum medium (bijv OPTI-MEM).
Opmerking: Het plasmide pCXLE-eGFP wordt gebruikt om de efficiëntie van de transfectie in keratinocyten volgen en is niet vereist voor een succesvolle herprogrammering. - Voeg 8 pi transfectie reagens om de verdunde DNA. Meng door flicking de buis. Laat het DNA reactiemengsel onverstoorde rusten bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Vervang de Keratinocyte medium met vers medium.
- Voeg voorzichtig de DNA reactiemengsel te keratinocytkweek en incuberen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 4 uur.
Opmerking: Het is niet aan te raden om een langdurige transfectie O / N presteren in keratinocyten als ze vertonen lage overlevingskans na transfectie. - Na 4 uur na transfectie vervangen keratinocyt medium door vers medium.
- Neem 0,5 ug van elk van de 4 plasmiden (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) en verdund in 100 ui verlaagde serum medium (bijv OPTI-MEM).
- Op dag 1 (1 dag post-transfection), verander de keratinocyten medium en check transfectie-efficiëntie van het schatten van het percentage eGFP positieve cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Typisch> 60-70% transfectie efficiëntie waargenomen voor primaire keratinocyten met dit protocol.
- Op dag 2, herhaalt transfectie zoals beschreven in stap 3.5. Twee achtereenvolgende transfecties zouden typisch de> 90% transfectie efficiëntie. Keratinocytkweek bereikt meestal samenloop tegen het einde van de tweede transfectie.
- Bereid een 10 cm schotel van muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder voor elke herprogrammering reactie. Bereid mitotisch geïnactiveerd MEF feeders zoals eerder beschreven 18.
- Pre-coat een 10 cm schaal met 5 ml 0,1% gelatine gedurende tenminste 20 minuten. Plate 4 × 10 6 mitotisch geïnactiveerde MEF per 10 cm schotel in FBS medium. Laat de cellen bezinken en bevestigen O / N in een 37 ° C incubator met 5% CO 2.
- Op dag 3, harvest de keratinocyten met 0,25% trypsine, zoals beschreven in stap 3.2 en 3.3. Resuspendeer de keratinocyten in KSR medium en plaat 90% van de keratinocyten van 1 putje van een 6-wells plaat in een 10 cm MEF feeder schotel met KSR medium.
- Vanaf dag 4, verandert de KSR medium elke dag.
- Ook na dag 18, vervangen kweekmedium elke tweede dag.
Let op: Niet-geherprogrammeerd keratinocyten zal ophouden te vermenigvuldigen, terwijl iPSC kolonies met gedefinieerde grens die menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) lijken zal ontstaan vanaf dag 14-21.
- Ook na dag 18, vervangen kweekmedium elke tweede dag.
- Isoleer iPSC kolonies door handmatige dissectie van Day 21 en later. Vermijd iPSC kolonies die nauw met elkaar zijn geclusterd en alleen halen iPSC kolonies die duidelijk gescheiden zijn van anderen.
Opmerking: iPSC kolonies kan eerder worden opgehaald, maar de kolonie met gedefinieerde grenzen misschien niet duidelijk in eerdere tijdstippen zijn, gezien de kleine kolonie grootte. Herprogrammering efficiëntie kan variëren tussen diffErent patiënt keratinocyten en wordt ook beïnvloed door andere factoren zoals het aantal passages of proliferatiesnelheid van keratinocyten.- Voor handmatige dissectie van iPSC kolonies, gebruik dan een 26G naald om iPSC kolonies snijden onder een dissectie microscoop. Snijd een iPSC kolonie in kleine stukjes rond 300-600 micrometer in lengte. Breng de stukken van de ene iPSC kolonie in een nieuwe MEF feeder plaat (2,5 × 10 4 MEF / cm2) om een klonale lijn van hiPSCs vast te stellen. Aanvankelijk elkaars cultuur iPSC klonale lijn in een putje van een 12 well plaat of orgelcultuur gerechten, vervolgens uit te breiden naar 6 well plaat formaat.
- Handhaaf opgericht klonale lijnen van hiPSCs in KSR medium op MEF feeders. Nadat de kweek bereikt 70-80% confluentie met iPSC kolonies ~ 1,5 mm in diameter, doorgang hiPSCs toepassing van standaard werkwijzen enzymatische passage (Accutase, Dispase of Collagenase IV) volgens de instructies van de fabrikant.
- Karakteriseren opgericht iPSC lijns om pluripotentie en hun vermogen om te differentiëren in cellen representatief voor de drie kiemlagen in vitro en / of in vivo 13,19 bevestigd. Ook routinematig proef opgericht iPSC lijnen voor mycoplasma met behulp van commercieel verkrijgbare kits te zorgen dat ze zijn pathogeen vrij. Routinematig monitoren genomische stabiliteit van iPSC lijnen door karyotypering of array-gebaseerde copy number variation (CNV) analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het haar gaat door 3 verschillende fasen van de groeicyclus: anagen (de groeifase), catagene (de regressie fase) en telogen (de rustfase) 20,21. De anagene haarfollikels bevat meerdere lagen epitheel; Deze lagen omvatten ORS, IRS en de haarschacht (figuur 1). Anagen haar uiteindelijk ondergaat de overgang naar de catagene fase, die wordt gekenmerkt door apoptose van de ORS en beëindiging van de haarschacht differentiatie. Tenslotte catagene haar overgang naar de telogene fase, waarin apoptose ophoudt en de telogen follikel wordt rustig met een karakteristieke telogeen uitpuilen 20,21.
Figuur 1 toont de morfologie van een telogen haren en een anagene haren. Wij gebruiken meestal anagene haar voor keratinocyte afleiding. Na dit protocol is keratinocyt uitwassen worden reeds na 3 dagen na haar bevestiging (figuur 2A) en blijft proliferate (Figuur 2B). In onze ervaring, kunnen sommige anagen haren niet te bevestigen of niet keratinocyten uitgroei te observeren; dus het verzamelen ten minste 5-10 anagene haren van ieder individu om succesvol keratinocyten isolatie zorgen. Vervolgens kan de keratinocyten worden gepasseerd op een nieuwe plaat en gedurende meerdere doorgangen (Figuur 2C). Het is belangrijk op te merken dat er een betere groei van keratinocyten op een Coating Matrix met Keratinocyte medium zoals beschreven in hoofdstuk 2, in vergelijking met Matrigel met KSR medium.
Na expansie is de keratinocyten worden geherprogrammeerd hiPSCs genereren zoals beschreven in sectie 3. Figuur 3A toont een typisch keratinocyt verkregen iPSC kolonies na 32 dagen herprogrammering. Het is gebruikelijk om enige differentiatie nageleefd het midden van de iPSC kolonie. Zodra de hand geplukt, de afgeleide hiPSCs doorgaans hoog kern naar cytoplasma-ratio en een gedefinieerde kolonie gebonden gevenary (Figuur 3B). Erkende cellijnen van hiPSCs kan dan worden gekenmerkt pluripotency zoals eerder beschreven 13,19, zoals de expressie van pluripotente markers OCT4, NANOG en TRA-160 (Figuur 3C-E).
Figuur 1. Vertegenwoordiger beelden van geplukt haren in verschillende groeifasen. (A) Schematische weergave van haren in de anagene of telogene fase. Fasecontrast beelden die een geplukte haren in (B) telogene fase en (C) anagene fase. HS = haarschacht; IRS = Inner Root schede; ORS = Outer Root schede. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger beelden van haar afgeleide keratinocyten. Fase contrast beelden van een geplukte haar naar beneden plated voor (A) 3 dagen en (B) 10 dagen. Witte pijlen markeren de uitgroei van keratinocyte van een geplukte haar. (C) fase contrast beeld van Dag 3 keratinocytkweek met een typisch geplaveide morfologie na passage. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
(A) fase contrast beeld van een dag 32 herprogrammering cultuur toont een-keratinocyten afgeleid iPSC co Figuur 3. Representatieve beelden van keratinocyten afgeleide hiPSCs.Lony. (B) handmatig geselecteerd-keratinocyten afgeleid hiPSCs met morfologie lijken op hESCs. Immunokleuring van hiPSCs met pluripotente markers (C) NANOG en (D) OCT4 en (E) TRA-160 in keratinocyt verkregen hiPSCs. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generatie van patiënt-specifieke hiPSCs biedt een unieke benadering voor het bestuderen van de pathogenese van de zieke celtypen in vitro, en biedt ook een platform voor drug discovery om nieuwe moleculen die de ziekte fenotypes kan redden identificeren. Deze ziektemodel benaderingswijze via hiPSCs heeft veelbelovende resultaten opgeleverd voor diverse ziekten, waaronder lange QT-syndroom, ziekte van Huntington, ziekte van Parkinson en amyotrofe laterale sclerose 22. Diverse initiatieven zijn al aan de gang voor grootschalige bibliotheken van patiënt-specifieke hiPSCs, inclusief consortia in de VS, Europa, Australië, China, Zuid-Korea en Japan 23,24 vast te stellen.
Hier een protocol hiPSCs stellen van haren afgeleide keratinocyten wordt beschreven, die in potentie vergemakkelijken en versnelde de vestiging van grootschalige bibliotheken van ziektespecifieke hiPSCs heeft. Het protocol biedt twee voordelen: Ten eerste episomalesysteem gebruikt in dit protocol genereert-integratie vrije hiPSCs met een cocktail van zes herprogrammering factoren (OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shRNA voor p53) bij relatief hoge efficiency 4. In vergelijking met retrovirale en lentivirale-gemedieerde herprogrammering werkwijzen, het gebruik van episomale vector voorkomt ongewenste genomische integratie van vreemd transgenen tijdens herprogrammeren., Dus veel initiatieven voorkeur het gebruik van integratie vrij herprogrammering werkwijzen voor het opzetten van grootschalige iPSC libraries, zoals episomale vectoren, Sendai virus of mRNA, dan integrerende herprogrammering methoden 23.
Ten tweede, haar is gemakkelijk bereikbaar en kan zich zonder het gebruik van invasieve procedures of de opkomst van de medische staf worden geoogst door de patiënten. Dit biedt een unieke gelegenheid voor patiënten uit verschillende regio's te verzamelen en post in hun eigen haar monsters naar het laboratorium voor keratinocyte afleiding en de daaropvolgende herprogrammering. Ter ondersteuning van de haalbaarheid van deze strategie, onze ongepubliceerde gegevens aan dat keratinocyten met succes kunnen worden geïsoleerd uit geplukte haren die werd bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen.
De hier beschreven methode wordt de afleiding van keratinocyten uit geplukt haar mogelijk te maken. Terwijl de keratinocyten kan worden afgeleid uit slechts een enkele haar, onze aanbeveling om ten minste 5 anagene haren van keratinocyt afleiding verzamelen. Een beperking van dit protocol is dat sommige haren niet goed kan aan de keratinocyten kan onvoldoende groeien. Dikker haar heeft de neiging om beter te bevestigen, terwijl fijn haar vereist een verminderde hoeveelheid kweekmedium tijdens plating te vermijden drijven en te versterken bevestiging. Zodra keratinocyten afkomstig zijn, verdient het aanbeveling uitbreiden en bevriezen op voorraden met standaard langzaam invriezen cryopreservatie methodes 16. Latere herprogrammering van keratinocyten kan worden uitgevoerd volgende stappen in dit protocol beschreven. Het is belangrijk omer rekening mee dat de verspreiding percentage van de startende cellen de herprogrammering efficiëntie kunnen beïnvloeden, met een verminderde herprogrammering efficiëntie waargenomen in de late passages als cellen te bereiken cellulaire veroudering 25-27. In dit verband gebruiken keratinocyten uiterlijk passage 6 voor herprogrammering experimenten. Bovendien kan herprogrammering efficiëntie varieert tussen keratinocyten verschillende individu.
Recente studies suggereren wijdverbreide genetische mosaicism in meerdere soorten somatische weefsels 28, met ~ 30% van huidfibroblasten gemeld somatische CNV hebben in het genoom 29. Deze CNVs kunnen worden veroorzaakt door fouten in DNA-replicatie, DNA-reparatie of transposon mobilisatie. Het is ook mogelijk dat langdurige UV blootstelling van de huid additionele CNV in epidermiscellen waaronder fibroblasten en keratinocyten kan veroorzaken, maar de omvang van dit is niet goed begrepen. Zoals CNVs in keratinocyten dan tijdens de herprogrammering proces zal worden uitgevoerd, is het important routine karyotypering of CNV analyses uit te voeren om te verzekeren dat de vastgestelde hiPSCs handhaven genomische stabiliteit. Samengevat, beschreven we procedures voor het genereren van hiPSCs uit-hair afgeleide keratinocyten, die kunnen worden gebruikt voor ziektemodel en regeneratieve geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).
- Fuchs, E.
- Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
- Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
- Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
- Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
- Conner, D. A., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22 (2001).
- Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
- Myung, P., Ito, M.
- Alonso, L., Fuchs, E.
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
- McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
- Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
- Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
- Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
