Introduction
El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) ha revolucionado el campo de la medicina regenerativa, proporcionando un método viable para la generación de células madre específicas del paciente 1-3. hiPSCs se han generado con éxito de varios tipos de células somáticas, incluyendo fibroblastos, células hematopoyéticas 4,5 6,7, células epiteliales renales de orina 8 y queratinocitos 9,10. Hasta la fecha, los fibroblastos de piel y células hematopoyéticas representan las fuentes de células más comúnmente utilizados para la generación de CMPI específicos del paciente. Posiblemente, esto se debe al hecho de que las biopsias de piel y la extracción de sangre son procedimientos médicos de rutina y los grandes bancos de datos genéticos de la sangre o de la piel muestras de los pacientes se han establecido en muchos países.
En contraste con las células de la sangre y los fibroblastos de la piel que requieren métodos de extracción invasivos, los queratinocitos representan un tipo de célula de fácil acceso para la generación de hiPSC. KeratinocytES son células epiteliales de queratina rica que forman la barrera epidérmica exterior de la piel y también se encuentran en las uñas y el pelo 11. En particular, los queratinocitos se pueden encontrar en la vaina externa de la raíz (ORS) de los folículos pilosos, una capa celular externa que cubría el eje del pelo junto con la vaina radicular interna (IRS) células (12, Figura 1). Como colección de cabello es un procedimiento sencillo que no requiere la asistencia de personal médico, que proporciona una oportunidad para que los pacientes recogen y envían a sus propias muestras de cabello a los laboratorios, lo que facilitaría enormemente la recogida de muestras de los pacientes para la generación hiPSC. Queratinocitos epidérmicos también tienen una mayor eficiencia de reprogramación y la cinética de reprogramación más rápidas en comparación con los fibroblastos, añadiendo a las ventajas de utilizar los queratinocitos como las células de partida para la generación de hiPSC 9,13. Además, hiPSCs también se puede generar usando otras poblaciones de células dentro del folículo piloso,incluyendo las células de la papila dérmica situados en la base del folículo piloso 14,15.
Informes anteriores de la generación de IPSC utilizando células derivadas de pelo a menudo utilizan métodos de reprogramación retrovirales o basados en lentivirus 9,14,15. Sin embargo, estos métodos virales introducen integración genómica indeseable de transgenes extraños durante la reprogramación. En comparación, el uso de vectores episomales representa un método de reprogramación factible, no viral para generar CMPI-integración libre 4. Hemos desarrollado previamente un método sencillo, rentable y no viral para reprogramar eficiente de queratinocitos en hiPSCs utilizando vectores episomales 13. Aquí nos proporcionan un protocolo detallado para la generación de hiPSCs de queratinocitos derivados, incluyendo la derivación de los queratinocitos de desplumado pelo, expansión y mantenimiento de los queratinocitos y la posterior reprogramación para generar hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La colección de la muestra de cabello humano de las personas requiere la aprobación ética por el comité de ética de la investigación humana en las instituciones de acogida y debe hacerse de conformidad con las directrices institucionales.
1. Aislamiento de queratinocitos de pelo Plucked
- Descongele la matriz extracelular solución (ECM) (es decir, Matrigel) en el hielo O / N.
- Utilizando puntas de pipeta de pre-enfriado, añadir 200 l solución ECM de 12 ml de medio DMEM / F12 frío. Rociar una placa de 12 pocillos con 1 ml de solución ECM diluido en cada pocillo. Incubar la placa recubierta O / N a 37 ° C. Lave la placa recubierta con medio precalentado DMEM / F12 antes de su uso.
- Recoger el pelo humano primario de la cabeza del individuo mediante la colocación de los dedos cerca de la raíz del cabello y el desplume el pelo en un movimiento rápido y suave. Revise para confirmar que cada pelo recogido contiene un folículo piloso intacto y determinar la fase de crecimiento del cabello de la ONUder un microscopio de disección (Figura 1).
- Suma 5-10 pelos anágena de cada individuo para extraer los queratinocitos. Proceso arrancó los pelos tan pronto como sea posible para asegurar la obtención exitosa de los queratinocitos.
Nota: la Figura 1 ilustra la morfología de pelos en diferentes fases del ciclo de crecimiento. Cabello anágeno está en la fase de crecimiento, con una capa exterior visible del epitelio que rodea la longitud del pelo, conocido como los ORS. Por otra parte, el pelo telógeno representa cabello en la fase de reposo y no tiene una ORS visibles, pero tiene un talón de las células que cubren la raíz del cabello, conocido como el bulto telógeno.
- Suma 5-10 pelos anágena de cada individuo para extraer los queratinocitos. Proceso arrancó los pelos tan pronto como sea posible para asegurar la obtención exitosa de los queratinocitos.
- Colocar las muestras de cabello en una placa Petri que contiene 10 ml de antibiótico Mix para lavar durante 5 min a RT.
- Con unas tijeras y pinzas esterilizadas, cortar cabello excesiva, dejando un fragmento de cabello con un folículo piloso intacto y alrededor de 0,5 a 1 cm de cabello.
- Cuidadosamente transfer fragmento 1 de pelo en cada pocillo de la placa de ECM recubiertos con el uso de fórceps.
- Con una pipeta 1 ml, añada aproximadamente 3 gotas de reemplazo Knockout Suero (KSR) medio (~ 100-200 mu l) para las muestras de cabello.
Nota: Mantenga los fragmentos de pelo en estrecho contacto con la superficie de la placa para permitir la unión y posterior derivación de queratinocitos. Adición de medios excesiva en este paso puede hace que los fragmentos de pelo para flotar y disminuye la probabilidad de apego pelo éxito. - Incubar las muestras de cabello en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2 y permitir que los folículos del pelo para sujetar O / N. Al día siguiente, añadir suavemente otros 3 gotas de medio de KSR (~ 100 a 200 l) para mantener las muestras de cabello húmedo.
- Tenga en cuenta las muestras de cabello todos los días para confirmar que los folículos pilosos se han unido con éxito. En general adjunto de los folículos pilosos es evidente dentro de 1-3 días. Pelos gruesos suelen ser más fáciles de colocar en comparación con los pelos finos, como pelos finos tienen mayortendencia a flotar que dificultan el proceso de apego.
- Una vez que el cabello se han unido a la placa revestida, añadir 500 l de medio de KSR al pozo. Tenga mucho cuidado al añadir el medio como muestras de cabello no puede haber bien sujeto. Desde este punto, cambiar de medios cada 2 días.
Nota: excrecencias queratinocitos deben ser visibles desde la región ORS del fragmento de pelo después de 3-7 días (Figura 2A-B). Permita que los queratinocitos a crecer hasta 14 días antes de que pases las células como se describe en la siguiente sección.
- Una vez que el cabello se han unido a la placa revestida, añadir 500 l de medio de KSR al pozo. Tenga mucho cuidado al añadir el medio como muestras de cabello no puede haber bien sujeto. Desde este punto, cambiar de medios cada 2 días.
2. Mantenimiento y pases de queratinocitos
- Pre-coat una placa de 6 pocillos usando el Kit de matriz de revestimiento. Añadir 680 l de la dilución medio del kit a cada pocillo, seguido de 6,8 l de solución de matriz de revestimiento. Agitar la placa para asegurar la distribución uniforme de la solución matriz de revestimiento en el plato.
- Dejar que la placa revestida incubar durante 30 min a TA. Quitarla solución matriz de recubrimiento antes de chapado de los queratinocitos.
- Disociar queratinocitos en una sola suspensión celular con 500 l de tripsina al 0,25% por pocillo durante 2-5 min a 37 ° C. Inactivar la tripsina con 500 l de medio que contiene suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS) medio) y recoger en un tubo de 15 ml estéril. Retire el fragmento de pelo con unas pinzas esterilizadas.
- Determinar el número de células cosechadas usando un hemocitómetro.
- Centrifugar las células durante 3 min a 200 x g. Lavar las células con PBS y centrifugación de repetición. Aspirar el PBS y resuspender el botón celular en medio de queratinocitos fresco.
- Placa abajo 4 × 10 4 queratinocitos en un pocillo de la placa de ECM-recubierto en presencia de medio de queratinocitos. Mantener los queratinocitos en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2 (Figura 2C). Cambie los medios cada día las células y de paso cuando la cultura es de ~ 80% de confluencia, which puede tardar aproximadamente 2-7 días, dependiendo del número de pases y la proliferación de los queratinocitos tasa. Los queratinocitos derivados deberían ampliarse para generar suficientes existencias congeladas utilizando métodos de criopreservación lenta congelación estándar 16.
Nota: Las condiciones de cultivo descritas apoyan la expansión de la población homogénea de queratinocitos con típica morfología de adoquines (Figura 2C). De vez en cuando, un par de queratinocitos diferenciados, con morfología grande y plana y han perdido potencial de replicación, se pueden observar en la cultura. Caracterización de los queratinocitos se puede realizar mediante inmunotinción utilizando anticuerpos contra citoqueratina 14 como se describió previamente 17. Líneas celulares de queratinocitos establecidos también deben ser probados para micoplasma después de 1-3 pasajes utilizando kit disponible comercialmente.
3. Generación de hiPSCs a partir de queratinocitos Uso de vectores episomales
- Pre-capa una placa de 6 pocillos con0,1% de gelatina (2 ml / pocillo). Permitir gelatina para recubrir por lo menos durante 20 min a TA.
- Para el experimento de reprogramación, el uso de queratinocitos no más tarde de paso 6. disocian queratinocitos en una única suspensión de células con 1 ml de tripsina al 0,25% por pocillo durante 2-5 min a 37 ° C. Inactivar tripsina con 1 ml de medio que contiene suero (por ejemplo, medios de comunicación FBS) y recoger en un tubo de 15 ml.
- Centrifugar las células durante 3 minutos a 200 xg y volver a suspender las células en medio de queratinocitos. Plate 1 × 10 5 -1,5 × 10 5 queratinocitos por pocillo en una placa gelatinizada O / N.
- Al día siguiente (día 0), compruebe la placa para asegurarse de células son 50-60% de confluencia.
Nota: Si los queratinocitos son menos de ~ 50% de confluencia que podría no crecer bien después de la transfección. - En el Día 0, lleve a cabo la transfección de los vectores de reprogramación episomal en los queratinocitos, utilizando una relación de reactivo de transfección 8 l a 2 g de ADN plasmídico total.
- Tomar 0,5 g para cada uno de los 4 plásmidos (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) y diluir en 100 l de medio de suero reducido (por ejemplo, OPTI-MEM).
Nota: El plásmido pCXLE-eGFP se utiliza para supervisar las eficiencias de transfección en los queratinocitos y no se requiere para la reprogramación éxito. - Añadir 8 l de reactivo de transfección con el ADN diluido. Mezclar con un movimiento rápido del tubo. Dejar que la mezcla de reacción de ADN para descansar sin perturbaciones a temperatura ambiente durante 15 min.
- Reemplace el medio de queratinocitos con medio fresco.
- Añadir con cuidado la mezcla de reacción de ADN para cultivo de queratinocitos e incubar en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2 durante 4 horas.
Nota: No se recomienda realizar prolongada transfección O / N en los queratinocitos, ya que presentan una baja supervivencia después de la transfección. - Después de 4 horas después de la transfección, sustituya el medio de queratinocitos con medio fresco.
- Tomar 0,5 g para cada uno de los 4 plásmidos (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) y diluir en 100 l de medio de suero reducido (por ejemplo, OPTI-MEM).
- En el Día 1 (1 día después de la transinfección), cambiar el medio de queratinocitos y comprobar la eficacia de transfección mediante la estimación del porcentaje de células positivas EGFP bajo un microscopio fluorescente. Por lo general se observa> 60-70% de eficiencia de transfección de queratinocitos primarios que utilizan este protocolo.
- En el Día 2, repita transfección como se describe en el paso 3.5. Dos transfecciones consecutivos típicamente alcanzar> 90% de eficiencia de transfección. Cultivo de queratinocitos suele alcanzar confluencia por el final de la segunda transfección.
- Preparar un plato de 10 cm de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de alimentación para cada reacción reprogramación. Preparar alimentadores MEF mitóticamente inactivadas como se describió anteriormente 18.
- Pre-coat un plato de 10 cm con 5 ml de 0,1% de gelatina durante al menos 20 min. Placa 4 × 10 6 MEF mitóticamente inactivados por placa de 10 cm en medio FBS. Permitir que las células se asienten y se unen O / N en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2.
- El día 3, harconferir los queratinocitos con 0,25% de tripsina como se describe en el paso 3.2 y 3.3. Resuspender los queratinocitos en medio KSR y la placa 90% de los queratinocitos a partir de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos en un plato de 10 cm alimentador MEF con medio KSR.
- Desde el Día 4 en adelante, cambiar el medio KSR cada día.
- Alternativamente después del día 18, reemplace medio de cultivo cada dos días.
Nota: Los queratinocitos para no reprogramado dejarán de proliferar, mientras que las colonias hiPSC con límites definidos que se asemejan a las células madre embrionarias humanas (hESCs) surgirán de Día 14-21.
- Alternativamente después del día 18, reemplace medio de cultivo cada dos días.
- Aislar colonias hiPSC por disección manual desde el día 21 en adelante. Evite colonias hiPSC que están estrechamente agrupados juntos y sólo recogen colonias hiPSC que se separan claramente de los demás.
Nota: colonias hiPSC pueden ser recogidos antes, pero la colonia con límites definidos pueden no ser evidentes en momentos anteriores dado el tamaño de las colonias pequeñas. Eficiencia reprogramación pueden variar entre difftambién está influenciada de queratinocitos paciente Erent, y por otros factores tales como el número pasaje o tasa de proliferación de queratinocitos.- Para la disección manual de las colonias hiPSC, utilice una aguja 26G para cortar colonias hiPSC bajo un microscopio de disección. Cortar una colonia hiPSC en trozos pequeños alrededor de 300 a 600 micras de longitud. Transfiera las piezas de una colonia hiPSC en una nueva placa de alimentación MEF (2,5 × 10 4 MEF / cm 2) para establecer una línea clonal de hiPSCs. Inicialmente, la cultura de cada línea clonal hiPSC en un pocillo de una placa de 12 o de cultivo de órganos así los platos, a continuación, expanda al 6 de formato de placa también.
- Mantener líneas clonales establecidos de hiPSCs en medio KSR en alimentadores MEF. Una vez que la cultura alcanzar el 70 - 80% de confluencia con colonias hiPSC ~ 1,5 mm de diámetro, hiPSCs de paso utilizando métodos estándar enzimáticos pases (Accutase, dispasa o colagenasa IV) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Caracterizar línea hiPSC establecidos para confirmar la pluripotencia y su capacidad para diferenciarse en células representativas de las tres capas germinales in vitro y / o in vivo 13,19. También, de forma rutinaria prueba establecidos líneas hiPSC para micoplasma utilizando kits comerciales para asegurarse de que están libres de patógenos. Monitorear rutinariamente la estabilidad genómica de líneas hiPSC por cariotipo o el número de copias variación basada en matrices (CNV) análisis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El pelo pasa por 3 fases diferentes del ciclo de crecimiento: anágena (fase de crecimiento), catágena (la fase de regresión) y telógeno (la fase de descanso) 20,21. El folículo del pelo anagen contiene múltiples capas de epitelio; estas capas incluyen las sales de rehidratación oral, IRS y el tallo del pelo (Figura 1). Anagen pelo finalmente se somete a la transición a la fase catágena, que se caracteriza por la apoptosis de las sales de rehidratación oral y la terminación de la diferenciación del cabello. Por último, la transición del pelo catágeno a la fase de telógeno, donde cesa la apoptosis y el folículo telógeno se convierte en reposo con un telógeno característico bulto 20,21.
La Figura 1 ilustra la morfología de un cabello telógeno y un cabello anágeno. Por lo general utilizamos el pelo anágeno para la derivación de los queratinocitos. Siguiendo este protocolo, excrecencias de queratinocitos se pueden observar ya a los 3 días después de la fijación del cabello (Figura 2A) y continuarán proliferate (Figura 2B). En nuestra experiencia, algunos pelos anágena pueden fallar para fijar o dejar de observar consecuencia de queratinocitos; por lo tanto recoger al menos 5-10 pelos anágena de cada individuo para asegurar el aislamiento de los queratinocitos éxito. Posteriormente, los queratinocitos pueden pasaron a una nueva placa y mantenidos para múltiples pasajes (Figura 2C). Es importante tener en cuenta que hay un mejor crecimiento de los queratinocitos en una matriz de recubrimiento con medio de queratinocitos como se describe en la sección 2, en comparación con Matrigel con medio KSR.
Después de la expansión, los queratinocitos pueden ser reprogramadas para generar hiPSCs como se describe en la sección 3. La figura 3A muestra una típica hiPSC colonia queratinocitos derivados después de 32 días de reprogramación. Es común observar cierta diferenciación en el centro de la colonia hiPSC. Una vez recogidos manualmente, los hiPSCs derivados suelen mostrar gran núcleo al citoplasma y una colonia definido cotaary (Figura 3B). Líneas celulares establecidas de hiPSCs entonces se pueden caracterizar por la pluripotencia como se describió previamente 13,19, tales como la expresión de marcadores pluripotentes OCT4, NANOG y TRA-160 (Figura 3C-E).
Figura 1. Imágenes representativas de pelos arrancados en diferentes fases de crecimiento. (A) Diagrama que ilustra pelos en la fase anágena o telógeno. Imágenes de contraste de fase que muestran un pelo arrancado en (B) la fase de telógeno y (C) anágena fase. HS = eje del pelo; IRS = Interior Raíz vaina; ORS = Outer Raíz vaina. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes representativas de queratinocitos derivados de pelo. Imágenes de contraste de fase de un pelo arrancado sembraron abajo para (A) 3 días y (B) 10 días. Las flechas blancas marcan el fruto de los queratinocitos de un cabello arrancado. Imagen de contraste (C) Fase de la Jornada 3 cultivo de queratinocitos con una morfología de adoquines típico después de pases. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes representativas de hiPSCs queratinocitos derivados. (A) Imagen de contraste de fase de una cultura Día 32 reprogramación mostrando una hiPSC co queratinocitos derivadoslony. (B) seleccionado manualmente hiPSCs queratinocitos derivados con morfología similar a hESCs. La inmunotinción de hiPSCs con marcadores pluripotentes (C) NANOG y (D) OCT4 y (E) TRA-160 en hiPSCs de queratinocitos derivados. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generación de hiPSCs específicos del paciente ofrece un enfoque único para el estudio de la patogénesis en los tipos de células enfermas in vitro, y también proporciona una plataforma para la detección de drogas para identificar nuevas moléculas que pueden rescatar a los fenotipos de la enfermedad. Este enfoque de modelado enfermedad utilizando hiPSCs ha dado resultados prometedores para una variedad de enfermedades, incluyendo el síndrome de QT largo, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica 22. Varias iniciativas que ya están en marcha para establecer bibliotecas a gran escala de hiPSCs específicos del paciente, incluyendo consorcios en EE.UU., Europa, Australia, China, Corea del Sur y Japón 23,24.
Aquí un protocolo para establecer hiPSCs de queratinocitos derivados de pelo se ha descrito, que tiene el potencial de facilitar y vía rápida la creación de bibliotecas de gran escala de hiPSCs enfermedades específicas. Este protocolo ofrece dos ventajas: En primer lugar, la episomalsistema utilizado en este protocolo genera hiPSCs-integración libre utilizando un cóctel de seis factores de reprogramación (Oct4, Sox2, KLF4, L-MYC, Lin28, shRNA para p53) relativamente alta eficiencia 4. Comparado con los métodos de reprogramación retrovirales o lentivirales mediada, el uso de episomal vector evita integración genómica indeseable de transgenes extraños durante la reprogramación., Por lo tanto, muchas iniciativas favorecen el uso de métodos de reprogramación de la integración libre para el establecimiento de bibliotecas hiPSC a gran escala, tales como vectores episomales, virus Sendai o ARNm, respecto a los métodos de reprogramación de integración 23.
En segundo lugar, el pelo es de fácil acceso y se puede cosechar por los propios pacientes sin el uso de procedimientos invasivos o la asistencia de personal médico. Esto proporciona una oportunidad única para los pacientes de diferentes regiones para recoger y enviar por correo sus propias muestras de cabello al laboratorio para la derivación de queratinocitos y la posterior reprogramación. En apoyo de la viabilidad de esta estrategia, nuestros datos no publicados indican que los queratinocitos pueden aislarse exitosamente de pelo desplumado que se almacenó a 4 ° C durante un máximo de 10 días.
La metodología descrita aquí permitirá la deducción de los queratinocitos de pelo arrancado. Mientras que los queratinocitos se pueden derivar de un solo pelo, nuestra recomendación es recoger al menos 5 pelos anagen para la derivación de los queratinocitos. Una limitación de este protocolo es que algunos pelos pueden no conectar bien y los queratinocitos pueden dejar de crecer. El pelo más grueso tiende a conectar mejor, mientras que el cabello fino requiere menor cantidad de medio de cultivo durante el chapado de evitar flotante y mejorar el apego. Una vez que se obtienen los queratinocitos, es aconsejable ampliar y congelar hasta stocks utilizando métodos de criopreservación lenta congelación estándar 16. Reprogramación subsiguiente de queratinocitos se puede realizar los pasos siguientes se describen en este protocolo. Es importantetenga en cuenta que la tasa de proliferación de las células de partida puede afectar la eficiencia de reprogramación, con la eficiencia de reprogramación disminución observada en los pasajes finales como células alcanzan la senescencia celular 25-27. En este sentido, utilizar los queratinocitos no más tarde de paso 6 para los experimentos de reprogramación. Además, la eficiencia de reprogramación pueden variar entre los queratinocitos de diferente individuales.
Estudios recientes sugieren mosaicismo genético generalizado en múltiples tipos de tejidos somáticos 28, con ~ 30% de los fibroblastos de la piel informado que tienen somática CNVs en el genoma 29. Estos CNVs pueden ser causados por errores en la replicación del ADN, la reparación del ADN o la movilización del transposón. También es posible que la exposición prolongada a los rayos UV de la piel puede causar CNVs adicionales en las células epidérmicas, incluyendo fibroblastos y queratinocitos, pero el alcance de esto no se entiende bien. Como CNVs en queratinocitos serán prorrogados durante el proceso de reprogramación, es importante para llevar a cabo la determinación del cariotipo de rutina o análisis CNV para asegurar que los hiPSCs establecidos mantener la estabilidad genómica. En resumen, aquí describimos procedimientos para la generación de hiPSCs de queratinocitos derivados de pelo, que podrían utilizarse para el modelado de la enfermedad y la medicina regenerativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445, 834-842 (2007).
- Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
- Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
- Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
- Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
- Conner, D. A., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22 (2001).
- Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
- Myung, P., Ito, M. Dissecting the bulge in hair regeneration. J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
- McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
- Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
- Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
- Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
