Introduction
Открытие человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) произвела революцию в области регенеративной медицины, обеспечивая приемлемый метод для генерации конкретного пациента стволовых клеток 1-3. hiPSCs успешно генерируются из различных типов соматических клеток, включая фибробласты 4,5, 6,7 кроветворных клеток, почечных эпителиальных клеток из мочи 8 и кератиноцитов 9,10. На сегодняшний день, фибробласты кожи и гемопоэтические клетки представляют собой наиболее часто используемые источники клеток для генерации конкретного пациента ИПСК. Возможно, это связано с тем, что биопсия кожи и сбор крови обычные медицинские процедуры и большие биобанки из пациентов крови или кожи образцов были созданы во многих странах.
В отличие от клеток крови и фибробластов кожи, которые требуют инвазивных методов добычи, кератиноциты представляют собой легко доступный тип клеток для генерации hiPSC. KeratinocytЭС кератин богатые эпителиальные клетки, которые образуют внешний эпидермальный барьер кожи и также найдены в ногти и волосы 11. В частности, кератиноциты можно найти на внешней оболочки корня (ПРС) волосяных фолликулов, внешний слой клеточной, которая охватывает стержень волоса вместе с внутренней оболочки корня (IRS) клеток (12, Рис 1). Как коллекция волосы простая процедура, которая не требует помощи медицинского персонала, это дает возможность для пациентов, чтобы собрать и отправить свои собственные образцы волос в лаборатории, что позволит значительно облегчить сбор образцов пациентов для поколения hiPSC. Кератиноцитов эпидермиса также имеют более высокую эффективность перепрограммирования и более быструю кинетику перепрограммирования фибробластов по сравнению с, добавив к преимуществам использования кератиноциты в качестве исходных клеток для hiPSC поколения 9,13. Кроме того, hiPSCs также могут быть получены с использованием других клеточных популяций внутри волосяного фолликула,в том числе кожных сосочков клетки, находящиеся в базе волосяного фолликула 14,15.
Предыдущие доклады поколения IPSC, с помощью волос происхождения клетки часто используют ретровирусные или лентивирусные основе методов перепрограммирования 9,14,15. Тем не менее, эти вирусные методы вносят нежелательное геномной интеграции иностранных трансгенов во перепрограммирования. Для сравнения, использование Эписомные векторов представляет собой возможно, невирусный метод перепрограммирования генерировать интеграции, свободной ИПСК 4. Ранее мы уже разработали простой, экономически эффективный и невирусный метод эффективно перепрограммировать кератиноцитов в hiPSCs использованием Эписомные векторы 13. Здесь мы предлагаем подробный протокол для генерации кератиноцитов, полученных hiPSCs, в том числе при выводе из кератиноцитов сорвал волос, расширение и техническое обслуживание кератиноцитов и последующим перепрограммированием генерировать hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Коллекция человека образца волос от физических лиц требуется этическое одобрение комитета по этике человека в принимающих учреждений и должно быть сделано в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
1. Выделение кератиноцитов от щипковые волос
- Оттепель внеклеточного матрикса (ЕСМ) решение (т.е., Матригель) на льду O / N.
- Использование предварительно охлажденные наконечники, добавить 200 мкл раствора ECM 12 мл охлажденной DMEM / F12 среде. Пальто 12-луночного планшета с 1 мл разбавленного раствора ECM в каждую лунку. Инкубируйте покрытием пластины O / N при 37 ° С. Промыть пластины с покрытием предварительно нагретой DMEM / F12, перед использованием.
- Сбор первичной человеческие волосы с головы человека путем размещения пальцы близко к корню волоса и выщипывание волос в одном быстром и плавного движения. Проверьте, чтобы подтвердить, что каждый собрал волосы содержит нетронутыми волосяной фолликул и определить фазу роста волос ООНдер рассекает микроскоп (рис 1).
- Соберите 5-10 волосков с Анаген каждого человека, чтобы извлечь кератиноцитов. Процесс сорвал волосы как можно скорее, чтобы обеспечить успешное вывод кератиноцитов.
Примечание: На рисунке 1 показана морфология волос в разных фазах цикла роста. Анагенных волос в фазе роста, с видимого наружного слоя эпителия окружающей длину волос, известный как ОРС. С другой стороны, телогена волос представляет волосы в фазе покоя и не имеет видимых ПРС, но имеет четкую шар клеток, покрывающих корень волос, известный как телогена выпуклость.
- Соберите 5-10 волосков с Анаген каждого человека, чтобы извлечь кератиноцитов. Процесс сорвал волосы как можно скорее, чтобы обеспечить успешное вывод кератиноцитов.
- Поместите образцы волос в чашку Петри, содержащую 10 мл антибиотика Mix мыть в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Использование стерилизованные ножницы и пинцет, отрезать избыточного вал волос, оставляя волосы фрагмент с неповрежденной волосяного фолликула и около 0,5 - 1 см волос.
- Тщательно траnsfer 1 волосы фрагмента в каждую лунку ECM-покрытием пластины с помощью щипцов.
- Использование 1 мл пипетки, добавьте примерно 3 капли сыворотки замены нокаутом (КСР) среды (~ 100 - 200 мкл) в образцах волос.
Примечание: Имейте фрагменты волос в тесном контакте с поверхностью пластины, чтобы для прикрепления и последующего кератиноцитов вырост. Добавление чрезмерного СМИ на этом этапе может вызывает фрагменты волос, чтобы плавать и уменьшает шанс успешного прикрепления волос. - Инкубируйте образцы волос в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 и позволяют волосяные фолликулы, чтобы прикрепить O / N. На следующий день, осторожно добавить еще 3 капли KSR среды (~ 100 - 200 мкл), чтобы сохранить образцы волос влажным.
- Соблюдайте образцы волос ежедневно, чтобы подтвердить, что волосяные фолликулы приложил успешно. Вообще привязанность волосяных фолликулов проявляется в течение 1-3 дней. Толстые волосы, как правило, легче прикрепить сравнению с мелкими волосками, а волоски имеют высшеетенденция к плавать, которые мешают процессу присоединения.
- После того, как волосы были прикреплены к пластине с покрытием, добавьте 500 мкл KSR среды в скважину. Будьте особенно осторожны при добавлении в среду, как образцы волос, возможно, не подсоединен. С этой точки, изменить носитель каждые 2 дня.
Примечание: кератиноцитов наросты должны быть видны из ПРС области фрагмента волос через 3-7 дней (2А-В). Разрешить кератиноциты расти до 14 дней до пересева клеток, как описано в следующем разделе.
- После того, как волосы были прикреплены к пластине с покрытием, добавьте 500 мкл KSR среды в скважину. Будьте особенно осторожны при добавлении в среду, как образцы волос, возможно, не подсоединен. С этой точки, изменить носитель каждые 2 дня.
2. Техническое обслуживание и пассажи из кератиноцитов
- Предварительно пальто 6-луночного планшета с использованием набора Покрытие матрицы. Добавить 680 мкл разведения среды из комплекта в каждую лунку, после чего 6,8 мкл раствора покрытие матрицы. Встряхнуть пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение покрытия матричное решение на пластине.
- Разрешить пластины с покрытием инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. УдалитьРаствор для покрытия Матрица до посева кератиноцитов.
- Диссоциируют кератиноцитов в суспензии отдельных клеток с 500 мкл 0,25% трипсина на лунку в течение 2-5 мин при температуре 37 ° С. Инактивации трипсина с 500 мкл среды, содержащей сыворотку (например, эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), среднего) и собирают в стерильную пробирку 15 мл. Удалить волосы с помощью фрагмента стерилизованные щипцы.
- Определить количество собранных клеток с использованием гемоцитометра.
- Центрифуга клетки в течение 3 мин при 200 х г. Вымойте клеток с PBS и повторите центрифугирования. Аспирируйте PBS и ресуспендируют осадок клеток в свежей среде кератиноцитов.
- Тарелку 4 × 10 4 кератиноциты в одну лунку ECM-покрытием пластины в присутствии кератиноцитов среды. Держите кератиноцитов в 37 ° C инкубаторе с 5% СО 2 (рис 2С). Изменить Медиа каждый день, и прохождение клетки, когда культура ~ 80% сливной, бееч может занять около 2-7 дней в зависимости от скорости прохождения номер и пролиферации кератиноцитов. Полученные кератиноциты должна быть расширена, чтобы обеспечить достаточные запасы замороженных с использованием стандартных медленные заморозки методы криоконсервации 16.
Примечание: Описанные условия культивирования поддерживают расширение однородной популяции кератиноцитов с типичной морфологией булыжной (рис 2С). Иногда несколько дифференцированных кератиноцитов, с большой и плоской морфологии и потеряли репликативной потенциал, может наблюдаться в культуре. Характеристика кератиноцитов может быть выполнена с помощью иммунного окрашивания с использованием антител против цитокератином 14, как описано выше 17. Штатные линии кератиноцитов также должны быть проверены на микоплазмы после 1-3 проходов с использованием коммерчески доступного набора.
3. Генерация hiPSCs из кератиноцитов Использование эписомные векторы
- Предварительное покрытие 6-луночный планшет с0,1% желатина (2 мл / лунку). Разрешить желатин, чтобы покрыть, по крайней мере 20 мин при комнатной температуре.
- Для перепрограммирования эксперимента, использование кератиноциты не позднее прохода 6. диссоциируют не кератиноцитов в суспензии отдельных клеток в 1 мл 0,25% трипсина на лунку в течение 2-5 мин при температуре 37 ° С. Деактивировать трипсина с 1 мл среды, содержащей сыворотки (например, ФБС СМИ) и собирать в 15 мл трубки.
- Центрифуга клетки в течение 3 мин при 200g и ресуспендируют клеток в среде кератиноцитов. Пластинчатые 1 × 10 5 -1,5 × 10 5 кератиноциты на лунку в желированного пластины O / N.
- На следующий день (день 0), проверьте пластину, чтобы обеспечить клетки 50-60% вырожденная.
Примечание: Если кератиноциты менее ~ 50% сливной они, возможно, не хорошо расти после трансфекции. - На день 0, выполнить трансфекции эписомными перепрограммирования векторов на кератиноциты, используя отношение 8 мкл реагента для трансфекции 2 мкг общей плазмидной ДНК.
- Возьмите 0,5 мкг для каждого из 4 плазмид (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) и разбавить в 100 мкл восстановленного сыворотки среде (например, OPTI-MEM).
Примечание: плазмиды pCXLE-EGFP используется для мониторинга эффективности трансфекции в кератиноциты и не требуется для успешного перепрограммирования. - Добавить 8 мкл реагента для трансфекции с разбавленной ДНК. Смешайте щелкая трубки. Разрешить ДНК реакционную массу отдохнуть в покое при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Заменить среды кератиноцитов свежей средой.
- Аккуратно добавить реакции ДНК микс кератиноцитов культуры и инкубировать в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 4 ч.
Примечание: Не рекомендуется выполнять длительное трансфекции O / N в кератиноциты, как они проявляют низкая выживаемость после трансфекции. - После 4 ч после трансфекции, замените носитель кератиноцитов свежей средой.
- Возьмите 0,5 мкг для каждого из 4 плазмид (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) и разбавить в 100 мкл восстановленного сыворотки среде (например, OPTI-MEM).
- На 1 день (1 день после трансфекции), изменить кератиноцитов среду и проверить эффективность трансфекции путем оценки процент EGFP-позитивных клеток под флуоресцентным микроскопом. Обычно> 60-70% эффективности трансфекции наблюдается для первичных кератиноцитов, использующих этот протокол.
- На 2-й день, повторить трансфекции, как описано в шаге 3.5. Два последовательных трансфекции, как правило, достичь> 90% эффективности трансфекции. Кератиноцитов культура обычно достигает слияния к концу второй трансфекции.
- Подготовьте 10 см блюдо мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) подачи для каждой реакции перепрограммирования. Подготовка митотически инактивированные MEF питатели, как описано выше 18.
- Предварительно пальто 10 см блюдо с 5 мл 0,1% желатина, по крайней мере 20 мин. Плита 4 × 10 6 митотически инактивированной МЭФ за 10 см блюдо в FBS среде. Разрешить клетки урегулировать и приложите O / N в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
- На 3-й день, харжилет кератиноцитов с 0,25% трипсина, как описано в шаге 3.2 и 3.3. Ресуспендируют кератиноцитов в KSR среды и пластины 90% кератиноциты из 1 лунку 6-луночного планшета в 10 см MEF подающего сосуда с KSR среде.
- С Днем 4 года, изменить среду KSR каждый день.
- Кроме после Дня 18, заменить культуральной среды каждый второй день.
Примечание: Номера перепрограммировать кератиноциты перестанет размножаться, в то время как hiPSC колонии с определенной границы, которые напоминают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) будет появляться с 14 дня - 21.
- Кроме после Дня 18, заменить культуральной среды каждый второй день.
- Изолировать hiPSC колонии ручной рассечение из 21-й день года. Избегайте hiPSC колонии, которые тесно сгруппированы вместе и только выбрать hiPSC колонии, которые четко отделены от других.
Примечание: hiPSC колонии могут быть выбраны раньше, но колония с определенными границами, не может быть на более ранних временных точках очевидной, учитывая небольшой размер колонии. Эффективность перепрограммировать может варьироваться от дифференциалатакже влияют различны пациента кератиноциты, и других факторов, таких как количество прохода или скорости пролиферации кератиноцитов.- Для ручного рассечения hiPSC колоний, использовать 26G иглу, чтобы сократить hiPSC колонии под микроскопом рассекает. Вырезать колонию hiPSC на мелкие кусочки около 300 - 600 мкм в длину. Передача части из одной колонии hiPSC в новом MEF подачи пластины (2,5 × 10 4 MEF / см 2), чтобы установить клонального линию hiPSCs. Первоначально культуры друг hiPSC клональной линии в одну лунку 12-луночного планшета или орган культуральные чашки, а затем расширить до 6 формате луночного планшета.
- Поддержание установленных клоновых линий hiPSCs в КСР среды на MEF фидеров. После того, как культуры достигнут 70 - 80% слияния с hiPSC колоний ~ 1,5 мм в диаметре, прохождение hiPSCs использованием стандартных методов ферментативные пассажей (Accutase, диспазу или коллагеназы IV) в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
- Охарактеризовать установленную hiPSC линиис, чтобы подтвердить плюрипотентности и способность дифференцироваться в клетки представителя трех зародышевых листков в пробирке и / или в естественных условиях 13,19. Кроме того, регулярно испытываем установленные линии hiPSC для микоплазмы, используя имеющиеся в продаже наборы для обеспечения их патогена. Регулярно контролировать геномной стабильности hiPSC линий по кариотипирование или анализа на основе массива число копий изменение (ЦНВ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Волосы проходит через 3 разных стадиях цикла роста: анаген (фаза роста), катагена (фазовых регрессии) и телогена (фазы покоя) 20,21. Анагена волосяного фолликула содержит несколько слоев эпителия; эти слои включают ПРС, IRS и волоса (рисунок 1). Анаген волосы в конце концов подвергается переходу к катаген этапе, который отмечен апоптоза ПРС и прекращения дифференциации волоса. Наконец, катаген волосы переход к телогена фаза, где апоптоз прекращается и телогена фолликула становится покоя с характерным телогена выпуклость 20,21.
Рисунок 1 иллюстрирует морфологию волос телогена и анагена волос. Мы, как правило, используют анагена волосы для кератиноцитов выводе. После этого протокол, кератиноцитов наросты можно наблюдать уже в 3 дня после прикрепления волос (2А) и будет продолжать рroliferate (фиг.2В). По нашему опыту, некоторые анагена волосы могут не придавать или не заметить кератиноцитов вырост; Таким образом, собрать не менее 5 - 10 анагена волосы от каждого человека, чтобы обеспечить успешную изоляцию кератиноцитов. Впоследствии, кератиноциты можно пассировать на новый пластины и выдерживали в течение многих пассажей (фиг.2с). Важно отметить, что существует лучший рост кератиноцитов на покрытие матрицы с кератиноцитов среде, как описано в разделе 2, по сравнению с Матригель с KSR среде.
После расширения, кератиноциты можно перепрограммировать, чтобы генерировать hiPSCs, как описано в разделе 3. Рисунок 3А показан типичный кератиноцитов, полученных hiPSC колонию после 32 дней перепрограммирования. Это является общим для наблюдения некоторое дифференциацию в центре колонии hiPSC. После того, как вручную поднял, производные hiPSCs обычно проявляют высокую ядро к цитоплазматической отношение и определенной колонии связанногоичных (3В). Установленные клеточные линии hiPSCs могут быть охарактеризованы плюрипотентности, как описано выше 13,19, такие как выражение плюрипотентных маркеров Oct4, NANOG и TRA-160 (3С-Е).
Рисунок 1. Типичные изображения сорвал волос на разных стадиях роста. () Диаграмма, иллюстрирующая волосы в анагена или телогена фазы. Фазового контраста изображения, показывающие сорвал волосы в (B) фазе телогена и (C) фазе анагена. HS = стержень волоса; IRS = Внутренняя оболочка корневых; ПРС = Внешний корневого влагалища. Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Типичные изображения волос, полученных кератиноцитов. Фазового контраста изображения в сорванные волосы покрытием вниз по (а) 3 дней и (б) 10 дней. Белые стрелки отмечают разрастание кератиноцитов из сорвал волос. (С) фазового контраста изображения День 3 кератиноцитов культуры с типичной морфологией булыжной после пассирования. Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Типичные изображения кератиноцитов, полученных hiPSCs. () Фазового контраста изображения в день 32 перепрограммирования культуры, показывая кератиноцитов, полученных hiPSC сотрудничестваLony. (Б) Вручную выбран кератиноцитов, полученных hiPSCs морфологии, подобной ЭСК. Иммуноокрашивание hiPSCs с плюрипотентные маркеров (C) NANOG и (D) OCT4 и (Е) TRA-160 в кератиноцитов, полученных hiPSCs. Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генерация конкретного пациента hiPSCs предлагает уникальный подход к изучению патогенеза в пораженных типов клеток в пробирке, а также предоставляет платформу для скрининга лекарственных средств для идентификации новых молекул, которые могут спасти фенотипы болезни. Это заболевание моделирование подход с использованием hiPSCs дала обнадеживающие результаты для различных заболеваний, в том числе синдром длительного интервала QT, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз 22. Ряд инициатив уже ведутся, чтобы установить масштабные библиотеки конкретного пациента hiPSCs, в том числе консорциумов в США, Европе, Австралии, Китая, Южной Кореи и Японии 23,24.
Вот протокол, чтобы установить hiPSCs от волос, полученных кератиноцитов описано, которая имеет потенциал, чтобы облегчить и быстро отслеживать создание крупномасштабных библиотек конкретных заболеваний hiPSCs. Этот протокол имеет два преимущества: во-первых, ЭписомныеСистема используется в данном протоколе генерирует интеграции, свободной hiPSCs использованием коктейль из шести перепрограммирования факторов (Oct4, SOX2, KLF4, L-MYC, Lin28, shRNA р53) при относительно высокой эффективностью 4. По сравнению с ретровирусных или лентивирусных-опосредованной методов перепрограммирования, использование эписомальном вектора избежать нежелательного геномной интеграции иностранных трансгенов во время перепрограммирования., Таким образом, многие инициативы выступают за использование интеграционных бесплатно методов перепрограммирования для создания крупномасштабных hiPSC библиотек, таких как эписомные векторы, вирус Сендай или мРНК, на интегративных методов перепрограммирования 23.
Во-вторых, волосы легко доступны и могут быть собраны с помощью самих пациентов без использования инвазивных процедур или посещения медицинских сотрудников. Это дает уникальную возможность для пациентов из разных регионов по сбору и почты в своих образцах волос в лабораторию для кератиноцитов выводе и последующем перепрограммировании, В поддержку целесообразности этой стратегии, наши неопубликованные данные показывают, что кератиноциты могут быть успешно изолированы от щипнувшей волос, хранили при 4 ° С в течение до 10 дней.
Методология, описанная здесь позволит вывод кератиноцитов от сорвал волос. В то время как кератиноциты могут быть получены из только одного волоса, мы рекомендуем, чтобы собрать по меньшей мере 5 анагена волосы для вывода кератиноцитов. Одним из ограничений этого протокола является то, что некоторые волосы не могут приложить также и кератиноциты может не расти. Более толстые волосы, как правило, чтобы прикрепить лучше, в то время как тонкие волосы требуется пониженное количество культуральной среде в течение покрытие, чтобы избежать плавающей и повышения вложение. После того, как кератиноциты выводятся, желательно, чтобы расширить и заморозить вниз акции с использованием стандартных медленные заморозки методы криоконсервации 16. После перепрограммирования кератиноцитов может быть выполнена следующие шаги, описанные в данном протоколе. Это важнообратите внимание, что скорость пролиферации исходных клеток может влиять на эффективность перепрограммирования, со снижением эффективности перепрограммирования наблюдается в поздних пассажах, как клетки достигают клеточное старение 25-27. В связи с этим, не использовать кератиноциты не позднее прохода 6 для перепрограммирования экспериментов. Кроме того, эффективность перепрограммирования может варьироваться от кератиноцитов различных личности.
Последние исследования показывают, широкое генетическое мозаичность в нескольких типов соматических тканях 28, с ~ 30% фибробластов кожи сообщается, соматическая ВКК в геноме 29. Эти ВКК могут быть вызваны ошибками в репликации, репарации ДНК или мобилизации транспозонов. Также возможно, что длительное воздействие УФ-излучением на кожу может вызвать дополнительные ВКК в эпидермальных клеток, включая фибробласты и кератиноциты, но степень этого не изучены. Как ВКК в кератиноциты будут перенесены в процессе перепрограммирования, это имВАЖН выполнять рутинную кариотипирование или анализ CNV чтобы гарантировать, что установленные hiPSCs поддерживать геномную стабильность. Таким образом, здесь мы описали процедуры для генерации hiPSCs от волос, полученных кератиноцитов, которые могут быть использованы для моделирования заболеваний и регенеративной медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).
- Fuchs, E.
- Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
- Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
- Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
- Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
- Conner, D. A., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22 (2001).
- Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
- Myung, P., Ito, M.
- Alonso, L., Fuchs, E.
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
- McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
- Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
- Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
- Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
