Introduction
La découverte de cellules souches pluripotentes humaines induites (de hiPSCs) a révolutionné le domaine de la médecine régénérative, fournissant une méthode possible pour la production de cellules souches spécifiques à des patients 1-3. hiPSCs ont été générés avec succès à partir de divers types de cellules somatiques, y compris des fibroblastes, des cellules hématopoïétiques de 4,5 à 6,7, les cellules epitheliales rénales à partir de l'urine et des kératinocytes 8 9,10. À ce jour, les fibroblastes de la peau et des cellules hématopoïétiques représentent les sources de cellules les plus couramment utilisés pour générer des CSPi spécifiques au patient. Sans doute, cela est dû au fait que les biopsies de la peau et de la collecte de sang sont des procédures médicales de routine et de grandes biobanques d'échantillons de sang ou de la peau des patients ont été établis dans de nombreux pays.
Contrairement aux cellules sanguines et les fibroblastes de la peau qui exigent des méthodes d'extraction envahissantes, les kératinocytes représentent un type cellulaire facilement accessible pour la génération hiPSC. Keratinocytes sont des cellules épithéliales de kératine riche qui forment la barrière épidermique extérieure de la peau et l'on retrouve également dans les ongles et les cheveux 11. En particulier, les kératinocytes peuvent être trouvés sur la gaine externe de la racine (SRO) des follicules pileux, une couche externe cellulaire qui couvrait la tige du cheveu avec la gaine intérieure de racine (IRS) des cellules (12, figure 1). Comme la collecte de cheveux est une procédure simple qui ne nécessite pas l'assistance du personnel médical, il fournit une occasion pour les patients de recueillir et d'envoyer leurs propres échantillons de cheveux pour les laboratoires, ce qui faciliterait grandement la collecte des échantillons de patients pour la génération hiPSC. kératinocytes épidermiques ont également une efficacité de reprogrammation ultérieure et cinétique rapide de reprogrammation par rapport à des fibroblastes, en ajoutant aux avantages de l'utilisation des kératinocytes comme cellules de départ pour la production hiPSC 9,13. En outre, hiPSCs peut également être générée à l'aide d'autres populations de cellules au sein du follicule pileux,y compris les cellules de papilles dermiques situés à la base de la 14,15 du follicule pileux.
Les rapports précédents de génération iPSC utilisant des cellules de cheveux dérivé utilisent souvent des méthodes de reprogrammation rétroviraux ou à base de lentivirus 9,14,15. Cependant, ces procédés introduisent intégration génomique virale de transgènes étrangers indésirables lors de la reprogrammation. En comparaison, l'utilisation de vecteurs épisomiques représente un procédé de reprogrammation est possible, non viral pour générer iPSCs libre rapprochement 4. Nous avons déjà mis au point une méthode simple, rentable et non virale pour reprogrammer efficacement kératinocytes en hiPSCs utilisant des vecteurs épisomiques 13. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la génération de hiPSCs de kératinocytes dérivés, y compris la dérivation de kératinocytes à partir de cheveux pincées, l'expansion et le maintien des kératinocytes et la reprogrammation ultérieure de générer hiPSCs.
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Protocol
La collection de l'échantillon de cheveux humains de personnes nécessite l'approbation éthique par le comité d'éthique de la recherche humaine dans les établissements d'accueil et doit être fait en conformité avec les directives institutionnelles.
1. Isolement de kératinocytes à partir de pileux épilé
- Thaw matrice extracellulaire (ECM) (c.-à-Matrigel) sur la glace O / N.
- En utilisant des pointes de pipette pré-réfrigérés, ajouter 200 solution ECM ul à 12 ml de milieu DMEM réfrigérés / F12. Manteau une plaque de 12 puits avec 1 ml de solution d'ECM dilué dans chaque puits. Incuber la plaque O / N couché à 37 ° C. Laver la plaque revêtue avec / milieu F12 DMEM préchauffé avant utilisation.
- Recueillir cheveu humain primaire à partir de la tête de l'individu en plaçant les doigts à proximité de la racine des cheveux et plumer les cheveux dans un mouvement rapide et lisse. Vérifiez pour confirmer que chaque cheveux collectés contient un follicule pileux intacts et déterminer la phase de l'ONU de cheveux de croissanceder un microscope à dissection (figure 1).
- Recueillir 5-10 poils anagène de chaque individu pour extraire les kératinocytes. Processus arraché les poils dès que possible pour assurer la dérivation réussie de kératinocytes.
Remarque: La figure 1 illustre la morphologie des poils dans les différentes phases du cycle de croissance. Cheveux anagène se trouve dans la phase de croissance, avec une couche extérieure visible de l'épithélium entourant la longueur des cheveux, connu sous le nom de SRO. D'autre part, les cheveux télogène représente cheveux en phase de repos et ne pas avoir un ORS visibles, mais il a une boule claire de cellules couvrant la racine des cheveux, connu sous le renflement télogène.
- Recueillir 5-10 poils anagène de chaque individu pour extraire les kératinocytes. Processus arraché les poils dès que possible pour assurer la dérivation réussie de kératinocytes.
- Placez les échantillons de cheveux dans une boîte de Pétri contenant 10 ml de mélange antibiotique se laver pendant 5 min à température ambiante.
- Avec des ciseaux et des pinces stérilisées, couper l'arbre de cheveux excessive, laissant un fragment de cheveux avec un follicule pileux intacts et autour de 0,5 à 1 cm de tige du cheveu.
- Tra attentivementnsfer fragment 1 de cheveux dans chaque puits de la plaque revêtue de l'ECM en utilisant une pince.
- L'utilisation d'une pipette de 1 ml, ajouter environ 3 gouttes de sérum Knockout remplacement (KSR) moyen (~ 100 - 200 pi) à des échantillons de cheveux.
Remarque: Gardez les fragments de cheveux en contact étroit avec la surface de la plaque pour permettre l'attachement et kératinocytes ultérieure excroissance. Ajout de médias excessive à cette étape peut provoque les fragments de cheveux flotter et diminue la chance de l'attachement de cheveux réussie. - Incuber les échantillons de cheveux dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de permettre aux follicules pileux pour attacher O / N. Le jour suivant, ajouter doucement 3 gouttes d'un autre moyen KSR (~ 100 - 200 pi) pour maintenir les échantillons de cheveux humide.
- Respecter les échantillons de cheveux tous les jours pour confirmer que les follicules pileux ont attaché avec succès. Généralement attachement des follicules pileux est apparente dans les 1-3 jours. Poils épais sont généralement plus facile à fixer par rapport à poils fins, comme les poils fins ont élevétendance à flotter qui entravent le processus de fixation.
- Une fois que les cheveux ont fixé à la plaque revêtue, ajouter 500 ul de milieu KSR au puits. Redoublez de prudence lors de l'ajout du milieu comme des échantillons de cheveux peuvent ne pas avoir attachée fermement. De ce point, changer de support tous les 2 jours.
Remarque: excroissances kératinocytes doivent être visibles de la région ORS du fragment de cheveux après 3-7 jours (Figure 2A-B). Autoriser les kératinocytes de croître jusqu'à 14 jours avant repiquage des cellules comme décrit dans la section suivante.
- Une fois que les cheveux ont fixé à la plaque revêtue, ajouter 500 ul de milieu KSR au puits. Redoublez de prudence lors de l'ajout du milieu comme des échantillons de cheveux peuvent ne pas avoir attachée fermement. De ce point, changer de support tous les 2 jours.
2. Maintenance et repiquage des kératinocytes
- Pré-enduire une plaque de 6 puits en utilisant le kit de revêtement Matrix. Ajouter 680 ul de milieu de dilution de la trousse à chaque puits, suivis par 6,8 ul de solution de revêtement Matrix. Agiter la plaque pour assurer une distribution uniforme de la solution de matrice de revêtement sur la plaque.
- Laisser la plaque revêtue à incuber pendant 30 min à température ambiante. Supprimerla solution de revêtement matrice avant le placage des kératinocytes.
- Dissocier les kératinocytes dans une suspension cellulaire unique avec 500 pi de trypsine à 0,25% par puits pour 2-5 min à 37 ° C. Inactiver la trypsine avec 500 ul de milieu contenant du sérum (par exemple, sérum bovin fœtal (FBS) Moyen) et recueillir dans un tube de 15 ml stérile. Retirer le fragment de cheveux à l'aide des pinces stérilisées.
- Déterminer le nombre de cellules récoltées à l'aide d'un hémocytomètre.
- Centrifuger les cellules pendant 3 minutes à 200 x g. Laver les cellules avec du PBS et centrifugation répétition. Aspirer le PBS et remettre le culot de cellules dans un milieu de kératinocytes frais.
- Plate baisse de 4 × 10 4 kératinocytes dans un puits de la plaque d'ECM-revêtue de la présence d'un milieu de kératinocytes. Garder les kératinocytes dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 (figure 2C). Changer de support tous les cellules de jour et de passage lorsque la culture est ~ 80% de confluence, WHIch peut prendre environ 2-7 jours en fonction du nombre de passage et la prolifération des kératinocytes taux. Les kératinocytes dérivés devraient être élargis pour générer des stocks congelés suffisant en utilisant les méthodes de cryoconservation congélation lente standards 16.
Remarque: Les conditions de culture décrites soutenir l'expansion de la population homogène de kératinocytes avec la morphologie typique pavée (figure 2C). Parfois, quelques kératinocytes différenciés, avec une morphologie large et plat et ont perdu potentiel réplicatif, peuvent être observées dans la culture. Caractérisation des kératinocytes peut être effectuée par immunocoloration en utilisant des anticorps contre la cytokératine 14 17 comme décrit précédemment. Des lignées cellulaires de kératinocytes établis doivent également être testés pour mycoplasmes après 1-3 passages en utilisant le kit disponible dans le commerce.
3. Génération de hiPSCs de kératinocytes Utilisation épisomique Vecteurs
- Pré-enduire une plaque de 6 puits avec0,1% de gélatine (2 ml / puits). Autoriser la gélatine pour enrober pendant au moins 20 min à température ambiante.
- Pour l'expérience de reprogrammation, utilisation kératinocytes plus tard passage 6. Dissocier les kératinocytes dans une suspension cellulaire unique avec 1 ml de trypsine à 0,25% par puits pendant 2-5 min à 37 ° C. Inactiver la trypsine avec 1 ml de milieu contenant du sérum (par exemple, les médias FBS) et recueillir dans un tube de 15 ml.
- Centrifuger les cellules pendant 3 min à 200 cellules XG et remettre en suspension dans un milieu de kératinocytes. Planche 1 × 10 × 10 5 -1.5 5 kératinocytes par puits dans une plaque O / N gélatinisé.
- Le jour suivant (jour 0), vérifier la plaque pour assurer cellules sont 50-60% de confluence.
Remarque: Si les kératinocytes sont moins de ~ 50% de confluence ils pourraient ne pas bien grandir après la transfection. - Le jour 0, effectuer la transfection des vecteurs épisomiques de reprogrammation sur les kératinocytes, en utilisant un rapport de 8 pi de réactif de transfection à 2 pg d'ADN de plasmide totale.
- Prenez 0,5 pg pour chacun des 4 plasmides (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) et diluer dans 100 pi de milieu de sérum réduit (par exemple, OPTI-MEM).
Remarque: Le plasmide pCXLE-eGFP est utilisé pour surveiller l'efficacité de transfection dans les kératinocytes et est pas nécessaire pour la reprogrammation de succès. - Ajouter 8 ul de réactif de transfection de l'ADN dilué. Mélanger en tapotant le tube. Laisser le mélange réactionnel reposer à l'ADN intact à température ambiante pendant 15 min.
- Remplacez le support des kératinocytes avec du milieu frais.
- Ajouter doucement le mélange de réaction de l'ADN à la culture des kératinocytes et incuber dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 4 heures.
Remarque: Il est recommandé de ne pas effectuer la transfection prolongée O / N dans les kératinocytes comme ils présentent une faible survie post-transfection. - Après 4 heures post-transfection, remplacer le milieu des kératinocytes avec du milieu frais.
- Prenez 0,5 pg pour chacun des 4 plasmides (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) et diluer dans 100 pi de milieu de sérum réduit (par exemple, OPTI-MEM).
- Le Jour 1 (1 jour post-transfection), changer le milieu de kératinocytes et de vérifier l'efficacité de transfection en estimant le pourcentage de cellules positives eGFP sous un microscope à fluorescence. Typiquement> 60-70% d'efficacité de transfection est observée pour les kératinocytes primaires en utilisant ce protocole.
- Le jour 2, répéter transfection comme décrit dans l'étape 3.5. Deux transfections consécutifs seraient typiquement atteindre> 90% d'efficacité de transfection. culture de kératinocytes atteint généralement confluence avant la fin de la seconde transfection.
- Préparer un plat de 10 cm de la souris fibroblastes embryonnaires (MEF) chargeur pour chaque réaction de reprogrammation. Préparer mangeoires MEF mitotiquement inactivés comme décrit précédemment 18.
- Pré-couche d'un plat de 10 cm avec 5 ml de 0,1% de gélatine pendant au moins 20 min. Planche 4 × 10 6 MEF mitotiquement inactivé par boîte de 10 cm dans un milieu FBS. Laisser les cellules se déposer et se fixent O / N dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Le Jour 3, haracquises les kératinocytes avec 0,25% de trypsine comme décrit dans l'étape 3.2 et 3.3. Reprendre les kératinocytes dans un milieu KSR et de la plaque de 90% de kératinocytes à partir de 1 puits d'une plaque à 6 puits dans un plat d'alimentation MEF 10 cm avec un milieu KSR.
- Partir du jour 4., changer le milieu KSR chaque jour.
- Alternativement après Jour 18, remplacer le milieu de culture tous les deux jours.
Remarque: les kératinocytes non reprogrammé cesseront de proliférer, alors que les colonies hiPSC avec limite définie qui ressemblent à des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) apparaîtront à Jour 14 - 21 ans.
- Alternativement après Jour 18, remplacer le milieu de culture tous les deux jours.
- Isoler colonies hiPSC par dissection manuelle de Jour 21 partir. Évitez les colonies hiPSC qui sont étroitement regroupés ensemble et ne ramassent colonies hiPSC qui sont clairement séparés des autres.
Note: colonies de hiPSC peuvent être récupérés plus tôt, mais la colonie avec des frontières définies pourraient ne pas être évidente à des moments antérieurs étant donné la petite taille de la colonie. l'efficacité de reprogrammation peuvent varier entre les différents kératinocytes du patient, et est aussi influencée par d'autres facteurs tels que le nombre de passage ou le taux de kératinocytes de prolifération.- Pour la dissection manuelle de colonies hiPSC, utiliser une aiguille de 26G à couper colonies hiPSC sous un microscope de dissection. Couper une colonie hiPSC en petits morceaux autour de 300 à 600 mm de longueur. Transférer les morceaux d'une colonie hiPSC dans une nouvelle plaque d'alimentation MEF (2,5 × 10 4 MEF / cm 2) pour établir une ligne clonale de hiPSCs. Initialement, la culture de chaque lignée clonale hiPSC dans un puits d'une plaque de 12 plats ou de la culture d'organes ainsi, puis développez à 6 format de plaque bien.
- Maintenir lignées clonales de hiPSCs établies en milieu KSR sur mangeoires MEF. Une fois la culture atteindre 70 à 80% de confluence avec des colonies hiPSC ~ 1,5 mm de diamètre, hiPSCs de passage en utilisant des procédés enzymatiques standards de passages (Accutase, la dispase ou la collagénase IV) selon les instructions du fabricant.
- Caractériser ligne hiPSC établis pour confirmer la pluripotence et leur capacité à se différencier en cellules représentatives des trois feuillets embryonnaires in vitro et / ou in vivo 13,19. En outre, les lignes hiPSC analysent l'régulièrement établis pour mycoplasmes en utilisant des kits disponibles dans le commerce pour assurer qu'ils sont exempts de pathogènes. Surveiller régulièrement la stabilité du génome de lignes hiPSC par caryotype ou basée sur la baie nombre de copies variation (CNV) analyse.
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Representative Results
Les cheveux passe par trois phases différentes de cycle de croissance: anagène (phase de croissance), catagène (phase de régression) et télogène (phase de repos) 20,21. Le follicule pileux anagène contient de multiples couches de l'épithélium; ces couches comprennent les SRO, IRS et l'arbre des cheveux (Figure 1). Cheveux anagène finalement subit une transition à la phase catagène, qui est marquée par l'apoptose des SRO et la cessation de la différenciation de l'arbre de cheveux. Enfin, catagène transition de cheveux en phase télogène, où cesse l'apoptose et le follicule télogène devient de repos avec un télogène caractéristique renflement 20,21.
La figure 1 illustre la morphologie d'un cheveu télogène et un cheveu anagène. Nous utilisons généralement les cheveux anagène pour kératinocytes dérivation. Suite à ce protocole, des excroissances de kératinocytes peuvent être observées dès que 3 jours après la fixation de cheveux (figure 2A) et continueront à proliferate (figure 2B). Dans notre expérience, quelques poils anagène peuvent échouer d'attacher ou de manquer d'observer kératinocytes excroissance; ainsi recueillir au moins 5 - 10 poils anagène de chaque individu pour assurer l'isolation des kératinocytes succès. Par la suite, les kératinocytes peuvent être soumises à des passages sur une nouvelle plaque et maintenues pendant de multiples passages (figure 2C). Il est important de noter qu'il ya une meilleure croissance des kératinocytes sur une matrice de revêtement avec le milieu des kératinocytes comme décrit dans l'article 2, par rapport à Matrigel avec le milieu KSR.
Après l'expansion, les kératinocytes peuvent être reprogrammées pour générer hiPSCs comme décrit dans la section 3. La figure 3A montre une hiPSC colonie de kératinocytes dérivés typique après 32 jours de reprogrammation. Il est fréquent d'observer une certaine différenciation au centre de la colonie hiPSC. Une fois cueillies manuellement, les hiPSCs dérivés affichent généralement élevée noyau pour cytoplasmique et une colonie définie liéeaire (figure 3B). Des lignées cellulaires établies de hiPSCs peuvent ensuite être caractérisés par la pluripotence 13,19, comme décrit précédemment, tel que l'expression de marqueurs pluripotentes OCT4, NANOG et TRA-160 (Figure 3C-E).
Figure 1. Des images représentatives de poils arrachés à différents stades de croissance. (A) Schéma illustrant poils en phase anagène ou télogène. des images à contraste de phase montrant un pileux épilé en (B) la phase télogène et (C) la phase anagène. HS = arbre de cheveux; IRS = Inner Racine gaine; SRO = Outer Racine gaine. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Des images représentatives de kératinocytes de cheveux dérivé. Images à contraste de phase d'un cheveu arraché plaqué bas pour (A) 3 jours et (B) 10 jours. Les flèches blanches marquent l'excroissance de kératinocytes à partir d'un cheveux arrachés. De contraste d'image (C) de la phase de la Journée 3 culture de kératinocytes avec une morphologie typique pavée après repiquage. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Des images représentatives de hiPSCs de kératinocytes dérivés. (A) l'image de contraste de phase d'une reprogrammation de la culture Journée 32 montrant une co hiPSC des kératinocytes dérivéslony. (B) sélectionné manuellement hiPSCs de kératinocytes dérivés avec une morphologie similaire à CSEh. Immunocoloration de hiPSCs avec des marqueurs pluripotentes (C) et NANOG (D) OCT4 et (E) TRA-160 en hiPSCs de kératinocytes dérivés. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Génération de hiPSCs spécifiques au patient offre une approche unique pour l'étude de la pathogenèse dans les types de cellules malades in vitro, et fournit également une plate-forme pour le criblage de médicaments pour identifier de nouvelles molécules qui peuvent sauver les phénotypes de la maladie. Cette approche de modélisation de la maladie en utilisant hiPSCs a donné des résultats prometteurs pour une variété de maladies, y compris le syndrome du QT long, la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique 22. Plusieurs initiatives sont déjà en cours pour établir des bibliothèques à grande échelle de hiPSCs spécifiques du patient, y compris les consortiums aux Etats-Unis, l'Europe, l'Australie, la Chine, la Corée du Sud et le Japon 23,24.
Voici un protocole pour établir hiPSCs à partir de kératinocytes cheveux dérivés est décrit, qui a le potentiel de faciliter et d'accélérer la création de bibliothèques à grande échelle de hiPSCs maladies spécifiques. Ce protocole offre deux avantages: d'abord, le épisomiquesystème utilisé dans ce protocole génère hiPSCs libre-intégration en utilisant un cocktail de six facteurs de reprogrammation (OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shRNA pour p53) à rendement relativement élevé 4. Comparé aux méthodes de reprogrammation rétroviraux ou lentivirus médiation, l'utilisation de vecteur épisomique évite intégration génomique indésirable de transgènes étrangers lors de la reprogrammation., Par conséquent, de nombreuses initiatives favorisent l'utilisation de méthodes de reprogrammation sans intégration pour création de bibliothèques hiPSC à grande échelle, tels que vecteurs épisomiques, le virus de Sendai ou d'ARNm, par rapport aux méthodes de reprogrammation d'intégration 23.
Deuxièmement, les cheveux est facilement accessible et peut être récolté par les patients eux-mêmes, sans l'utilisation de procédures invasives ou la présence de personnel médical. Cette offre une occasion unique pour les patients de différentes régions de collecter et de messagerie dans leurs propres échantillons de cheveux au laboratoire pour kératinocytes dérivation et reprogrammation ultérieure. À l'appui de la faisabilité de cette stratégie, nos données non publiées indiquent que les kératinocytes peuvent être isolés avec succès à partir de cheveux pincées qui a été stocké à 4 ° C pendant jusqu'à 10 jours.
La méthodologie décrite ici permettra la dérivation de kératinocytes à partir de cheveux arrachés. Alors que les kératinocytes peuvent être tirés de juste un seul cheveu, notre recommandation est de recueillir au moins 5 poils anagène pour kératinocytes dérivation. Une limitation de ce protocole est que certains poils peuvent pas attacher bien et les kératinocytes peuvent pas se développer. Cheveux plus épais tend à attacher pour mieux, tandis que les cheveux fins nécessite quantité réduite de milieu de culture pendant le placage pour éviter flottant et améliorer la fixation. Une fois que les kératinocytes sont dérivés, il est conseillé d'élargir et de geler les stocks bas en utilisant des méthodes de cryoconservation congélation lente standards 16. Reprogrammation ultérieure de kératinocytes peut être effectuée étapes suivantes décrites dans le présent protocole. C'est important denoter que le tarif des cellules à partir de la prolifération peut affecter l'efficacité de la reprogrammation, avec une efficacité de reprogrammation diminué observée dans les passages fin que les cellules atteignent la sénescence cellulaire 25-27. À cet égard, en utilisant des kératinocytes au plus tard passage 6 pour des expériences de reprogrammation. En outre, l'efficacité de reprogrammation peuvent varier entre les kératinocytes de différents individuels.
Des études récentes suggèrent mosaïcisme génétique répandue dans plusieurs types de tissus somatiques 28, avec environ 30% des fibroblastes cutanés rapportés d'avoir somatique CNV dans le génome 29. Ces CNV peuvent être causés par des erreurs dans la réplication de l'ADN, réparation de l'ADN ou de la mobilisation de transposon. Il est également possible que l'exposition prolongée aux UV sur la peau peut provoquer CNV supplémentaires dans les cellules épidermiques, y compris les fibroblastes et les kératinocytes, mais l'étendue de la présente ne soit pas bien comprise. Comme CNV dans kératinocytes seront reportés au cours du processus de reprogrammation, il est important à effectuer l'analyse du caryotype routine ou CNV faire en sorte que les hiPSCs établis maintenir la stabilité génomique. En résumé, nous avons décrit ici procédures pour la génération de hiPSCs de kératinocytes dérivés de cheveux, qui pourraient être utilisés pour la modélisation de la maladie et de la médecine régénératrice.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
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