Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Levering av proteiner, peptider eller celle-ugjennomtrengelig små molekyler inn i levende celler ved inkubasjon med den Endosomolytic Reagens dfTAT

Published: September 2, 2015 doi: 10.3791/53175
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Abstract

Macromolecular levering strategier vanligvis utnytte endocytoseveien som en rute av mobilnettet oppføring. Men endosomale entrapment sterkt begrenser effektiviteten som makromolekyler trenge gjennom cytosolisk plass av celler. Nylig har vi omgå dette problemet ved å identifisere reagensen dfTAT, en disulfidbinding dimer av peptidet TAT merket med fluorofor tetramethylrhodamine. Vi har generert en fluorescensmerket dimer av det prototypiske celle-gjennomtrengende peptid (CPP) TAT, dfTAT, som trenger inn i levende celler, og når den cytosoliske plass av celler med en spesielt høy effektivitet. Cytosoliske levering av dfTAT oppnås i flere cellelinjer, inkludert primære celler. Videre betyr levering ikke merkbart påvirke cellenes levedyktighet, spredning eller genuttrykk. dfTAT kan levere små molekyler, peptider, antistoffer, biologisk aktive enzymer og en transkripsjonsfaktor. I denne rapporten beskriver vi protokollene involvert i dfTAT syntese og cellulær levering. Manuskriptet beskriver hvordan du styrer mengden protein levert til cytosolic plass av celler ved å variere mengden protein administreres ekstracellulært. Endelig er de aktuelle begrensninger av denne nye teknologien og trinnene involvert i å validere levering diskutert. De beskrevne protokollene bør være svært nyttig for cellebaserte analyser, så vel som for ex vivo manipulering og omprogrammering av celler.

Introduction

Levering av proteiner, peptider eller celle ugjennomtrengelig små molekyler i levende celler er ofte ønskelig i mange biologiske eller bioteknologiske applikasjoner (mobil bildebehandling, funksjonelle analyser, cellular omprogrammering, osv.) 1-4. Mange leverings tilnærminger har allerede blitt rapportert, inkludert mikroinjeksjon, elektroporering, eller bruk av bærermidler (f.eks., Cellepenetrerende peptider slik som TAT, lipider) 5-7. Hver teknikk vanligvis har spesifikke fordeler og ulemper som kan gjøre disse tilnærmingene tilstrekkelig for enkelte programmer, men ikke for andre. Vanlige problemer bære dårlig levering effektivitet og / eller manglende kontroll med hvor mye materiale er levert 8,9, giftighet eller skadelige fysiologisk innvirkning 10,11, mangel på time kontroll, levering i noen få celler, men ikke i en hel befolkning (f.eks., mikroinjeksjon) 12, og kompleks kjemisk konjugering eller formulerings ordninger 11.

s = "jove_content"> Nylig har vi utviklet en ny levering strategi som omgår disse begrensningene. Denne strategien er avhengig av et peptid heter dfTAT (dimer fluorescerende TAT) 13. dfTAT er avledet fra det godt kjent celle-gjennomtrengende peptid (CPP) TAT. dfTAT inneholder to disulfid-bundet kopier av TAT merket med fluorofor tetramethylrhodamine. Til tross for sine likheter, TAT og dfTAT signifikant forskjellig i aktivitet. TAT er vanligvis internalisert inn i cellene ved endocytose. Dette CPP forblir imidlertid det meste fanget inne endosomes (dette vanligvis føre til en punktformet fordeling av peptidet inni cellene ved undersøkelse av fluorescens mikroskopi). Som TAT, er dfTAT effektivt gjennom endocytose av celler. Men det betyr dfTAT ikke bli fanget inne endosomes. I stedet, medierer den endosomale lekkasje på en måte som er meget effektiv. Den endosomolytic aktivitet av dfTAT kan da utnyttes for å levere makromolekyler ved en enkel inkubasjon assay.

ntent "> Den nåværende forståelse av leveringsprosessen er som følger. dfTAT induserer macropinocytosis. Som et resultat av celler inkubert med dfTAT ta opp løselige proteiner, peptider eller små molekyler (molekyler av interesse, MOI) som er tilstede i mediene av væskefase endocytose (se figur 1). Interaksjoner mellom dfTAT og MOI er ikke nødvendig så lenge som begge enheter trafikk sammen i endocytoseveien. Som dfTAT når en viss terskelverdi i lumen av endocytiske organeller, uttrykker den sin endosomale lekkasje aktivitet (de molekylære detaljer gjenstår å bli fullstendig karakterisert). Innholdet i lumen av utett organeller, og derfor MOI, blir deretter sluppet inn i cellene. Denne fremgangsmåten er derfor meget praktisk da det ikke konjugering eller formulerings ordninger med MOI er nødvendig. Dessuten, fordi dfTAT er ikke direkte å modifisere en MOI, bør det heller ikke forstyrre mois funksjon når intracellulær levering oppnås. I tillegg er konsentrasjonen avdfTAT brukt levering er uavhengig av at av MOI i media. For eksempel kan dfTAT konsentrasjonen holdes konstant mellom forskjellige eksperimenter for å sikre reproduserbare effektivitet i endosomale lekkasje. I kontrast, kan konsentrasjonen av MOI i media bli gradvis endret for å oppnå ønskede nivåer av MOI levert i cytosol.

Den høye endosomale lekkasje effektivitet oppnås med dfTAT er bemerkelsesverdig ufarlige til mange av cellene testet til dags dato. Dette er et overraskende fordi endocytiske organeller er viktige bestanddel av cellene, og man ville forvente at den dramatiske lekkasje mediert av dfTAT ville bli ledsaget av skadelige, cellulære responser. Likevel, behandlede celler spre i samme takt som ubehandlede celler og viser ikke noen vesentlige endringer i deres transkriptom. Videre kan levering bli gjentatt i løpet av minutter med reproduserbare levering effektivitet, noe som indikerer at cellene kan enten tolerere eller gjenopprette fra leveringsprosessen uten å mistederes evne til endocytose eller endosomale lekkasje. Subtile cellulære responser kan skje i løpet dfTAT levering og de molekylære detaljene av hva disse svarene kan være å bli utforsket. Likevel, ved å kombinere høy effektivitet, bekvemmelighet av protokoller, og mangel på toksisitet, bør dette arrangementet tilnærmingen vise seg umiddelbart nyttig i mange cellebaserte applikasjoner. Protokollene som presenteres her, er rettet mot å gjøre denne teknologien tilgjengelig for forskersamfunnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthesis

Merk: dfTAT fremstilles i to trinn: syntese av monomer fTAT ved fastfase-peptidsyntese, etterfulgt av disulfidbinding dimerisering for å danne dfTAT.

  1. Svelle 500 mg av banen amid MBHA-harpiks i dimetylformamid (DMF) i en standard 50 ml SPPS fartøyet i 1 time.
  2. Utføre fjerning av Fmoc etter inkubering av Fmoc beskyttede harpiksen i en 20% piperidin-løsning (20% piperidin i DMF, 10 ml (0,30 mmol). Utfør avbeskyttelsestrinn to ganger (1 x 5 min og 1 x 15 min) med et vasketrinn ved hjelp DMF (vasketrinnet omfatter å skylle harpiksen flere ganger med et totalvolum på ca. 150 ml DMF og fjerning av løsningsmidlet ved vakuumfiltrering) på mellom reaksjonene.
  3. Syntetisere CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) på banen amid MBHA harpiks. Bruk følgende Fmoc beskyttede aminosyrer: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (kun på N-terminus), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, og Fmoc-Cys (Trt) -OH. Utføre reaksjonen ved bruk av N-2 (20 PSI) å agitere reaksjonsblandingen. Utføre alle reaksjoner på RT.
    1. Utføre hver aminosyre koblingsreaksjon i 4 timer. For hver kobling, bruk Fmoc-beskyttede aminosyre (1,2 mmol), N, N, N ', N' -Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1 -yl) uronium heksafluorfosfat (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ), og diisopropyletylamin (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) løst i DMF. Etter 4 timers kobling, vaskes harpiksen med DMF og utfører Fmoc avbeskyttelsestrinn som beskrevet i trinn 1.2.
    2. Gjenta til den lineære peptidkjede av fTAT (Linear peptidkjede: CKRKKRRQRRRG ingen TMR) ble syntetisert.
    3. Deretter vaskes resin grundig med første DMF og etter at med diklormetan (DCM). Skyll harpiksen flere ganger med et totalvolum på ca. 150 ml DMF eller DCM og fjern løsningsmidlet ved vakuumfiltrering.
    4. Use MALDI-TOF for å bekrefte at peptidet oppnådd har riktig molekylvekt.
      1. Foreta en matrise blanding ved å tilsette 1 mg av matrisen til en løsning sammensatt av 50 ul av 0,01% TFA i vann-oppløsning og 50 ul acetonitril.
      2. For å bekrefte lineær peptidkjeden masse, bruker α-cyano-4-hydroxycinnamic syre. Kjøre en analytisk HPLC av det urene peptid og samle 50 ul fra toppen av det rene topp.
      3. For å forberede prøven til platen på MALDI plate: Legg 8 mL av peptid 2 ul av matriseoppløsningen og sted på MALDI platen lufttørke eller på en 37 ° C varmeplate.
        Note: Arginin er kjent for å være en aminosyre vanskelig å par i SPPS. Vellykket kobling er etablert ved å utføre en Kaiser-test 14 (f.eks, ninhydrin-test). Denne testen gjør det mulig for påvisning av frie aminer som kan forbli frakoplet på harpiksen. I tilfelle det oppdages en blå farge (som indikerer tilstedeværelse av frie aminer), kopling sTeps gjentas.
  4. For CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), spalte Mtt beskyttende gruppe på a-aminogruppen av Lys i CK (-NH-Mtt) TATG med en oppløsning bestående av 1% trifluoreddiksyre (TFA) og 2% triisopropylsilan (TIS) i DCM.
    1. Som fjerning av MTT-beskyttende gruppe vil resultere i fremkomsten av en gul farge, inkuber harpiksen med 20 ml av den ovennevnte oppløsning i 5 minutter, gjenta dette til ingen gul farge observeres. Vask harpiksen med DMF og DCM i mellom. I tillegg, siden TIS er et passiveringsmiddel som vil absorbere den MTT, når ingen gul farge vises i oppløsning i nærvær av MTT.
    2. Legge til en ytterligere løsning med 1% TFA i DCM (ingen TIS) til harpiksen for å sikre ikke mer MTT er fjernet og oppløsningen er klar.
  5. Oppløs de tre komponenter: Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU, og DIEA (4, 3,9 og 10 tilsvarende i forhold til mengden av harpiks (i mg)) i DMF og tilsett denne blandingtil harpiksen og utføre reaksjonen O / N ved hjelp av tørr N2 for å tilveiebringe omrøring.
  6. Etter Fmoc-deproteksjon og aminosyre konjugering, vaske harpiks med DCM og la den tørke. For fullstendig spaltning av peptidet fra resinet, tilsett en løsning inneholdende 92,5% TFA, 2,5% H2O, 2,5% TIS, og 2,5% etanditiol (EDT) (totalvolum = 4 ml) for å peptidyl-resin for tre timer ved romtemperatur for å oppnå global avbeskyttelse og spalting fra harpiksen.
    1. Råpeptidet utfelles produkter ved hjelp av kald vannfri etyleter (Et2 O) ved drenering av oppløsningen fra trinn 1.6 i 40 ml Et2 O, spinner denne ned ved 4 ° C og 4000 x g i 20 - 25 min. Gjenta dette trinnet for å tillate vasking av bunnfallet med kald vannfri Et 2 O.
    2. Suspender bunnfall i vann (5 ml eller inntil bunnfallet er fullstendig oppløst) og Lyofiliser. Deretter resuspendere produkter fremstilt i 0,1% vandig TFA / acetonitril.
    7. <li> Utfør HPLC-analyse med en analytisk C18-kolonne (5 um, 150 x 4 mm) for å analysere hvert peptid. Bruke en strømningshastighet på 1 ml / min og påvisning ved 214 nm og 550 nm.
  7. Utføre semi-preparativ HPLC på en C18 10 x 250 mm kolonne for peptid rensing. Bruke en strømningshastighet på 4 ml / min og påvisning ved 214 nm og 550 nm. For alle kjøringer, bruker lineære gradienter av 0,1% vandig TFA (løsningsmiddel A) og 90% acetonitril, 9,9% vann og 0,1% TFA (løsningsmiddel B).
  8. Bekreft at identiteten av peptidene ved MALDI-TOF henhold til produsentens protokoll: fTAT, forventet masse: 2,041.17, observerte masse: 2040,66. DEAC-K9, forventet masse: 1,412.97, observerte masse: 1,415.59. Bruk en α- cyano-4-hydroxycinnamic syre matrise for MALDI-TOF.

2. Oksidasjon Reaksjon: dfTAT Generation

  1. Luft fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7,4 i 1 time (minst 5 ml for reaksjonen nedenfor).
  2. Oppløse fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) i aerrerte PBS pH 7,4 (5 ml). Sørge for at pH-verdien er mellom 7,0 - 7,5 etter tilsetning av peptidet. Hvis ikke legger natriumhydroksid (1 M, i små trinn 1-5 pl) for å bringe pH tilbake til 7,4.
  3. Merk: Oksygen oppløst i PBS virker til å oksidere tiolgrupper på fTAT og danner en disulfidbinding.
  4. Nutere reaksjons O / N for å tillate det å reagere inntil fullført (100% utbytte basert på HPLC-analyse). Rense produktet ved hjelp av reversfase-HPLC og analyse ved massespektrometri (MALDI-TOF) som i trinn 1.9. Forventet masse: 4,080.34, observerte masse: 4,084.21.
  5. Lyofiliser ren dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) og resuspendert i 200 pl vann (konsentrasjon ren dfTAT = 356,3 uM).

3. Måling dfTAT Konsentrasjon

  1. Resuspender en prøve av det rensede dfTAT (typisk 1 ul avhengig av mengden av peptid renses) i et 149 pl av 50 mM TCEP løsning.
  2. Merk: I dette trinnet dfTAT er redusert til sin monomer motstykke fTAT å eliminere absorbans leskende som oppstår på grunn av nærheten til TMR fluorophore i dfTAT (ekstinksjonskoeffisienten ε av TMR i dfTAT er redusert i forhold til ε av TMR i redusert fTAT).
  3. Tillat prøven for å reagere i omtrent 20 min (analytisk HPLC kan brukes for å bekrefte dannelsen av fTAT).
  4. Legg all oppløsningen til kvartskuvette og mål absorbansen ved 556 nm.
  5. Ved hjelp av Beer 's lov (A = εcl: ε = 91500 M -1 cm -1) for å beregne konsentrasjonen av fTAT, bestemme konsentrasjonen av dfTAT og dividere [fTAT] av to.

4. Cellular Levering Experiments

  1. Seed cellene (HeLa, HDF, osv.) I en skål på en confluency på 80 - 90% (for eksempel 8-brønn eller 24-brønnen parabol). Dyrke cellene i et egnet medium (f.eks DMEM supplert med 10% FBS og Pen / Strep) inntil 80 - 90% konfluens i en 37 ° Cfuktet atmosfære inneholdende 5% CO2.
  2. Vask cellene tre ganger (3X) med PBS (ved tilsetning av 200 pl PBS og deretter fjerne den tre ganger).
  3. Lag en fem mikrometer arbeider konsentrasjon av dfTAT ved å fortynne et lager av dfTAT (i vann) i NRL-15 medier (for en 8 godt parabolen det totale volumet skal være 200 mikroliter). En konsentrasjon på 5 uM dfTAT fører til effektiv levering (høyt nivå av cytosolisk levering i mer enn 90% av celler som er tilstede i en skål) i de fleste celletyper som hittil er testet (figur 3). Men kanskje lavere eller høyere konsentrasjoner være mer dekkende for celletyper med høy eller lav tilbøyelighet for penetrasjon.
    MERK OM MEDIA: NRL-15 brukes for levering av dfTAT siden den ikke inneholder cystein som kan redusere disulfidbindingen i dfTAT. Imidlertid våre data tyder på at både vanlige L-15 (med cystein) og DMEM kan benyttes som leveringsmedier. L-15 inneholder det reduserende aminosyren cystein men cystein presumably oksiderer i media for å danne cystin (DMEM er formulert med cystin). dfTAT forblir derfor intakt i disse mediene og levering fungerer på samme effektivitet som den som oppnås med nrL15.
  4. Inkuber cellene med dfTAT (5 uM), med eller uten last (f.eks., EGFP (10 uM)) og hold ved 37 ° C i 1 time (Inkubasjonstiden kan reduseres, men dfTAT krever vanligvis ca 30 til 45 minutter for å indusere endosomale lekkasje ).
  5. Vask cellene med heparin (1 mg / ml) i L-15 (3 vaskinger anbefales) for å fjerne dfTAT bundet til plasmamembranen av celler.
  6. Inkuber cellene med celle-ugjennomtrengelig nukleær flekk, f.eks., Sytox Blå, Sytox Grønn (2 uM i NRL-15), for å bestemme om plasmamembranen av celler blir kompromittert (døde cellene blir farget, mens levende celler ikke vil) ifølge produsentens protokoll.
  7. Bilde cellene ved hjelp av en fluorescens mikroskop (100X oljeneddyppingsobjektivet eller 20X objektiv). Bilde dfTAT bruker en RFP filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
    Merk: Vellykket levering fører til en diffus fluorescens av dfTAT hele cellen (vurdere levering av protein eller peptid av interesse vil avhenge av programmet). Farging av nucleoli hos fTAT (det reduserte produkt av dfTAT ved cytosolisk entry) kan brukes som en indikasjon på at den detekterte fluorescens er intracellulær. fTAT vil forringe innen få timer. På dette punktet, vil fluorescens av nedbrytnings fragmenter vises som punktformet. Dette må ikke forveksles for punktat distribusjon som er også sett hvis dfTAT forblir uten hell fanget inne endosomes (dette kan skje hvis dfTAT er til stede på et for lavt for en konsentrasjon).

5. kontrollerende Konsentrasjon av MOI Leveres

  1. Identifisere den "optimale levering" konsentrasjon som kreves for å oppnå effektiv cytosolic utgivelsen av dfTAT i celletype som brukes. Utfør fluorescensmikropskopi på celler inkubert med increasing konsentrasjoner av dfTAT. Den optimale dfTAT konsentrasjonen er definert som den minimale konsentrasjon som fører til klare cytosoliske "diffuse" TMR fluorescens i ca. 100% av celler i en kultur.
  2. Variere konsentrasjonen av MOI brukes i co-inkubasjon protokollen samtidig holde konsentrasjonen av dfTAT konstant (f.eks ved hjelp dfTAT optimale levering konsentrasjon). Endring av inkubasjonstiden til mindre enn en time kan også være et alternativ for å variere mengden av MOI levert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å undersøke forskjellen mellom fTAT og dfTAT blir HeLa-celler ble inkubert i 1 time med hvert peptid for å bestemme forskjell i deres cellulær lokalisering. Internalisering av de to CPP-tallet ble vurdert ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Figur 2 viser at fTAT (20 uM) lokaliseres i en punktformet fordeling. Denne fordelingen er forenlig med peptidet gjenværende innesluttet inne i endosomer. I motsetning til dette, viser fluorescens-signalet av dfTAT (5 pM) en homogen fordeling gjennom hele cytosol og kjernen. Figur 3 viser at den cytosoliske fordelingen av dfTAT er observert i en rekke forskjellige cellelinjer, inkludert COLO 316, NIH 3T3, HaCaT den vanskelig å transfektere Neuro-2a, MCH58, den primære cellelinje HDF, DRG-F11 og NCL-H1299. 20x bildene viser at en svært høy andel (> 80%) i en skål vise en cytosolic fordeling av dfTAT uten cellulær toksisitet (ingen Sytox blå atom staining).

For å avgjøre om dfTAT-mediert endosomale lekkasje leverer store proteiner i cytosol av celler. EGFP (26 kDa) er valgt som modell protein. Dette er fordi dens fluorescens kan benyttes til å detektere dets levering inn i cellene ved å observere lokalisering av grønn fluorescens (hvis korrekt foldet). For å gjøre denne analysen, ble EGFP dTAT og inkubert i 1 time med celler, som vist i figur 4, vises en EGFP cytosoliske og atom grønt fluorescerende distribusjon lik det som er observert for dfTAT i mer enn 90% av celler uten observerbar toksisitet.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk Viser Principle of dfTAT-mediert Molecular Levering. Fra venstre til høyre. Skjematisk viser dfTAT cellular levering sammen med en celle ugjennomtrengelig last. Først dfTAT induserer endocytose som resulterer i uptake av dfTAT sammen med godset inn i endocytiske vesikler. I det andre trinnet dfTAT unnslipper fra de endocytiske vesikler som resulterer i frigjøring av dfTAT og cellen impermeable molekyler inn i cytosol i celler. Cytosol av pattedyrceller er en reduktiv miljø, derfor i cytosol dfTAT er redusert til sin monomer motstykke fTAT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. fluorescens og Bright Felt Bilder av Begge HeLa celler inkubert med 20 mikrometer fTAT (venstre panel) og 5 mikrometer dfTAT (høyre panel) med en 100X Objective. FTAT monokrome bilder viser celler som viser en fluorescens punktat distribusjon mens dfTAT bildene viser celler viser en homogen cytosolisk og atom fluorescenc e distribusjon. Skala:. 10 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. effektiv levering av dfTAT i levende celler ble oppnådd i flere cellelinjer. Cellelinjene som ble testet var følgende: HeLa, NIH 3T3, COLO 316 og HaCaT, Neuro-2a, MCH58, HDF, DRG-F11 og NCL- H1299. Celler ble inkubert med 5 um dfTAT i 1 time, etterfulgt av et vasketrinn i henhold til protokollen og avbildes. Fluorescenssignalet oppdaget var i cytosol og cellekjernen (toppanelet: 20X objektiv, bunnpanelet: 100X objektiv). Den celle-impermeable nukleær flekk SYTOX Blå ble brukt for å vurdere cellelevedyktigheten etter dfTAT behandling. Skala barer, 20X objektiv: 50 mikrometer; 100X mål: 10 mikrometer.jove.com/files/ftp_upload/53175/53175fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. dfTAT Leverer Intakt EGFP inn i forskjellige cellelinjer. (A) HeLa (øvre panel) og NIH 3T3 (nedre panel) celler ble inkubert med EGFP (10 pM) og dfTAT (5 pM) i 1 time og etterfølgende trinn ble utført i henhold til protokollen. Bildene viser en homogen fordeling av cytosoliske fluorescens EGFP i begge cellelinjer. Skala barer, 10 mm. (B), HeLa og primære HDF-celler ble inkubert med EGFP (10 pM) og dfTAT (5 uM) i henhold til protokollen. 20X bildene viser en homogen cytosolic fluorescens fordeling av EGFP og dfTAT i HeLa og primær HDF celler. Overlegg (pseudocolor: hvit) indikerer tilstedeværelse av dfTAT (pseudocolor: lilla), EGFP (pseudocoleller: grønn) i cytosolic plass av både HeLa og HDF celler. Sytox blå (markert med blått) ble brukt til å asses for celle levedyktighet. Skala barer:. 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cellene som brukes for levering dfTAT bør ikke være altfor sammenflytende (> 90% konfluens), siden dette kan påvirke leveringseffektiviteten. Cellene skal også være sunt: ​​døde celler i kultur kan frigi apoptotiske fragmenter som dfTAT kan samhandle (for eksempel DNA fra nedbrutte kjerner). Dette i sin tur kan påvirke leveringen effektiviteten og kvaliteten av imaging. Cellene må vaskes grundig for å fjerne FBS før du legger dfTAT. BSA tilstede i FBS kan binde seg til dfTAT, og dette kan redusere effektiviteten av leveringen dfTAT. Vasker bør imidlertid utføres med forsiktighet som overdreven makt kan føre adherente celler å løsne fra dyrkningsskålen eller forårsake stress som resulterer i lavere endocytic uptake.When levere en protein / peptid ved hjelp dfTAT, protein / peptid stamløsning prøven bør være tilstrekkelig konsentrert for å unngå overdreven fortynning av NRL-15 media under inkubasjon: for eksempel, å legge på 5 - 10 ul prøve til 200 μl NRL-15 anbefales.

Fluoresceinmerkede celle penetrerende peptider kan vise et lys-induserbar membran forstyrrende aktivitet. 15 Dette er tilfellet for dfTAT når høyintensitetslys doser brukes. Det kan manifestere seg ved brudd av intracellulære organeller (f.eks endosomer, mitokondrier), celleoverflaten blebbing og celledød. For å minimere disse effektene, bør man sørge for å holde lys eksponering til et minimum (standard betingelser som kreves for avbildning av confocal eller epifluorescens er vanligvis tolerert).

Ved levering av MOI slik som proteiner, er en konfrontert med problemet at hvert makromolekyl er unik, og at følgelig hver levering eksperiment kan kreve finjustering (mer enn i tilfellet med DNA-transfeksjon, hvor molekylene leverte er alltid et negativt ladet polymer fremstilt av A, T, G og C). Feilsøking er derfor viktig, og flere aspekter bør vurderes.Først kan proteiner med svært lave Pis binde elektro å dfTAT og inaktivere det. I motsetning til dette, kan proteiner med meget høy pis konkurrere med dfTAT for binding med negativt ladede glykosaminoglykaner på celleoverflaten. Dette kan da redusere endocytose og redusere opptaket under endosomolytic terskler. I begge tilfeller, er en mulig løsning på dette problemet økende dfTAT konsentrasjon.

Som man ville forvente, på grunn av tilstedeværelsen av cellulære proteaser (for eksempel katepsin 16) langs endocytoseveien, er nedbrytning av MOI under levering en bekymring. Mens dfTAT kan levere intakte proteiner, har ikke blitt etablert mengden protein som er helt eller delvis nedbrutt i løpet av leveringsprosessen. Dette er igjen et problem som er MOI-avhengige og som bør overvåkes avhengig av programmet forfulgt.

dfTAT er en svært effektiv levering agent. Det molekylære grunnlaget for dfTAT aktivitets remains imidlertid uklart. Spesielt har de strukturelle eller kjemiske egenskaper som kreves for å oppnå endosomale flukt ikke blitt identifisert. Det er derfor for tiden ikke mulig å forutsi hvor mye strukturen av dfTAT kan modifiseres uten å endre leveringseffektiviteten. Vi har allerede fastslått at det disulfidbinding tilstede i dfTAT kan erstattes av en ikke-reduserbar linker, uten skadelige virkninger. Tilleggs struktur-aktivitetsforhold er under etablering.

Våre data antyder at det er mulig å redusere inkubasjonstiden av peptidet til mindre enn 1 time (så lavt som 5 min er blitt utført). Imidlertid er frigjøring av dfTAT inne i cellene ikke observert i en stor populasjon av celler til ca 15-30 min. Dette tyder på at kort inkubasjonstid kan være tilstrekkelig for dfTAT endocytose eller cellulært opptak. Men tid er nødvendig for endosomale modning nødvendig for dfTAT flukt fra endocytoseveien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin  Sigma CAS 9041-08-1
SYTOX Blue Invitrogen S11348
SYTOX Green Invitrogen S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine Hyclone Special order
Fmoc-protected Amino acids Novabiochem
dfTAT Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope Olympus model IXB1 equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). 
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
  2. Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
  3. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
  4. Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
  5. Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
  6. Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
  7. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
  8. Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
  9. Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
  10. Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
  11. Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
  12. Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
  13. Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
  14. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
  15. Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
  16. Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).

Tags

Bioteknologi Cell-trengende peptid cytosolisk levering protein fluorescens mikroskopi cellekultur.
Levering av proteiner, peptider eller celle-ugjennomtrengelig små molekyler inn i levende celler ved inkubasjon med den Endosomolytic Reagens dfTAT
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Najjar, K., Erazo-Oliveras, A.,… More

Najjar, K., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT. J. Vis. Exp. (103), e53175, doi:10.3791/53175 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter