Abstract
Macromolecular वितरण रणनीतियों आम तौर पर सेलुलर प्रवेश का एक मार्ग के रूप में endocytic मार्ग का उपयोग। हालांकि, endosomal फंसाने गंभीर रूप से कोशिकाओं के साइटोसोलिक अंतरिक्ष घुसना अणुओं के साथ जो दक्षता की सीमा। हाल ही में, हम अभिकर्मक dfTAT, fluorophore tetramethylrhodamine के साथ लेबल पेप्टाइड जैसे की एक डाइसल्फाइड बॉन्ड डिमर की पहचान के द्वारा इस समस्या को धोखा दिया है। हम जीवित कोशिकाओं प्रवेश और एक विशेष रूप से उच्च दक्षता के साथ कोशिकाओं के साइटोसोलिक अंतरिक्ष तक पहुँच जाता है, जो प्रोटोटाइप सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड (सीपीपी) बुनना, dfTAT की एक fluorescently लेबल डिमर उत्पन्न किया है। DfTAT के साइटोसोलिक वितरण प्राथमिक कोशिकाओं सहित कई सेल लाइनों में हासिल की है। इसके अलावा, वितरण काफ़ी सेल व्यवहार्यता, प्रसार या जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता। dfTAT छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, एंटीबॉडी, जैविक रूप से सक्रिय एंजाइम और एक प्रतिलेखन कारक वितरित कर सकते हैं। इस रिपोर्ट में, हम dfTA में शामिल प्रोटोकॉल का वर्णनटी संश्लेषण और सेलुलर वितरण। पांडुलिपि extracellularly प्रशासित प्रोटीन की मात्रा अलग से कोशिकाओं के साइटोसोलिक अंतरिक्ष के लिए दिया प्रोटीन की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए कैसे करें। अंत में, इस नई तकनीक और वितरण को मान्य में शामिल कदम की वर्तमान सीमाओं चर्चा कर रहे हैं। वर्णित प्रोटोकॉल सेल आधारित assays के लिए के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के पूर्व vivo हेरफेर और reprogramming के लिए अत्यंत उपयोगी होना चाहिए।
Introduction
जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, पेप्टाइड या सेल अभेद्य छोटे अणुओं की डिलीवरी कई जैविक या जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों (सेलुलर इमेजिंग, कार्यात्मक assays, सेलुलर reprogramming, आदि।) 1-4 में अक्सर वांछनीय है। कई वितरण दृष्टिकोण पहले ही microinjection, इलेक्ट्रोपोरेशन, या वाहक एजेंटों के उपयोग सहित सूचित किया गया है (उदाहरण के लिए।, इस तरह जैसे के रूप में सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स, लिपिड) 5-7। प्रत्येक तकनीक को आम तौर पर कुछ अनुप्रयोगों के लिए नहीं, बल्कि दूसरों के लिए इन तरीकों पर्याप्त बना सकता है कि विशिष्ट पेशेवरों और बुरा है। आम मुद्दों कुछ कोशिकाओं में नहीं बल्कि एक पूरी आबादी में और / या कमी 8,9 वितरित किया जाता है कितना माल का नियंत्रण है, विषाक्तता या हानिकारक शारीरिक प्रभाव 10,11, अस्थायी नियंत्रण की कमी है, प्रसव के गरीब वितरण क्षमता (शामिल उदा।, microinjection) 12, और जटिल रासायनिक विकार या निर्माण योजनाओं 11।
एस = "jove_content"> हाल ही में, हम इन सीमाओं में गतिरोध उत्पन्न कि एक उपन्यास वितरण रणनीति विकसित किया है। इस रणनीति के dfTAT नाम के एक पेप्टाइड (डिमर फ्लोरोसेंट बुनना) 13 पर निर्भर करता है। dfTAT अच्छी तरह से पता सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड (सीपीपी) बुनना से ली गई है। dfTAT fluorophore tetramethylrhodamine के साथ लेबल बुनना के दो डाइसल्फाइड बंधुआ प्रतियां शामिल हैं। उनकी समानताओं के बावजूद, बुनना और dfTAT गतिविधि में काफी भिन्न होते हैं। जैसे आम तौर पर endocytosis द्वारा कोशिकाओं में भली भाँति है। यह सीपीपी हालांकि ज्यादातर (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच यह आमतौर पर जब कोशिकाओं के अंदर पेप्टाइड का एक कबरा वितरण के लिए नेतृत्व) endosomes अंदर फंस रहता है। जैसे की तरह, dfTAT कुशलता से कोशिकाओं द्वारा endocytosed है। हालांकि, dfTAT endosomes अंदर फंस नहीं रहती है। इसके बजाय, यह बहुत ही कुशल है कि एक तरह से endosomal रिसाव मध्यस्थता करता है। dfTAT की endosomolytic गतिविधि तो एक साधारण ऊष्मायन परख द्वारा अणुओं देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
इस प्रकार के रूप ntent "> वितरण की प्रक्रिया की वर्तमान समझ है। dfTAT macropinocytosis लाती है। नतीजतन, dfTAT साथ incubated कोशिकाओं द्रव चरण से मीडिया में मौजूद घुलनशील प्रोटीन, पेप्टाइड, या छोटे अणुओं (ब्याज की अणु, MOI) तक ले endocytosis (चित्रा 1 देखें)। dfTAT और MOI के बीच सहभागिता एक साथ endocytic मार्ग के भीतर दोनों संस्थाओं के यातायात के रूप में लंबे समय के रूप में आवश्यक नहीं हैं। dfTAT endocytic अंगों के लुमेन के भीतर एक निश्चित सीमा तक पहुँच के रूप में, यह अपने endosomal रिसाव गतिविधि (आणविक विवरण व्यक्त dfTAT है, क्योंकि यह दृष्टिकोण इसके अलावा। इसलिए MOI के साथ कोई विकार या निर्माण योजनाओं के लिए आवश्यक हैं के रूप में बहुत सुविधाजनक है।।) पूरी तरह होती जा करने के लिए टपका हुआ अंगों के लुमेन की सामग्री के बने हुए हैं, और इसलिए MOI, तो कोशिकाओं में जारी की है इंट्रासेल्युलर वितरण हासिल की है एक बार सीधे एक MOI को संशोधित नहीं है, यह भी MOIs समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए। इसके अलावा, की एकाग्रताdfTAT वितरण मीडिया में Moi की है कि स्वतंत्र है इस्तेमाल किया। उदाहरण के लिए, dfTAT एकाग्रता endosomal रिसाव में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य क्षमता गारंटी करने के लिए अलग-अलग प्रयोगों के बीच स्थिर रखा जा सकता है। इसके विपरीत, मीडिया में Moi की एकाग्रता धीरे-धीरे MOI साइटोसॉल में दिया के वांछित स्तर को प्राप्त करने के लिए बदला जा सकता है।dfTAT के साथ हासिल की उच्च endosomal रिसाव दक्षता तारीख करने के लिए परीक्षण कोशिकाओं के कई उल्लेखनीय अहानिकर है। Endocytic अंगों की कोशिकाओं के महत्वपूर्ण घटक हैं और एक dfTAT द्वारा मध्यस्थता नाटकीय रिसाव हानिकारक सेलुलर प्रतिक्रियाओं के साथ किया जाना होता है कि उम्मीद होती है, क्योंकि यह एक आश्चर्य की बात है। फिर भी, इलाज कोशिकाओं अनुपचारित कोशिकाओं के रूप में एक ही दर पर पैदा करना और उनकी transcriptome में कोई महत्वपूर्ण बदलाव प्रदर्शित नहीं करते। इसके अलावा, वितरण कोशिकाओं को खोने के बिना प्रसव प्रक्रिया से सहन या ठीक कर सकते हैं या तो यह दर्शाता है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वितरण क्षमता के साथ ही मिनटों के भीतर दोहराया जा सकता हैendocytosis या endosomal रिसाव के लिए अपनी क्षमता। सूक्ष्म सेलुलर प्रतिक्रियाओं dfTAT वितरण और इन प्रतिक्रियाओं का पता लगाया जा रह हो सकता है की आणविक विवरण के दौरान जगह ले सकता है। फिर भी, उच्च दक्षता, प्रोटोकॉल की सुविधा है, और विषाक्तता की कमी के संयोजन से, इस वितरण दृष्टिकोण कई सेल आधारित अनुप्रयोगों में तुरंत उपयोगी साबित करना चाहिए। इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल अनुसंधान समुदाय के लिए इस प्रौद्योगिकी सुलभ बनाने के उद्देश्य से कर रहे हैं।
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Protocol
1. SPPS: सीके (टीएमआर) TATG (fTAT) संश्लेषण
नोट: dfTAT दो चरणों में उत्पादन किया है: dfTAT के लिए फार्म का डाइसल्फाइड बॉन्ड dimerization द्वारा पीछा ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण द्वारा मोनोमर fTAT के संश्लेषण।
- 1 घंटे के लिए एक मानक 50 मिलीलीटर SPPS पोत में dimethylformamide (DMF) में रिंक एमाइड MBHA राल के 500 मिलीग्राम प्रफुल्लित।
- । एक 20% piperidine समाधान (DMF में 20% piperidine, 10 एमएल (0.30 mmol) में Fmoc संरक्षित राल incubating द्वारा Fmoc deprotection प्रदर्शन करना (1 एक्स 5 मिनट और एक कपड़े धोने कदम के साथ 1 एक्स 15 मिनट) का उपयोग करते हुए दो बार deprotection चरणों को पूरा DMF (धोने कदम DMF के लगभग 150 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ राल कई बार rinsing और वैक्यूम निस्पंदन द्वारा विलायक हटाने शामिल है) प्रतिक्रियाओं के बीच में।
- रिंक एमाइड MBHA राल पर सीके (टीएमआर) RKKRRQRRRG (fTAT) synthesize। का प्रयोग करें Fmoc अमीनो एसिड संरक्षित निम्नलिखित हैं: Fmoc-लिस (MTT) ओह (केवल एन टर्मिनस पर), Fmoc-लिस (बीओसी) ओह, Fmoc-Gly, ओह, Fmoc-Arg (PBF) ओह, Fmoc- जीएल.एन. (ठ्ठ) ओह, और Fmoc-Cys (ठ्ठ) ओह। प्रतिक्रिया आंदोलन एन 2 (20 साई) का उपयोग प्रतिक्रिया बाहर ले। आरटी पर सभी प्रतिक्रियाओं को पूरा करें।
- 4 घंटे के लिए प्रत्येक अमीनो एसिड युग्मन प्रतिक्रिया बाहर ले। प्रत्येक युग्मन के लिए, Fmoc अमीनो एसिड (1.2 mmol), एन, एन, एन ',' एन -Tetramethyl- हे (1 एच -benzotriazol-1-YL) uronium Hexafluorophosphate (HBTU) (0.44 छ, 1.1 mmol संरक्षित उपयोग DMF में भंग), और diisopropylethylamine (DIEA) (0.51 मिलीग्राम, 3.0 mmol)। 4 घंटा युग्मन के बाद, DMF के साथ राल धोने और 1.2 चरण में वर्णित के रूप में Fmoc deprotection कदम प्रदर्शन करते हैं।
- (: CKRKKRRQRRRG कोई TMR रैखिक पेप्टाइड श्रृंखला) संश्लेषित किया गया था fTAT के रैखिक पेप्टाइड श्रृंखला जब तक दोहराएँ।
- तो फिर अच्छी तरह पहली DMF का उपयोग कर और क्लोराइड (डीसीएम) के साथ कि निम्न राल धो लें। DMF या डीसीएम के लगभग 150 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ राल कई बार कुल्ला और वैक्यूम निस्पंदन द्वारा विलायक हटा दें।
- यूएसई MALDI-TOF प्राप्त पेप्टाइड सही आणविक भार है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए।
- पानी के घोल में 0.01% TFA के 50 μl और acetonitrile के 50 μl से बना एक समाधान के लिए मैट्रिक्स के 1 मिलीग्राम जोड़कर एक मैट्रिक्स मिश्रण बनाओ।
- रेखीय पेप्टाइड श्रृंखला बड़े पैमाने पर इस बात की पुष्टि करने के लिए, α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड का उपयोग करें। कच्चे तेल की पेप्टाइड का एक विश्लेषणात्मक एचपीएलसी चलाने के लिए और शुद्ध शिखर के ऊपर से 50 μl इकट्ठा।
- MALDI प्लेट पर थाली करने के लिए नमूना तैयार करने के लिए: सूखी या एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी प्लेट पर हवा के लिए MALDI प्लेट पर मैट्रिक्स समाधान और जगह के 2 μl को पेप्टाइड के 8 μl जोड़ें।
नोट: Arginine SPPS में कुछ करने के लिए मुश्किल एक एमिनो एसिड होने के लिए जाना जाता है। सफल युग्मन एक कैसर परीक्षण 14 (जैसे, ninhydrin परीक्षण) के प्रदर्शन से स्थापित है। इस परीक्षा में राल पर uncoupled रह सकता है कि मुक्त amines का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। मामले में एक नीले रंग (मुक्त अमाइन की उपस्थिति का संकेत) का पता चला है, युग्मन रोंTEPS दोहराया जाता है।
- सी.के. के लिए (राष्ट्रीय राजमार्ग-टीएमआर) TATG (fTAT), 1% trifluoroacetic एसिड (टीएफए) और 2% triisopropylsilane से बना एक समाधान के साथ सी.के. पर लिस के -amino समूह पर (राष्ट्रीय राजमार्ग-MTT) TATG Mtt की रक्षा समूह फोड़ना डीसीएम में (टीआईएस)।
- MTT की रक्षा के समूह को हटाने के एक पीले रंग की उपस्थिति में परिणाम होगा, के रूप में 5 मिनट के लिए ऊपर समाधान के 20 मिलीलीटर के साथ राल सेते कोई पीले रंग मनाया जाता है जब तक यह दोहराना। बीच में डीसीएम और DMF के साथ राल धो लें। तीस MTT मांजना होगा कि एक मेहतर है इसके अतिरिक्त, के बाद से एक बार कोई पीले रंग MTT की उपस्थिति में समाधान में दिखाई देता है।
- कोई और अधिक MTT बीमा के लिए राल को डीसीएम में 1% टीएफए (कोई टीआईएस) के साथ एक अतिरिक्त समाधान जोड़ें हटा दिया जाता है और समाधान स्पष्ट रहता है।
- DMF में (() मिलीग्राम में राल की राशि के संबंध में 4, 3.9 और 10 तुल्यता) Carboxytetramethylrhodamine (टीएमआर), HBTU, और DIEA और इस मिश्रण जोड़ें: तीन घटक भंगराल के लिए और प्रतिक्रिया हे बाहर ले जाने / एन आंदोलन प्रदान करने के लिए सूखी एन 2 का उपयोग कर।
- Fmoc-deprotection और अमीनो एसिड विकार के बाद, डीसीएम के साथ राल धोने और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं। राल से पेप्टाइड की पूरी दरार के लिए, 92.5% टीएफए, 2.5% से युक्त एक समाधान जोड़ने एच 2 हे, 2.5%, तीस, और 3 के लिए peptidyl-राल के लिए 2.5% ethanedithiol (EDT) (कुल मात्रा = 4 एमएल) आरटी पर घंटा राल से वैश्विक deprotection और दरार को प्राप्त करने के लिए।
- एट 2 हे के 40 मिलीलीटर में 1.6 कदम से समाधान की निकासी द्वारा ठंड निर्जल ईथर (ईटी 2 ओ) का उपयोग कच्चे पेप्टाइड उत्पादों वेग, 4 डिग्री सेल्सियस पर यह नीचे स्पिन और 20 के लिए 4,000 XG - 25 मिनट। ठंड निर्जल एट 2 ओ के साथ वेग की धुलाई अनुमति देने के लिए इस चरण को दोहराएँ
- पानी में (5 मिलीलीटर या वेग पूरी तरह भंग है जब तक) और lyophilize अवक्षेप Resuspend। फिर 0.1% जलीय टीएफए / acetonitrile में प्राप्त उत्पादों resuspend।
<li> एक विश्लेषणात्मक C18 स्तंभ (5 माइक्रोन, 4 x 150 मिमी) प्रत्येक पेप्टाइड का विश्लेषण करने के साथ एचपीएलसी विश्लेषण प्रदर्शन। 214 एनएम और 550 एनएम पर एक प्रवाह 1 मिलीग्राम / मिनट की दर, और पता लगाने का प्रयोग करें। - पेप्टाइड शुद्धि के लिए एक C18 10 x 250 मिमी स्तंभ पर अर्द्ध प्रारंभिक एचपीएलसी प्रदर्शन करते हैं। 214 एनएम और 550 एनएम पर एक प्रवाह 4 मिलीग्राम / मिनट की दर, और पता लगाने का प्रयोग करें। सभी रन के लिए, 0.1% जलीय टीएफए (विलायक ए) और 90% acetonitrile, 9.9% पानी, और 0.1% टीएफए (विलायक बी) के रैखिक ढ़ाल का उपयोग करें।
- FTAT, उम्मीद जन: 2,041.17 मनाया जन: 2040.66 निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार MALDI-TOF द्वारा पेप्टाइड्स की सही पहचान की पुष्टि। बड़े पैमाने पर उम्मीद DEAC-K9,: 1,415.59: 1,412.97, बड़े पैमाने पर मनाया। MALDI-TOF के लिए एक α- cyano-4-hydroxycinnamic एसिड मैट्रिक्स का प्रयोग करें।
2. ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया: dfTAT जनरेशन
- 1 घंटा (नीचे प्रतिक्रिया के लिए कम से कम 5 एमएल) के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 7.4 पीएच Aerate।
- AER में fTAT (0.3 एमजी, 1.5 x 10 -4 mmol) भंगपैदा पीबीएस 7.4 पीएच (5 एमएल)। पेप्टाइड के बाद इसके अलावा 7.5 - पीएच 7.0 के बीच है कि सुनिश्चित करें। सोडियम हाइड्रोक्साइड जोड़ नहीं हैं (छोटे वेतन वृद्धि में 1 एम, 1-5 μl) वापस 7.4 अप करने के लिए पीएच लाने के लिए।
- नोट: पीबीएस में घुलित आक्सीजन fTAT पर thiol समूहों oxidize और एक डाइसल्फ़ाइड बांड फार्म में कार्य करता है।
- प्रतिक्रिया हे डोलना / एन यह पूरा होने (एचपीएलसी विश्लेषण के आधार पर 100% उपज) जब तक प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देने के लिए। रिवर्स चरण HPLC का उपयोग उत्पाद शुद्ध और कदम 1.9 में के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF) द्वारा विश्लेषण। उम्मीद जन: 4,084.21: 4,080.34, बड़े पैमाने पर मनाया।
- 200 μl पानी में Lyophilize शुद्ध dfTAT (0.71 X10 -4 mmol) और resuspend (एकाग्रता शुद्ध dfTAT = 356.3 माइक्रोन)।
3. dfTAT एकाग्रता को मापने
- 50 मिमी TCEP समाधान की 149 μl में शुद्ध dfTAT (शुद्ध पेप्टाइड की मात्रा पर निर्भर करता है जो आम तौर पर 1 μl) के एक विभाज्य Resuspend।
- नोट: इस चरण में dfTAT इसकी मो करने के लिए कम हो जाता हैnomer समकक्ष fTAT कारण dfTAT में TMR fluorophore के करीब निकटता (dfTAT में TMR के विलुप्त होने के गुणांक ε कम हो fTAT में TMR की ε की तुलना में कम हो जाता है) के लिए होता है कि absorbance के शमन समाप्त करने के लिए।
- नमूना लगभग 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दें (विश्लेषणात्मक एचपीएलसी fTAT के गठन की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)।
- क्वार्ट्ज क्युवेट करने के लिए सभी समाधान जोड़ें और 556 एनएम पर absorbance के उपाय।
- बीयर के कानून का प्रयोग (एक = εcl: ε = 91,500 एम -1 सेमी -1), fTAT की एकाग्रता की गणना dfTAT की एकाग्रता का निर्धारण, और दो से [fTAT] विभाजित करने के लिए।
4. सेलुलर प्रसव के प्रयोगों
- 90% (जैसे, 8 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से पकवान) - 80 की एक confluency पर एक थाली में कोशिकाओं (। हेला, HDF, आदि) बीज। एक 37 डिग्री सेल्सियस में 90% confluency - एक उचित माध्यम में कोशिकाओं को विकसित 80 तक (उदाहरण के लिए, DMEM 10% FBS और पेन / Strep के साथ पूरक)5% सीओ 2 से युक्त humidified माहौल।
- (यह तीन बार हटाने तो पीबीएस के 200 μl जोड़ने और से) कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार (3X) धो लें।
- (एक 8 अच्छी तरह से कुल मात्रा 200 μl होना चाहिए पकवान के लिए) एनआरएल -15 मीडिया में (पानी में) dfTAT के एक शेयर गिराए द्वारा dfTAT की एक 5 माइक्रोन काम कर एकाग्रता बनाओ। 5 माइक्रोन dfTAT के एक एकाग्रता कुशल डिलीवरी की तारीख (चित्रा 3) के लिए परीक्षण सबसे प्रकार की कोशिकाओं में (एक डिश में मौजूद कोशिकाओं के 90% से अधिक में साइटोसोलिक वितरण के उच्च स्तर पर) की ओर जाता है। हालांकि, कम या उच्च सांद्रता प्रवेश के लिए एक उच्च या कम प्रवृत्ति के साथ प्रकार की कोशिकाओं के लिए और अधिक पर्याप्त हो सकता है।
मीडिया के बारे में नोट: यह dfTAT में डाइसल्फाइड बंधन को कम कर सकता है, जो सिस्टीन शामिल नहीं करता है के बाद से एनआरएल-15 dfTAT के वितरण के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, हमारे डेटा दोनों नियमित रूप से एल -15 (सिस्टीन के साथ) और DMEM वितरण मीडिया के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि संकेत मिलता है। एल -15 को कम करने के अमीनो एसिड सिस्टीन लेकिन सिस्टीन presumab शामिलLy (DMEM cystine साथ तैयार की है) cystine फार्म के लिए मीडिया में ऑक्सीकरण होता है। dfTAT इसलिए इन मीडिया में भी बरकरार है और वितरण nrL15 के साथ प्राप्त किया है कि जैसे ही क्षमता पर काम करता है। - के साथ या माल के बिना dfTAT (5 माइक्रोन) (जैसे।, EGFP (10 माइक्रोन)) के साथ कोशिकाओं सेते हैं और (ऊष्मायन समय कम किया जा सकता है, लेकिन आम तौर पर dfTAT endosomal रिसाव को प्रेरित करने के लिए लगभग 30 से 45 मिनट की आवश्यकता है 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखना )।
- (3 washes सिफारिश कर रहे हैं) कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के लिए बाध्य dfTAT को दूर करने के एल -15 में हेपरिन (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ कोशिकाओं को धो लें।
- के अनुसार सेल अभेद्य परमाणु दाग, साथ कोशिकाओं को सेते उदा।, Sytox ब्लू, Sytox ग्रीन (एनआरएल-15 में 2 माइक्रोन), कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली समझौता किया है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए (जीवित कोशिकाओं नहीं होगा, जबकि मृत कोशिकाओं दाग हो जाएगा) निर्माता प्रोटोकॉल।
- एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (100x तेल विसर्जन या 20X उद्देश्य) का उपयोग कर छवि कोशिकाओं। एक आरएफपी फिल्टर का उपयोग कर छवि dfTAT (पूर्व =560 ± 20 एनएम / एम = 630 ± 35 एनएम)।
नोट: सफल प्रसव कक्ष भर dfTAT की एक फैलाना प्रतिदीप्ति (आवेदन पर निर्भर करेगा प्रोटीन या ब्याज की पेप्टाइड की डिलीवरी का आकलन) की ओर जाता है। FTAT (साइटोसोलिक प्रवेश पर dfTAT की कम उत्पाद) द्वारा nucleoli का धुंधला पता लगाया प्रतिदीप्ति इंट्रासेल्युलर है कि एक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। fTAT कुछ ही घंटों के भीतर नीचा दिखाना होगा। इस बिंदु पर, गिरावट के टुकड़े की प्रतिदीप्ति कबरा रूप में दिखाई देगा। इस dfTAT असफल (dfTAT एक एकाग्रता की बहुत कम पर मौजूद है, तो यह हो सकता है) endosomes अंदर फंस रहता है तो भी देखा जाता है कि कबरा वितरण के लिए भ्रमित नहीं होना चाहिए।
वितरित MOI 5. नियंत्रित एकाग्रता
- इस्तेमाल किया प्रकार की कोशिका में dfTAT के कुशल साइटोसोलिक रिहाई प्राप्त करने की आवश्यकता है "इष्टतम वितरण" एकाग्रता को पहचानें। तीव्र गति के साथ incubated कोशिकाओं पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शनdfTAT के छ सांद्रता। इष्टतम dfTAT एकाग्रता साइटोसोलिक स्पष्ट करने के लिए जाता है कि कम से कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है एक संस्कृति में कोशिकाओं के लगभग 100% में TMR प्रतिदीप्ति "फैलाना"।
- (DfTAT का इष्टतम वितरण एकाग्रता का उपयोग, उदाहरण के लिए) dfTAT निरंतर की एकाग्रता रखते हुए MOI की एकाग्रता सह ऊष्मायन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बदलती हैं। कम से कम 1 घंटा ऊष्मायन समय बदलने से भी MOI वितरित की राशि भिन्न करने के लिए एक विकल्प हो सकता है।
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Representative Results
FTAT और dfTAT के बीच के अंतर का आकलन करने के लिए, हेला कोशिकाओं को उनके सेलुलर स्थानीयकरण में अंतर को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक पेप्टाइड के साथ 1 घंटे के लिए incubated हैं। दो सीपीपी के internalization प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। fTAT (20 माइक्रोन) एक कबरा वितरण में localizes है कि 2 से पता चलता है। पेप्टाइड endosomes अंदर फँस शेष के साथ इस वितरण के अनुरूप है। इसके विपरीत, dfTAT (5 माइक्रोन) के प्रतिदीप्ति संकेत साइटोसॉल और नाभिक भर में एक समरूप वितरण प्रदर्शित करता है। चित्रा 3 dfTAT के साइटोसोलिक वितरण COLO 316, एनआईएच 3T3, HaCaT, सहित विभिन्न सेल लाइनों की संख्या में मनाया जाता है कि पता चलता है न्यूरो-2A, MCH58, प्राथमिक सेल लाइन HDF transfect करने के लिए मुश्किल है, डीआरजी-F11 और एनसीएल-H1299। 20X छवियों को एक डिश में एक बहुत उच्च प्रतिशत (> 80%) (कोई Sytox नीले परमाणु stainin कोई सेलुलर विषाक्तता के साथ dfTAT की एक साइटोसोलिक वितरण प्रदर्शित पता चलता है किछ)।
DfTAT की मध्यस्थता endosomal रिसाव कोशिकाओं के cytosol में बड़े प्रोटीन से बचाता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए। EGFP (26 केडीए) एक मॉडल प्रोटीन के रूप में चुना गया है। इसकी प्रतिदीप्ति (यदि सही ढंग से मुड़ा हुआ) हरी प्रतिदीप्ति का स्थानीयकरण देख द्वारा कोशिकाओं में इसके वितरण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि यह है। चित्रा 4 में दिखाया गया है इस परख करने के लिए, EGFP और dTAT, कोशिकाओं के साथ 1 घंटे के लिए incubated रहे थे, EGFP एक साइटोसोलिक और नमूदार विषाक्तता के बिना कोशिकाओं के 90% से अधिक में dfTAT के लिए मनाया जाता है के समान परमाणु हरी फ्लोरोसेंट वितरण का प्रदर्शन किया।
DfTAT की मध्यस्थता आण्विक डिलिवरी चित्रा 1. योजनाबद्ध दिखा रहा है सिद्धांत। बाएं से दाएं। योजनाबद्ध एक सेल अभेद्य माल के साथ-साथ dfTAT सेलुलर वितरण से पता चलता है। सबसे पहले dfTAT uptak में जो परिणाम endocytosis लाती हैendocytic vesicles में माल के साथ-साथ dfTAT के ई। दूसरे चरण में dfTAT dfTAT की रिहाई और कोशिकाओं के cytosol में सेल अभेद्य अणु में जो परिणाम endocytic पुटिकाओं से निकल जाता है। स्तनधारी कोशिकाओं की साइटोसॉल इसलिए साइटोसॉल dfTAT में अपनी मोनोमर समकक्ष fTAT के लिए कम है, एक reductive माहौल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
20 माइक्रोन fTAT (बाएं पैनल) और 5 माइक्रोन dfTAT (सही पैनल) एक 100x उद्देश्य के प्रयोग से। FTAT मोनोक्रोम छवियों dfTAT छवियों कोशिकाओं से पता चलता है, जबकि एक प्रतिदीप्ति कबरा वितरण दिखा रहे हैं कि कोशिकाओं से पता चलता है के साथ incubated दोनों हेला कोशिकाओं की चित्रा 2 प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र छवियों एक समरूप साइटोसोलिक और परमाणु fluorescenc प्रदर्शित ई वितरण। स्केल पट्टी:। 10 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
लाइव कोशिकाओं में dfTAT की चित्रा 3. कुशल प्रसव कई सेल लाइनों में हासिल की थी। हेला, एनआईएच 3T3, Colo 316 और HaCaT, न्यूरो 2A, MCH58, HDF, डीआरजी-F11 और NCL- H1299: परीक्षण सेल लाइनों पीछा कर रहे थे। प्रकोष्ठों प्रोटोकॉल और imaged के अनुसार एक कपड़े धोने कदम के द्वारा पीछा 1 घंटे के लिए 5 माइक्रोन dfTAT साथ incubated रहे थे। पता चला प्रतिदीप्ति संकेत साइटोसॉल और कोशिकाओं के नाभिक (: 20X उद्देश्य, नीचे पैनल: 100X उद्देश्य शीर्ष पैनल) में किया गया था। सेल अभेद्य परमाणु दाग Sytox ब्लू dfTAT उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। स्केल सलाखों, 20X उद्देश्य: 50 माइक्रोन; 100X उद्देश्य: 10 माइक्रोन।jove.com/files/ftp_upload/53175/53175fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. dfTAT विभिन्न सेल लाइनों में बरकरार EGFP उद्धार। (ए) हेला (शीर्ष पैनल) और एनआईएच 3T3 (नीचे के पैनल) कोशिकाओं EGFP (10 माइक्रोन) और 1 घंटे के लिए dfTAT (5 माइक्रोन) और निम्न कदम के साथ incubated रहे थे प्रदर्शन किया गया प्रोटोकॉल के अनुसार। छवियों दोनों सेल लाइनों में EGFP का एक समरूप साइटोसोलिक प्रतिदीप्ति वितरण दिखा। स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन। (बी) हेला और प्राथमिक HDF कोशिकाओं EGFP (10 माइक्रोन) और dfTAT (5 माइक्रोन) के साथ incubated रहे थे प्रोटोकॉल के अनुसार। 20X छवियों EGFP और हेला में dfTAT और प्राथमिक HDF कोशिकाओं का एक समरूप साइटोसोलिक प्रतिदीप्ति वितरण दिखा। ओवरले (pseudocolor: सफेद) (pseudocolor: बैंगनी) dfTAT की उपस्थिति का संकेत, EGFP (pseudocolया दोनों हेला और HDF कोशिकाओं के साइटोसोलिक अंतरिक्ष में हरा)। (नीले रंग में दिखाया गया है) Sytox नीले सेल व्यवहार्यता के लिए गधे के लिए इस्तेमाल किया गया था। स्केल सलाखों:। 50 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस के बाद से पीढ़ी मिला हुआ नहीं होना चाहिए dfTAT प्रसव के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं (> 90% confluency) वितरण क्षमता को प्रभावित कर सकता है। कोशिकाओं को भी स्वस्थ होना चाहिए: संस्कृति में मृत कोशिकाओं dfTAT (अपमानित नाभिक से जैसे, डीएनए) बातचीत कर सकते हैं, जिसके साथ apoptotic टुकड़े जारी कर सकते हैं। बदले में यह वितरण दक्षता और इमेजिंग की गुणवत्ता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। प्रकोष्ठों dfTAT जोड़ने से पहले एफबीएस दूर करने के लिए अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए। एफबीएस में बीएसए वर्तमान dfTAT करने के लिए बाध्य कर सकते हैं और इस dfTAT की डिलीवरी दक्षता कम कर सकते हैं। Washes हालांकि पक्षपाती कोशिकाओं संस्कृति पकवान से अलग या uptake.When प्रोटीन / पेप्टाइड शेयर समाधान नमूना पर्याप्त होना चाहिए dfTAT, का उपयोग करते हुए एक प्रोटीन / पेप्टाइड पहुंचाने कम endocytic में यह परिणाम है कि एक तनाव पैदा करने के लिए कारण हो सकता है देखभाल के रूप में अत्यधिक बल के साथ किया जाना चाहिए 200 μ को नमूना के 10 μl - 5 पर उनका कहना है, उदाहरण के लिए: गर्मी के दौरान एनआरएल-15 मीडिया के अत्यधिक कमजोर पड़ने से बचने के लिए ध्यान केंद्रित कियाएल एनआरएल-15 की सिफारिश की है।
Fluorescently लेबल सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स एक प्रकाश-inducible झिल्ली में खलल न डालें गतिविधि प्रदर्शित कर सकते हैं। 15 उच्च तीव्रता प्रकाश खुराक इस्तेमाल कर रहे हैं तो यह dfTAT लिए मामला है। यह इंट्रासेल्युलर अंगों (जैसे, endosomes, माइटोकॉन्ड्रिया), कोशिका की सतह blebbing, और कोशिका मृत्यु का टूटना से ही प्रकट कर सकते हैं। इन प्रभावों को कम करने के लिए, देखभाल एक न्यूनतम करने के लिए प्रकाश जोखिम (confocal या epifluorescence आम तौर पर बर्दाश्त कर रहे हैं द्वारा इमेजिंग के लिए आवश्यक मानक शर्तों) रख लिया जाना चाहिए।
प्रोटीन जैसे MOI पहुंचाने, जब एक हर macromolecule अद्वितीय है और हमेशा से रहे हैं अणुओं को जन्म दिया, जहां डीएनए अभिकर्मक के मामले में की तुलना में इतनी अधिक एक नकारात्मक आरोप लगाया कि इसके परिणामस्वरूप, हर वितरण प्रयोग की आवश्यकता हो सकती ठीक ट्यूनिंग (है कि समस्या का सामना कर रहा है ए, टी, जी, और सी के बने बहुलक)। समस्या निवारण इसलिए महत्वपूर्ण है और कई पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए।सबसे पहले, बहुत कम पीआईएस के साथ प्रोटीन dfTAT को electrostatically बाँध और यह निष्क्रिय कर सकते हैं। इसके विपरीत, बहुत उच्च पीआईएस के साथ प्रोटीन कोशिका की सतह पर नकारात्मक आरोप लगाया ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकान्स साथ बाइंडिंग के लिए dfTAT के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं। यह तो endocytosis को कम करने और endosomolytic थ्रेसहोल्ड नीचे तेज कम हो सकता है। दोनों ही मामलों में, इस समस्या का समाधान संभव dfTAT एकाग्रता बढ़ती जा रही है।
एक कारण endocytic मार्ग के साथ (जैसे cathepsins 16) के रूप में सेलुलर प्रोटिएजों की उपस्थिति के लिए, उम्मीद होती है, प्रसव के दौरान MOI की गिरावट चिंता का विषय है। DfTAT बरकरार प्रोटीन वितरित कर सकते हैं, जबकि पूरी तरह या आंशिक रूप से वितरण की प्रक्रिया के दौरान अपमानित किया जाता है कि प्रोटीन की मात्रा स्थापित नहीं किया गया। यह फिर से moi-निर्भर और कहा कि अपनाई आवेदन के आधार पर निगरानी की जानी चाहिए है कि एक मुद्दा है।
dfTAT एक अत्यधिक कुशल वितरण एजेंट है। dfTAT की गतिविधि rema के लिए आणविक आधारहालांकि यह स्पष्ट नहीं इन्स। विशेष रूप से, endosomal भागने को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं कि संरचनात्मक या रासायनिक सुविधाओं की पहचान नहीं की गई है। यह dfTAT की संरचना वितरण क्षमता में फेरबदल के बिना संशोधित किया जा सकता है कि कितना भविष्यवाणी करने के लिए इसलिए वर्तमान में संभव नहीं है। हम पहले से ही dfTAT में डाइसल्फाइड बंधन उपस्थित हानिकारक प्रभाव के बिना एक गैर कम करने योग्य लिंकर द्वारा बदला जा सकता है कि स्थापना की है। अतिरिक्त संरचना गतिविधि रिश्तों वर्तमान में स्थापित किए जा रहे हैं।
हमारे आंकड़े यह (5 के रूप में कम के रूप में न्यूनतम प्रदर्शन किया गया है) कम से कम 1 घंटा पेप्टाइड ऊष्मायन समय कम करने के लिए संभव है कि सुझाव। हालांकि, कोशिकाओं के अंदर dfTAT की रिहाई के लगभग 15-30 मिनट तक कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में मनाया जाता है। इस छोटे से ऊष्मायन समय dfTAT endocytosis या सेलुलर तेज करने के लिए पर्याप्त हो सकता है कि पता चलता है। हालांकि समय endocytic मार्ग से dfTAT बचने के लिए आवश्यक endosomal परिपक्वता के लिए आवश्यक है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
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