Abstract
استراتيجيات تسليم الجزيئات عادة الاستفادة من مسار التقامي كطريق من دخول الخلوية. ومع ذلك، endosomal انحباس يحد بشدة من الكفاءة التي الجزيئات تخترق الفضاء عصاري خلوي من الخلايا. مؤخرا، قمنا التحايل على هذه المشكلة عن طريق تحديد كاشف dfTAT، وديمر السندات ثاني كبريتيد من TAT الببتيد المسمى مع tetramethylrhodamine fluorophore. لقد ولدت ديمر fluorescently المسمى من تنميط الببتيد اختراق الخلية (CPP) TAT، dfTAT، التي تخترق الخلايا الحية وتصل مساحة عصاري خلوي من الخلايا مع كفاءة عالية للغاية. ويتحقق تسليم عصاري خلوي من dfTAT في خطوط الخلايا متعددة، بما في ذلك الخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، والتسليم لا يؤثر بشكل ملحوظ بقاء الخلية، وانتشار أو التعبير الجيني. dfTAT يمكن أن يحقق الجزيئات، والببتيدات، والأجسام المضادة، والانزيمات النشطة بيولوجيا صغيرة وعامل النسخ. في هذا التقرير، وصفنا البروتوكولات تشارك في dfTAالتوليف T والتسليم الخلوية. يصف المخطوطة كيفية السيطرة على كمية من البروتين تسليمها إلى الفضاء عصاري خلوي الخلايا من خلال تغيير كمية البروتين تدار خارج الخلية. وأخيرا، تناقش القيود الحالية من هذه التكنولوجيا الجديدة والخطوات المتبعة في التحقق من صحة التسليم. يجب أن تكون البروتوكولات المذكورة مفيدة للغاية لفحوصات خلية القاعدة فضلا عن التلاعب فيفو السابقين وإعادة برمجة الخلايا.
Introduction
تسليم البروتينات والببتيدات أو خلايا غير منفذة جزيئات صغيرة في الخلايا الحية أمر مرغوب فيه في العديد من التطبيقات البيولوجية أو التكنولوجيا الحيوية (التصوير الخلوي، المقايسات الفنية، إعادة برمجة الخلايا، الخ.) 1-4. وقد سبق أن ذكرت العديد من المناهج التسليم، بما في ذلك microinjection، Electroporation لل، أو استخدام وكلاء الناقل (على سبيل المثال، الببتيدات اختراق الخلية مثل TAT، والدهون) 5-7. كل تقنية وعادة إيجابيات وسلبيات المحددة التي قد تجعل هذه النهج كافية لبعض التطبيقات ولكن ليس للآخرين. وتشمل القضايا المشتركة الكفاءة تسليم الفقيرة و / أو عدم وجود رقابة من كمية المواد يتم تسليم 8،9، سمية أو ضار تأثير الفسيولوجية 10،11، عدم وجود رقابة الزمنية، والتسليم في خلايا قليلة ولكن ليس في السكان (على سبيل المثال، microinjection) 12، ومعقدة الاقتران الكيميائية أو صياغة خطط 11.
الصورة = "jove_content"> في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير استراتيجية تسليم الرواية التي تلتف حول هذه القيود. وتعتمد هذه الاستراتيجية على الببتيد اسمه dfTAT (ديمر TAT الفلورسنت) 13. مشتق dfTAT من الببتيد نعرف جيدا اختراق خلايا (CPP) TAT. dfTAT يحتوي على اثنين من كبريتيد العبودي نسخ من TAT المسمى مع tetramethylrhodamine fluorophore. وعلى الرغم من أوجه الشبه بينهما، TAT وdfTAT تختلف اختلافا كبيرا في النشاط. وعادة ما المنضوية TAT في الخلايا عن طريق الإلتقام. ولكن هذا CPP لا يزال محتجزا في الغالب داخل الإندوسومات (هذا يؤدي عادة إلى توزيع منقط من الببتيد داخل الخلايا عندما فحصت بواسطة المجهر مضان). مثل TAT، وendocytosed dfTAT بكفاءة عن طريق الخلايا. ومع ذلك، dfTAT لا البقاء محاصرين داخل الإندوسومات. بدلا من ذلك، انها تتوسط تسرب endosomal بطريقة غير فعالة للغاية. النشاط endosomolytic من dfTAT ثم يمكن استغلاله لتقديم الجزيئات عن طريق فحص بسيط الحضانة.
ntent "> والفهم الحالي لعملية التسليم على النحو التالي. dfTAT يدفع macropinocytosis. ونتيجة لذلك، والخلايا المحتضنة مع dfTAT يستغرق بروتينات قابلة للذوبان، والببتيدات، أو جزيئات صغيرة (جزيئات من الفائدة، وزارة الداخلية) موجودة في وسائل الإعلام من قبل المائع- الإلتقام (انظر الشكل 1). التفاعلات بين dfTAT وزارة الداخلية ليست ضرورية ما دام كل حركة المرور الكيانات معا ضمن مسار التقامي. وتصل dfTAT عتبة معينة داخل تجويف العضيات التقامي، فإنها تعرب عن النشاط تسرب endosomal لها (التفاصيل الجزيئية يبقى أن يميز تماما). مضمون لمعة من العضيات تتسرب منها المياه، وبالتالي فإن وزارة الداخلية، ثم يتم إطلاقها في الخلايا، وبالتالي هذا النهج غير مريحة للغاية كما ليس هناك حاجة لتصريف الافعال أو صياغة خطط مع وزارة الداخلية. وعلاوة على ذلك، لأن dfTAT هو لا تعديل وزارة الداخلية مباشرة، فإنه ينبغي أيضا أن لا تتداخل مع وظيفة موييس مرة واحدة ويتحقق تسليم داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تركيزتستخدم dfTAT التسليم مستقل من أن من وزارة الداخلية في وسائل الإعلام. على سبيل المثال، تركيز dfTAT يمكن أن تظل ثابتة بين التجارب المختلفة لضمان الكفاءة استنساخه في تسرب endosomal. في المقابل، وتركيز وزارة الداخلية في وسائل الإعلام يمكن أن تتغير تدريجيا لتحقيق المستويات المنشودة من وزارة الداخلية تسليمها في العصارة الخلوية.ارتفاع endosomal كفاءة تسرب تحقق مع dfTAT هي غير ضارة بشكل ملحوظ إلى العديد من الخلايا اختبار حتى الآن. هذا هو مفاجأة لأن العضيات التقامي هي عنصر هام من عناصر الخلايا ويتوقع المرء أن تسرب مثيرة بوساطة dfTAT سيرافق الاستجابات الخلوية الضارة. ومع ذلك، وتتكاثر الخلايا المعالجة في نفس معدل الخلايا غير المعالجة وعدم عرض أي تغييرات كبيرة في Transcriptome على الخاصة بهم. وعلاوة على ذلك، يمكن تكرار التسليم في غضون دقائق مع كفاءات تسليم استنساخه، مشيرا إلى أن الخلايا إما أن يتسامح أو التعافي من عملية التسليم دون أن تفقدقدرتها على الإلتقام أو تسرب endosomal. الاستجابات الخلوية خفية قد يتحقق أثناء الولادة dfTAT والتفاصيل الجزيئية ما يمكن أن تبقى هذه الردود من يكتشفها. بعد، من خلال الجمع بين الكفاءة العالية، والراحة من البروتوكولات، وعدم وجود سمية، يجب أن هذا النهج تسليم يكون مفيدا على الفور في العديد من التطبيقات المستندة إلى الخلية. وتهدف البروتوكولات الواردة في هذه الوثيقة إلى جعل هذه التكنولوجيا في متناول المجتمع البحثي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) التجميعي
ملاحظة: يتم إنتاج dfTAT في خطوتين: تجميع للfTAT مونومر عن طريق التخليق المرحلة الببتيد الصلبة تليها ثاني كبريتيد dimerization السندات لتشكيل dfTAT.
- تنتفخ 500 ملغ من حلبة أميد الراتنج MBHA في ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) في القياسية 50 مل سفينة SPPS لمدة 1 ساعة.
- أداء Fmoc deprotection التي يحتضنها الراتنج Fmoc المحمية في حل تأكسد 20٪ (20٪ تأكسد في DMF، 10 مل (0.30 ملمول). نفذ الخطوات من deprotection مرتين (1 × 5 دقائق و 1 × 15 دقيقة) مع خطوة الغسيل يستخدم DMF (الخطوة غسل يتضمن الشطف الراتنج عدة مرات مع الحجم الكلي حوالي 150 مل من DMF وإزالة المذيب عن طريق الترشيح فراغ) بين ردود الفعل.
- توليف CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) على حلبة أميد MBHA الراتنج. استخدم ما يلي Fmoc المحمية الأحماض الأمينية: Fmoc-ليز (الإنتقالي العسكري) -OH (فقط على N-المحطة)، Fmoc-ليز (بوك) -OH، Fmoc-الغليسين-OH، Fmoc-الارجنتين (PBF) -OH، Fmoc- Gقانون الجنسية (TRT) -OH، وFmoc-السيستئين (TRT) -OH. تنفيذ رد فعل باستخدام N 2 (20 PSI) للتحريض على رد الفعل. أداء جميع ردود الفعل في RT.
- تنفيذ كل الأحماض الأمينية اقتران رد فعل لمدة 4 ساعة. لكل اقتران، استخدم Fmoc المحمية الأحماض الأمينية (1.2 مليمول)، N، N، N، N '-Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-يل) uronium hexafluorophosphate (HBTU) (0.44 غرام، 1.1 مليمول )، وdiisopropylethylamine (DIEA) (0.51 مل، 3.0 ملمول) المذاب في DMF. بعد اقتران 4 ساعة، ويغسل الراتنج مع DMF وتنفيذ الخطوة deprotection Fmoc كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- كرر حتى سلسلة الببتيد خطية من fTAT: تم تصنيعه (الخطي سلسلة الببتيد CKRKKRRQRRRG لا TMR).
- ثم يغسل الراتنج بدقة باستخدام DMF الأول وبعد ذلك مع ثنائي كلورو ميثان (DCM). شطف الراتنج عدة مرات مع الحجم الكلي حوالي 150 مل من DMF أو DCM وإزالة المذيب عن طريق الترشيح فراغ.
- Uحد ذاته MALDI-TOF للتأكد من أن الببتيد حصلت لديه الوزن الجزيئي الصحيح.
- جعل مزيج المصفوفة بإضافة 1 ملغ من المصفوفة إلى حل مكونة من 50 ميكرولتر من 0.01٪ TFA في محلول من المياه و50 ميكرولتر من أسيتونتريل.
- لتأكيد الخطية سلسلة الببتيد كتلة، استخدم حمض α-Cyano-4-hydroxycinnamic. تشغيل HPLC التحليلي للالببتيد الخام وجمع 50 ميكرولتر من أعلى ذروة نقية.
- لإعداد نموذج لوحة على لوحة MALDI: إضافة 8 ميكرولتر من الببتيد إلى 2 ميكرولتر من حل مصفوفة ومكان على لوحة MALDI إلى الهواء الجاف أو على 37 درجة مئوية لوحة الحرارة.
ملاحظة: من المعروف ارجينين أن تكون الأحماض الأمينية الصعب الزوجين في SPPS. تم تأسيس ناجح اقتران عن طريق إجراء اختبار كايزر 14 (اختبار على سبيل المثال، النينهيدرين). هذا الاختبار يسمح للكشف عن الأمينات الحرة التي قد تبقى. فصل على الراتنج. في حال تم الكشف عن اللون الأزرق (يدل على وجود الأمينات الحرة)، واقتران الصورةوتتكرر teps.
- لCK (-NH-TMR) TATG (fTAT)، يلتصق مجموعة حماية الإنتقالي العسكري في مجموعة -amino من ليز على CK (-NH-الإنتقالي العسكري) TATG بمحلول مكون من حمض 1٪ trifluoroacetic (TFA) و 2٪ triisopropylsilane (TIS) في DCM.
- كما إزالة MTT مجموعة حماية من شأنه أن يؤدي إلى ظهور اللون الأصفر، واحتضان الراتنج مع 20 مل من محلول أعلاه لمدة 5 دقائق، كرر هذا حتى يتم احترام أي اللون الأصفر. غسل الراتنج مع DCM وDMF بينهما. بالإضافة إلى ذلك منذ TIS هو زبال التي من شأنها أن كنس وMTT، مرة واحدة لم يظهر اللون الأصفر في الحل في وجود MTT.
- إضافة حلا إضافيا مع 1٪ TFA في DCM (لا TIS) إلى الراتنج لضمان لا أكثر MTT تتم إزالة ويبقى الحل واضحة.
- حل المكونات الثلاثة: Carboxytetramethylrhodamine (TMR)، HBTU، وDIEA (4 و 3.9 و 10 التكافؤ في احترام لكمية من الراتنج (في ملغ)) في DMF وإضافة هذا الخليطإلى الراتنج وتنفيذ O رد فعل / N باستخدام N الجاف 2 لتقديم الإثارة.
- بعد Fmoc-deprotection وتصريف الأحماض الأمينية، وغسل الراتنج مع DCM واتركه حتى يجف. للانشقاق كاملة من الببتيد من راتنج، إضافة محلول يحتوي على 92.5٪ TFA 2.5٪ H 2 O، و 2.5٪، TIS، و 2.5٪ ethanedithiol (بتوقيت شرق الولايات المتحدة) (إجمالي حجم = 4 مل) إلى ببتيديل الراتنجات ل3 ساعة على RT لتحقيق deprotection العالمي والانقسام من الراتنج.
- ترسيب المنتجات الببتيد الخام باستخدام البارد إثيل الأثير اللامائية (ET 2 O) من خلال استنزاف الحل من الخطوة 1.6 إلى 40 مل من إت 2 O، وتدور هذه أسفل في 4 ° C و 4،000 x ج لمدة 20 - 25 دقيقة. كرر هذه الخطوة للسماح غسل الراسب مع مائي بارد إت 2 O.
- Resuspend والرواسب في الماء (5 مل أو حتى يذوب تماما راسب) ويجفد. ثم resuspend والمنتجات التي تم الحصول عليها في 0.1٪ مائي TFA / الأسيتونتريل.
<لى> إجراء تحليل HPLC مع عمود C18 التحليلي (5 ميكرون، 4 × 150 مم) لتحليل كل الببتيد. استخدام معدل التدفق من 1 مل / دقيقة، وكشف في 214 نانومتر و 550 نانومتر. - أداء HPLC شبه إعدادي على C18 10 × 250 ملم عمود لتنقية الببتيد. استخدام معدل تدفق 4 مل / دقيقة، وكشف في 214 نانومتر و 550 نانومتر. لجميع أشواط، استخدام تدرجات خطية من 0.1٪ مائي TFA (A المذيبات) و 90٪ الأسيتونتريل، 9.9٪ من المياه، و 0.1٪ TFA (المذيبات B).
- تأكيد الهوية الصحيحة من الببتيدات بواسطة MALDI-TOF وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة: fTAT، الكتلة المتوقعة: 2،041.17 والكتلة لاحظ: 2040.66. لاحظ 1،412.97 والكتلة: DEAC-K9، يتوقع كتلة 1،415.59. استخدام cyano-4-hydroxycinnamic مصفوفة حمض ألفا لMALDI-TOF.
2. الأكسدة رد فعل: الجيل dfTAT
- تهوية الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 1 ساعة (5 مل على الأقل للتفاعل أدناه).
- حل fTAT (0.3 ملغ، 1.5 × 10 -4 ملمول) في آيرATED PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 (5 مل). تأكد من أن درجة الحموضة ما بين 7،0-7،5 بعد إضافة الببتيد. إن لم يكن إضافة هيدروكسيد الصوديوم (1 M، بزيادات صغيرة 1-5 ميكرولتر) لتحقيق قيمة الأس الهيدروجيني إلى ما يصل إلى 7.4.
- ملاحظة: الأوكسجين المذاب في برنامج تلفزيوني يعمل على أكسدة المجموعات ثيول على fTAT وتشكيل السندات ثاني كبريتيد.
- Nutate يا رد فعل / N لتمكينه من الرد حتى الانتهاء (100٪ العائد على أساس تحليل HPLC). تنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة HPLC وتحليل الطيف الكتلي (MALDI-TOF) كما في الخطوة 1.9. ولاحظ 4،080.34 والكتلة: الكتلة المتوقعة 4،084.21.
- يجفد النقي dfTAT (0.71 X10 -4 ملمول) و resuspend في 200 ميكرولتر المياه (تركيز النقي dfTAT = 356،3 ميكرومتر).
3. قياس تركيز dfTAT
- و resuspend قسامة من المنقى dfTAT (عادة 1 ميكرولتر اعتمادا على كمية من الببتيد المنقى) في 149 ميكرولتر من 50 ملي TCEP الحل.
- ملاحظة: في هذه الخطوة يتم تقليل dfTAT إلى mo لهاnomer نظيره fTAT للقضاء على التبريد الامتصاصية الذي يحدث نتيجة لقربها من fluorophore TMR في dfTAT (يتم تقليل ε معامل انقراض TMR في dfTAT بالمقارنة مع ε من TMR في خفض fTAT).
- السماح للعينة للرد على ما يقرب من 20 دقيقة (HPLC التحليلية يمكن استخدامها لتأكيد تشكيل fTAT).
- إضافة كافة الحل لكفيت الكوارتز وقياس الامتصاصية في 556 نانومتر.
- باستخدام قانون بير (A = εcl: ε = 91500 M -1 سم -1) لحساب تركيز fTAT، تحديد تركيز dfTAT، وتقسيم [fTAT] من قبل اثنين.
4. التسليم التجارب الخلوية
- البذور خلايا (هيلا، HDF، الخ.) في طبق في confluency من 80-90٪ (على سبيل المثال، 8 جيدا أو 24 جيدا طبق). زراعة خلايا في المتوسط المناسب (على سبيل المثال، DMEM تستكمل مع 10٪ FBS والقلم / بكتيريا) حتى 80-90٪ confluency في 37 ° Cجو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
- غسل الخلايا ثلاث مرات (3X) مع PBS (بإضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ومن ثم إزالته ثلاث مرات).
- جعل تركيز العمل 5 ميكرومتر من dfTAT عن طريق تمييع مخزون من dfTAT (في الماء) في المختبر الوطني المرجعي-15 وسائل الإعلام (ل8 طبق بشكل جيد يجب أن يكون الحجم الكلي 200 ميكرولتر). هناك تركيز 5 ميكرومتر dfTAT يؤدي إلى التنفيذ الفعال (مستوى عال من تسليم عصاري خلوي في أكثر من 90٪ من الخلايا الموجودة في طبق) في معظم أنواع الخلايا اختبار حتى الآن (الشكل 3). ومع ذلك، وتركيزات أقل أو أعلى قد يكون أكثر ملاءمة لأنواع الخلايا مع ميل ارتفاع أو انخفاض لاختراق.
ملاحظة حول وسائل الإعلام: يستخدم المختبر الوطني المرجعي-15 للتسليم dfTAT لأنها لا تحتوي على السيستين التي يمكن أن تقلل من السندات ثاني كبريتيد في dfTAT. ومع ذلك، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن كلا العادي L-15 (مع السيستين) وDMEM يمكن أن تستخدم وسائل الإعلام التسليم. L-15 يحتوي على الحد من الحمض الأميني السيستين ولكن presumab السيستينلاي يتأكسد في وسائل الإعلام لتشكيل السيستين (وضعت DMEM مع السيستين). لذا يبقى dfTAT سليمة في وسائل الإعلام هذه ويعمل تسليم في بنفس الفعالية التي تم الحصول عليها مع nrL15. - احتضان الخلايا مع dfTAT (5 ميكرومتر) مع أو بدون البضائع (على سبيل المثال، EGFP (10 ميكرومتر)) والحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (يمكن تخفيض فترة حضانة لكن dfTAT يتطلب عادة حوالي 30-45 دقيقة للحث على تسرب endosomal ).
- غسل الخلايا مع الهيبارين (1 ملغ / مل) في L-15 (يوصى 3 يغسل) لإزالة dfTAT بد أن الغشاء البلازمي للخلايا.
- احتضان الخلايا مع وصمة عار النووية خلايا كتيمة، على سبيل المثال، Sytox الأزرق، Sytox الأخضر (2 ميكرومتر في المختبر الوطني المرجعي-15)، لتحديد ما إذا كان خطر الغشاء البلازمي للخلايا (لن تكون ملطخة الخلايا الميتة في حين أن الخلايا الحية لن) وفقا ل بروتوكول الشركة الصانعة.
- خلايا صورة باستخدام مجهر مضان (100X الغمر النفط أو الهدف 20X). صورة dfTAT باستخدام فلتر RFP (خر =560 ± 20 نانومتر / م = 630 ± 35 نانومتر).
ملاحظة: نجاح تسليم يؤدي إلى مضان منتشر في جميع أنحاء dfTAT الخلية (تقييم إيصال البروتين أو الببتيد من الفائدة سوف تعتمد على التطبيق). تلطيخ من الأنوية التي كتبها fTAT (المنتج انخفاض dfTAT عند الدخول عصاري خلوي) يمكن أن تستخدم كمؤشر على أن مضان الكشف هو داخل الخلايا. سوف fTAT تتحلل في غضون ساعات قليلة. عند هذه النقطة، فإن مضان من شظايا تدهور تظهر كما منقط. هذا لا ينبغي أن يكون الخلط لتوزيع منقط أن ينظر أيضا إذا بقيت dfTAT محاصرين دون جدوى داخل الإندوسومات (هذا يمكن أن يحدث إذا هي موجودة في منخفض جدا من تركيز dfTAT).
5. السيطرة تركيز وزارة الداخلية سلمت
- تحديد "تسليم الأمثل" التركيز المطلوب لتحقيق الافراج عصاري خلوي كفاءة dfTAT في نوع من الخلايا المستخدمة. أداء مضان المجهر على الخلايا المحتضنة في التزايد معتركيزات غرام من dfTAT. يتم تعريف تركيز dfTAT على النحو الأمثل وتركيز الحد الأدنى الذي يؤدي إلى مسح عصاري خلوي "نزع فتيل" TMR مضان في ما يقرب من 100٪ من الخلايا في الثقافة.
- تختلف تركيز وزارة الداخلية المستخدمة في بروتوكول التعاون الحضانة مع الحفاظ على تركيز dfTAT ثابت (على سبيل المثال، وذلك باستخدام تركيز تسليم الأمثل dfTAT ل). يمكن تغيير الوقت الحضانة إلى أقل من 1 ساعة أيضا أن يكون خيارا لتغيير كمية وزارة الداخلية تسليمها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم الفرق بين fTAT وdfTAT، يتم تحضين الخلايا هيلا لمدة 1 ساعة مع كل الببتيد لتحديد الفرق في توطين الخلوي. تم تقييم واستيعاب اثنين CPP باستخدام المجهر مضان. ويبين الشكل 2 أن fTAT (20 ميكرومتر) يموضع في توزيع منقط. هذا التوزيع يتسق مع الببتيد المتبقية محاصر داخل الإندوسومات. في المقابل، فإن إشارة مضان من dfTAT (5 ميكرومتر) يعرض توزيع متجانس في جميع أنحاء العصارة الخلوية ونواة الشكل 3 يبين أن توزيع عصاري خلوي من dfTAT لوحظ في عدد من خطوط مختلفة من الخلايا بما في ذلك COLO 316، NIH 3T3، HaCaT، و من الصعب ل transfect العصبية-2A، MCH58، خط الخلية الأساسي HDF، DRG-F11 وNCL-H1299. الصور 20X تبين أن نسبة عالية جدا (> 80٪) في صحن عرض توزيع عصاري خلوي من dfTAT مع أي سمية الخلوية (لا Sytox stainin النووية الأزرقز).
لتحديد ما إذا تسرب endosomal dfTAT بوساطة يسلم بروتينات كبيرة في العصارة الخلوية للخلايا. يتم اختيار EGFP (26 كيلو دالتون) كما بروتين نموذج. وذلك لأن مضان لها يمكن استخدامها للكشف عن وصولها إلى الخلايا عن طريق مراقبة توطين مخضر (مطوية إذا صحيح). للقيام بذلك الاختبار، وحضنت EGFP وdTAT لمدة 1 ساعة مع الخلايا، كما هو مبين في الشكل (4)، عرض EGFP على عصاري خلوي وتوزيع الفلورية الخضراء النووي على غرار ما لوحظ لdfTAT في أكثر من 90٪ من الخلايا دون سمية يمكن ملاحظتها.
الشكل 1. تخطيطي يظهر مبدأ dfTAT بوساطة التسليم الجزيئي. من اليسار الى اليمين. التخطيطي يظهر dfTAT تسليم الخلوية جنبا إلى جنب مع البضائع غير منفذة الخلية. أولا dfTAT يدفع الإلتقام الذي ينتج uptak(ه) من dfTAT جنبا إلى جنب مع البضائع إلى الحويصلات التقامي. في الخطوة الثانية يهرب dfTAT من الحويصلات التقامي مما يؤدي إلى الإفراج عن dfTAT وجزيء بردة خلية في العصارة الخلوية للخلايا. العصارة الخلوية من خلايا الثدييات هي بيئة الاختزالية، وبالتالي في dfTAT العصارة الخلوية وتخفض الى نظيره مونومر لها fTAT. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مضان ومشرق الميدان صور من كل خلايا هيلا حضنت مع 20 ميكرومتر fTAT (اللوحة اليسرى) و 5 ميكرومتر dfTAT (اللوحة اليمنى) باستخدام 100X الهدف. الصور أحادية اللون fTAT تظهر الخلايا التي تظهر توزيع مضان منقط مع الصور dfTAT تظهر الخلايا عرض على عصاري خلوي متجانسة وfluorescenc النووية توزيع البريد. شريط النطاق: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد تحقق الرقم 3. التسليم الفعال للdfTAT إلى الخلايا الحية في خطوط الخلايا متعددة. كانت خطوط الخلايا اختبار ما يلي: هيلا، NIH 3T3، COLO 316 وHaCaT، العصبية-2A، MCH58، HDF، DRG-F11 وNCL- H1299. وحضنت الخلايا مع 5 ميكرومتر dfTAT لمدة 1 ساعة تليها خطوة الغسيل وفقا لبروتوكول وتصويرها. كانت إشارة مضان الكشف في العصارة الخلوية ونواة الخلايا (أعلى لوحة: الهدف 20X، اللوحة السفلية: الهدف 100X). تم استخدام وصمة عار النووية خلايا كتيمة SYTOX الأزرق لتقييم بقاء الخلية بعد العلاج dfTAT. الحانات النطاق، والهدف 20X: 50 ميكرون. الهدف 100X: 10 ميكرون.jove.com/files/ftp_upload/53175/53175fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. dfTAT يسلم EGFP سليمة في خطوط مختلفة من الخلايا. تم تنفيذ (A) هيلا (اللوحة العلوية) وNIH 3T3 (اللوحة السفلية) وحضنت الخلايا مع EGFP (10 ميكرومتر) وdfTAT (5 ميكرومتر) لمدة 1 ساعة والخطوة التالية وفقا لبروتوكول. تظهر الصور توزيع مضان عصاري خلوي متجانس من EGFP في كل من خطوط الخلايا. أشرطة النطاق، 10 ميكرومتر (B) وحضنت هيلا والخلايا HDF الأولية مع EGFP (10 ميكرومتر) وdfTAT (5 ميكرومتر) وفقا لبروتوكول. تظهر الصور 20X توزيع مضان عصاري خلوي متجانس من EGFP وdfTAT في هيلا والخلايا HDF الأولية. تراكب (pseudocolor: أبيض) تشير إلى وجود dfTAT (pseudocolor: الأرجواني)، EGFP (pseudocolأو: الأخضر) في الفضاء عصاري خلوي من كل من خلايا هيلا وHDF. وقد استخدم Sytox الأزرق (كما هو موضح باللون الأزرق) لالحمير لبقاء الخلية. أشرطة النطاق: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا المستخدمة للتسليم dfTAT لا ينبغي أن تكون متموجة بشكل مفرط (> 90٪ confluency) لأن هذا قد يؤثر على كفاءة التسليم. وينبغي أيضا أن تكون الخلايا السليمة: الخلايا الميتة في الثقافة يمكن أن يطلق شظايا أفكارك التي dfTAT يمكن أن تتفاعل (على سبيل المثال، الحمض النووي من نواة المتدهورة). وهذا بدوره يمكن أن تتداخل مع كفاءة التسليم وجودة التصوير. يجب غسلها جيدا لإزالة الخلايا FBS قبل إضافة dfTAT. BSA موجودة في FBS يمكن ربط dfTAT وهذا يمكن أن تقلل من كفاءة توصيل dfTAT. ولكن ينبغي أن يؤديها يغسل مع الرعاية القوة المفرطة التي قد تسبب الخلايا الملتصقة لفصل من صحن الثقافة أو يسبب الإجهاد الذي يؤدي إلى انخفاض التقامي uptake.When تقديم بروتين / الببتيد باستخدام dfTAT، يجب أن تكون عينة بروتين / الببتيد حل سهم بما فيه الكفاية تركيزا لتفادي التخفيف المفرط للوسائل الإعلام المختبر الوطني المرجعي-15 أثناء الحضانة: على سبيل المثال، إضافة على 5-10 ميكرولتر من عينة إلى 200 μيوصى ل المختبر الوطني المرجعي-15.
يمكن fluorescently المسمى خلايا اختراق الببتيدات عرض نشاط الغشاء المخل الخفيف محرض. 15 هذا هو الحال بالنسبة لdfTAT عند استخدام جرعات عالية الكثافة الخفيفة. ويمكن أن يعبر عن نفسه من خلال تمزق عضيات داخل الخلايا (على سبيل المثال، الإندوسومات، الميتوكوندريا)، blebbing سطح الخلية، وموت الخلايا. للحد من هذه الآثار، وينبغي توخي الحذر للحفاظ على التعرض للضوء لمدة لا تقل (الظروف القياسية المطلوبة للتصوير التي كتبها متحد البؤر أو epifluorescence عادة ما يتم التسامح).
عند تسليم وزارة الداخلية مثل البروتينات، تواجه واحد لهذه المشكلة أن كل جزيء فريد من نوعه وأنه نتيجة لذلك، قد تتطلب كل تجربة تسليم صقل (أكثر مما في حالة ترنسفكأيشن DNA حيث سلمت الجزيئات هي دائما سالبة الشحنة البوليمر المصنوعة من A، T، G، وC). استكشاف الأخطاء وإصلاحها لذلك من المهم وينبغي النظر في جوانب عدة.أولا، يمكن أن البروتينات مع حزب القانون والعدالة منخفضة جدا ربط كهربية لdfTAT وإبطال مفعول ذلك. في المقابل، البروتينات مع عال جدا حزب القانون والعدالة قد يتنافس مع dfTAT للربط مع الجليكوسامينوجليكان المشحونة سلبا على سطح الخلية. هذا قد ثم خفض الإلتقام ويقلل من امتصاص دون العتبات endosomolytic. في كلتا الحالتين، والحلول الممكنة لهذه المشكلة هو زيادة تركيز dfTAT.
كما هو متوقع، وذلك بسبب وجود البروتياز الخلوية (مثل cathepsins 16) على طول الطريق التقامي، وتدهور وزارة الداخلية أثناء الولادة هو مصدر قلق. في حين يمكن للdfTAT تقديم البروتينات سليمة، لم يثبت كمية البروتين التي تتحلل كليا أو جزئيا أثناء عملية التسليم. هذا هو مرة أخرى القضية التي هي وزارة الداخلية التي تعتمد والتي ينبغي رصدها اعتمادا على التطبيق متابعتها.
dfTAT هو عامل تسليم كفاءة عالية. الأساس الجزيئي للنشاط ريما dfTAT لدائرة الهجرة والتجنيس ولكن غير واضح. على وجه الخصوص، لم يتم التعرف على السمات الهيكلية أو الكيميائية المطلوبة لتحقيق endosomal الهروب. ولذلك فمن غير الممكن حاليا التنبؤ كم يمكن تعديل هيكل dfTAT دون تغيير الكفاءة التسليم. وضعنا بالفعل أن الحاضر السندات ثاني كبريتيد في dfTAT يمكن الاستعاضة عن رابط غير اختزال دون آثار ضارة. ويجري حاليا إقامة علاقات هيكل النشاط إضافية.
وتشير البيانات المتوفرة لدينا أنه من الممكن أن ينخفض فترة حضانة من الببتيد إلى أقل من 1 ساعة (وقد تم تنفيذ ما يصل الى 5 دقائق). ومع ذلك، لم يلحظ الإفراج عن dfTAT داخل الخلايا في عدد كبير من الخلايا حتى ما يقرب من 15-30 دقيقة. هذا يشير إلى أن فترة حضانة قصيرة قد تكون كافية لdfTAT الإلتقام أو امتصاص الخلوية. ولكن الوقت هو المطلوب لendosomal النضج اللازم لdfTAT الهروب من مسار التقامي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
