Abstract
이 프로토콜은 COS7 섬유 아세포에서 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 및 후속 상호 형광 현미경 및 수화 상태에서의 전체 셀 환경 주사 전자 현미경 (ESEM)의 표시를 설명한다. 형광 양자 도트 (양자점)이 수용체의 라벨 유도 클러스터링을 회피하면서, 효율적이고 특이 단백질 표지를 제공하는 두 단계 라벨링 프로토콜을 통해 EGFR에 결합 하였다. 형광 현미경은 EGFR의 세포 위치 관련 이미지를 제공 하였다. 주사 투과형 전자 현미경 (STEM) 검출기는 나노 크기 해상도와 QD 라벨을 검출하는데 이용되었다. 생성 된 이미지는 상호 수화 그대로 셀의 자연 컨텍스트에서 단일 분자 수준에서 세포 분포 EGFR, 및 화학 양론의 데이터를 제공한다. ESEM-STEM 이미지는 수용체가 호모 다이머로, 모노머로서 존재할 수, 소규모 클러스터에서 밝혀. 두 개의 서로 다른 양자점과 라벨 붙이기,즉, 하나는 655 nm에서 발광 800에서 유사한 특성 결과를 밝혔다.
Introduction
새로운 접근 방식은 줄기 1-3, 또는 상호 형광 현미경을 사용하여 4-7 줄기 액체 상태 표시 단백질과 이미지 전체 세포에, 최근에 소개되었다. 이 방법론은 막 단백질 및 세포의 전체적인 본래 세포막의 단일 분자 레벨에서 그들의 화학량 포함한 단백질 복합체의 공간 분포를 연구 할 수있다. 여기서는 형광 양자점 (양자점)와 수용체 단백질의 두 단계를 포함하는 특정 프로토콜 라벨 (8)과 상호 광 현미경 ESEM-STEM을 설명한다. 예를 들어, 우리는 EGFR, 단백질 키나제 상과에 속하는 세포막 단백질을 연구 하였다. 리간드가 결합하면, 수용체는 활성화하고 다른 EGFR 활성화와 이합체를 형성한다; 후속 신호 캐스케이드 세포 증식 (9)를 구동한다. 비정상적인 EGFR 발현 또는 활성 선도 돌연변이는 암 (10)의 여러 종류의 중심 역할을 담당한다. 나머지 공부G 전체 세포에서이 막 수용체의 공간 배치는 그 기능과 11-14 이들의 가능한 변화에 대한 중요한 상황에 맞는 정보를 제공합니다. 그러나 종래의 직접 biochemical- 또는 현미경 법 (15) (서브 -) 세포 수준에서 EGFR 모노머, 다이머, 및 클러스터의 분포를 조사하기 어려운 남아있다. 우리의 방법은 복합 단백질의 위치를 판별 할 수 있도록 몇 나노 미터의 공간 해상도로 EGFR을 시각화 할 수있다. 가장 중요하게는, 화학량 론적 분포에 대한 정보를 획득 그대로 세포에서 단백질의 고유의 상황에 관한 것이다.
라벨과 수용체 사이의 짧은 거리를 달성하기 위해, EGFR 직접 QD에 비오틴 - 스트렙 타비 딘을 결합하여, 그 리간드 EGF로 표지 하였다. 이 레이블은 fluorescence- 및 전자 현미경을 모두 검출 할 수있다. 우리는 COS7 세포의 상호 이미지에이 라벨을 사용했다미세 유체 챔버 이전 1,16,17 안에 액체. 그러나, QD 당 분자를 스트렙 타비 딘 복수의 계정에,이 라벨은 낮은 표지 효율 또는 다소 비싼 실험 선도 수용체 클러스터링을 야기 할 수 있으며 조사 중에 단백질의 화학 양론에 체결하는 것은 불가능하다. 라벨 유도 수용체 클러스터링은 단지 하나의 스트렙 타비 딘 - 양자점 (STR-QD)가 결합되는 바이오틴 EGF를 포함하는 조사 결과, 여기에 제시된 두 단계 라벨링 절차를 이용하여 완전히 회피 할 수있다. 세포는 제 바이오틴 EGF와 함께 배양 한 후 고정한다. 정착 단계는 단백질 프로세스 (정착 속도에 따라) 정지하는 시점을 결정한다. STR-QD는 라벨 프로토콜의 두 번째 단계 이후에 적용된다. 단백질이 고정되면 단백질의 동적 막 운동을 방해하기 때문에 클러스터링은 발생하지 않습니다. 또한, STR-QD 용액, 이는실험의 가장 비싼 구성 요소는, 최적화 된 낮은 농도로 적용될 수 있고, 표지의 두 번째 단계, 즉, 몇 분 QD로 결합 될 수 있고, 시간이 중요하지 않다.
전체 세포에 분포로 EGFR의 화학 양론을 연구하기 위해, 세포 샘플은 실리콘 마이크로 칩 (18)에 제조 하였다. 두 단계 QD 표지 및 형광 현미경 화상의 기록을 적용한 후, 세포를 순수로 세정하고, ESEM-STEM (19)를 사용하여 수화 상태에 이미징. 생성 된 이미지는 상호 수화 세포의 자연적인 상황에서 EGFR 세포 분포, 및 화학 양론에 대한 정보를 제공한다. 유사한 방법은 최근 연구 7 유방암 세포에서 HER2 단백질을 연구하기 위해 사용되었다.
Protocol
라벨 및 고정 시약 1. 준비
- 멸균 인산 완충 식염수를 사용하여 라벨링 완충액 (BSA-GEL-PBS), pH 7.4의 (PBS)를 준비한다. 1 % BSA (소 알부민 분획 V, 비오틴 - 무료) 및 0.2 % 젤라틴 (GEL, 차가운 물 물고기 피부)와 소용돌이와 보충 / 잘 흔들어.
참고 : 4 ° C에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수 있습니다. - 멸균 된 인산 완충 식염수, pH가 7.4에서 세척 버퍼 (BSA-PBS)를 준비합니다. 1 % BSA와 소용돌이와 보충 / 잘 흔들어. 참고 : 4 ° C에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수 있습니다.
- 200 밀리미터에서 50 밀리미터 붕산 버퍼 (BB) 붕산 원액을 준비, pH는 200 mM의 나트륨 테트라와 8.3로 조정. 참고 : 4 ° C에서 ~ 12 개월 동안 저장할 수 있습니다.
- 0.2 M 나트륨 cacodylate 원액 0.1 M cacodylate 버퍼 (CB)를 준비, pH는 0.1 M 자당으로 보충, 7.4로 조정.
주 : 열린 원액을 4 ℃에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. - (PBS에 G를 0.1 M 글리신을 준비LY-PBS).
참고 : 4 ℃에서 1 ~ 2 개월 동안 저장할 수 있습니다. - 갓 만든 또는 연 16 % PFA의 유리 병, 원액, EM 등급에서 CB의 3 % 파라 포름 알데히드 (3 % PFA)을 준비합니다.
주 : 열린 원액을 4 ℃에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. - CB 갓 (또는 유리 병을 오픈)에서 (2 % GA) 25 % GA 원액, EM 등급에서 2 % 글루 타르 알데히드를 준비합니다.
주 : 열린 원액을 4 ℃에서 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. - 300 nm의 EGF-비오틴 라벨 솔루션을 준비
- , BSA-GEL-PBS에서 6 μm의의 EGF-비오틴 원액을 희석 마이크로 칩 당 100 ~ 200 μL의 볼륨을 사용합니다. 몇 시간 내에 사용하십시오.
- 10 nM의 STR-QD 라벨 솔루션을 준비
- 8,000 XG에서 4 분의 스트렙 타비 딘 - QD 원액을 원심 분리기 뜨는을 가지고 BB에서 1:10 희석. 양자점의 다른 유형은 예 QD655 또는 QD800 사용될 수있다. , BSA-GEL-PBS의 최종 농도로 희석 마이크로 칩 당 75 ~ 100 μl를 사용합니다. 내 사용몇 시간.
실리콘 나이트 막 마이크로 칩 2. 준비
- 청정실 조직 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 등급 에탄올, 광학 현미경에 사용되는 바와 같이, 유리 현미경 슬라이드를 청소한다.
- 낮은 먼지 수준 층류 워크 벤치에서 100 mm 직경의 페트리 접시를 열고 접시에 청소 현미경 유리를하다; 열린 접시를 둡니다.
- 우선적으로 탄소 섬유 또는 다른 코팅으로 코팅 깨끗한 핀셋, 함께, 스토리지 상자의 유리 슬라이드 위에 얇은 (50 ㎚) 질화 실리콘 막으로 4-10 마이크로 칩, 다른 후 하나를 가지고. 부드럽게 자신의 측면에 마이크로 칩을 잡고 얇은 실리콘 질화물 막으로 구성, 깨지기 쉬운 위쪽에 손이 닿지 않도록. 항상 막면이 위를 유지하기 위해 큰 관심을 가지고 그것을 만지지 마십시오.
마이크로 칩은 직사각형이어야하며 자신의 질화 실리콘으로 덮여 수직 평면 가장자리가 참고 :그들은 쉽게 파지 할 수 있도록, 얼굴. - 페트리 접시의 뚜껑을 닫고 흄 후드에 가져다. 새로운 클린 룸 조직을 얻고 배양 접시 옆을 입금. 50 ~ 70 mL의 아세톤 하나, 에탄올 비슷한 볼륨과 다른, HPLC 등급을 모두 작성하여 두 깨끗한 200 mL 유리 비커를 준비합니다. 먼저 클린 룸 조직에 유리 슬라이드에서 마이크로 칩을 전송합니다.
- 조직으로부터, 보호 레지스트 층을 제거하기 위해 아세톤으로 제 비이커에 의해 마이크로 칩 하나씩 전송할. 부드럽게 마이크로 칩이 잘 세척되도록 비커를 몇 번 이동하는 동안, 2 분을 기다립니다.
- 그들을 건조 아무 말도없이, 직접 에탄올로 비커에 마이크로 칩을 전송합니다. 2 분을 기다립니다. 그런 다음 층류 워크 벤치에 비커를 전송합니다. 새로운 클린 룸 조직을 가져옵니다.
- 조직에 칩을 전송하고 몇 분 동안 그들을 건조 할 수 있습니다. , 페트리 접시에 유리 슬라이드에 마이크로 칩을 이동 접시를 닫습니다,및 플라즈마 세정기로 가져온다.
- 플라즈마 세정기에 마이크로 칩과 유리 슬라이드 증착. 질화 실리콘 막 표면의 친수성을 렌더링하기 5 분 세정 프로그램을 실행.
참고 : 우리의 플라즈마 청소기에 적용 적합한 설정은 다음과 같습니다 70 mTorr로, O 2 11.5 SCCM과 ar을위한 35.0 SCCM, 50 W 앞으로 무선 주파수 (RF) 대상, 5 W의 RF 범위와 최대의 가스 흐름. RF를 반영합니다. - 다시 페트리 접시에 마이크로 칩으로 유리 슬라이드를 넣고 뚜껑을 닫습니다. 지금부터 멸균 마이크로 칩을 유지하기 위해주의하십시오.
- 가능한 막 파열 또는 남아있는 먼지 입자의 광학 현미경 마이크로 칩의 창 영역을 검사합니다.
- 층류 워크 벤치에 페트리 접시를 준비한다.
- 층류 워크 벤치에서 다음 항목을 넣 튜브 / 병이 0.01 %가 폴리 -L- 라이신 솔루션 멸균 함유 (. PLL, 몰 150,000-300,000을 중량, 멸균 여과하고, 세포 배양 시험), HPLC등급의 물, 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 10 % 소 태아 혈청, 혈청없이 DMEM, 새로운 청정실 조직, 무균 24- 웰 플레이트 (12 웰 플레이트가 또한 사용될 수있다), 96- 멸균 보충 웰 플레이트, 멸균 피펫 팁, 피펫, 평면, 둥근 팁, 핀셋.
- 24 웰 플레이트를 타고, 및 PLL 잘 하나를 작성 및 HPLC 등급 워터와 우물, 약을 사용합니다. 물론 당 1 ml의 부피. 약 사용, 96 웰 플레이트를 타고 무 혈청 DMEM 잘 모든 마이크로 칩에 대한 두 DMEM 보충 혈청 우물 하나를 입력합니다. 물론 당 200 μL의 볼륨.
- 마이크로 칩을 처리하기 위해 멸균 팁을 사용 핀셋 지금부터. 간단히 염이어서 핀셋의 끝을 냉각함으로써, 예를 들어,이를.
- 제 청정실 조직에 유리 슬라이드에서 마이크로 옮긴다.
조직에서 잘 PLL 채워진에 여섯 마이크로 칩까지 전송할 5 분 동안 마이크로 칩을 품어.
아니E : 더 마이크로 칩과 실험을 위해, 24 웰 플레이트에 추가 우물을 입력합니다. - 그 후 첫 번째 물이 채워진 우물에, 하나씩, 그들을 배치하여 마이크로 칩을 씻어, 거기에서 두 번째 아니라 물이 채워진에. PLL의 제거를 방지하기 위해 더 이상 약 분 이상 물에 마이크로 칩을 두지 마십시오.
- 마지막으로 96 웰 플레이트의 DMEM 가득 우물에 개별적으로 배치합니다. 세포 현탁액이 준비 될 때까지 CO 2 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 저장한다.
마이크로 칩에 대한 세포의 3. 준비
- 약의 농도의 세포 현탁액을 제조 COS7 세포의 계대 배양을 수행한다. 5 × 105 세포 / ㎖. 세포가 단 분산되어 있는지 확인합니다.
- 마이크로 칩으로 96 웰 플레이트를 가지고 각각의 마이크로 칩에 세포 현탁액 한 방울을 추가합니다. 5 분을 기다립니다.
- CHO하는 도립 현미경으로 마이크로 칩의 창 영역을 조사하기 시작무 혈청 DMEM으로 새로운 웰에 그것을 전송하기위한 바로 그 순간 OSE.
주 : 세포 밀도가 좋은 150 X 400 ㎛의 창 크기 24 COS7 세포에 대응하는, 2,500 ㎛의 2 면적 당 약 하나의 셀에 의해 달성된다. 높은 세포 밀도가 최대 세포의 평탄화를 저해 할 위험이있다. 셀이 죄 막에 정착 한 후, 그것은 새로운 잘으로 전송하는 동안 떨어져 부동에 저항 할 수있는 충분한 접착력을 개발하기 위해 3 ~ 5 분을 필요로주의하십시오. - 충분한 세포가 윈도우에 부착 한 경우 다음 웰에 마이크로 칩을 전송합니다. 이 위를 향하도록 세포와 항상 마이크로 칩을 유지하고이 쪽의 접촉을 피하십시오.
- 전송 한 후, 다시 각각의 마이크로 칩 창을 검사합니다. 너무 많은 세포가 떨어져 세척하고 남은 세포의 수가 부족하면 다시 씹다 세포 현탁액 (새로 형성된 세포 덩어리를 깰)를 반복 3.1-3.5 단계를 반복합니다.
- 전송 된 모든 마이크로 칩은 충분히있을 때자신의 창 영역에 세포 부착,. 무 혈청 DMEM과 마지막 우물에 칩을 전송 CO 2 배양기에 다시 96 웰 플레이트를 놓고 세포가 복구 할 수 있도록 몇 시간, 최선의 O / N에 대한 평평.
4. EGFR 라벨, 고정 및 형광 현미경
- 다음 단계를 위해, 96 웰, 24 웰 플레이트를 사용한다. 각각의 솔루션 우물을 미리 작성하고 마이크로 칩 당 하나의 행이나 열을 사용합니다. 24 웰 플레이트는 CB, PFA 및 GA와 정착 단계에 대한 흄 후드에서 사용된다. 항상 위를 향하도록 세포와 마이크로 칩을 전송하고이 쪽의 접촉을 피하십시오.
- 잘 신선한 BSA-GEL-PBS로에 마이크로 칩을 배치하여 마이크로 칩을 씻어 후 5 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 놓습니다.
- 37 ℃에서 3 분 동안 300 나노 EGF - 비오틴 솔루션을 품어. 세포가 EGF 표지 된 EGFR의 세포 내 이입을 시작하기 때문에, 인트하기 위해 가능한 한 빨리 진행P 4.4.
- PBS로 3 시간, CB 1 시간 (현재 96 웰 플레이트는 실온에서 다시입니다)를 씻어.
- 10 분 동안 3 % PFA에 품어.
- 칩에게 CB 1 시간, PBS로 3 회 씻어.
- 2 분 동안 GLY-PBS에 품어 1 시간 PBS로 2 회 씻어.
- 10 분 동안 10 nM의 STR-QD 부화.
- BSA-PBS로 4 번 씻어.
- 유리 바닥 35mm 요리를 실온에서 BSA-PBS로 미리 충전에 마이크로 칩을 담근다.
- QD 표지 세포의 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지와 형광 이미지를 획득.
- QD655 표지 세포의 개요 이미지 40X 공기 목적을 사용합니다. 방출 된 형광 광을 가장 효율적으로 수집 할 수 있도록 (예를 들어, 63X의 경우) 오일 침지 목표를 사용한다; QD800 표지 세포 이미징 때이 특히 필요하다.
- 420 나노 수이 상기 발광 컬렉션 (340)과 380 nm의 사이에서 형광 여기 광에 양자점을 노출하고있게 필터 큐브를 사용대부분의 양자점 (이 경우 필터 큐브) 표.
- 샘플을 손상시킬 수있는 너무 강한 빛을 피하기 위해 빛의 강도를 최소화합니다. 모든 양자점의 신호가 포착되도록 양자점의 형광이 깜박이는 동작을 가지고 있음을 지적, 적어도 300 밀리 초에 노출 시간을 설정합니다.
- 광 강도를 조정하고, 광 강도를 최소화하면서 증폭은, 가시 화상 노이즈없이 선명한 화상을 제공 할 수있다.
참고 : 이미지 시리즈가 같은 지역에서 촬영하는 경우 또는, 짧은 노출 시간을 사용할 수 있습니다. 이러한 일련의 결과 이미지 따라서 평균화 및 소음 감소를 초래 최대 투영 이미지를 산출하기 위해 처리 될 수있다.
- BSA-PBS로 가득 96 웰 플레이트의 우물에 다시 (세포가 위를 향하도록) 이미징 마이크로 칩을 놓습니다.
- CB에 마이크로 칩 1 번 씻어.
- 10 분 동안 2 % (GA)에 품어.
- CB에서 1 시간, BSA-PBS로 3 회 씻어.
- ESEM의 난 때까지 스토어 마이크로 칩maging는 BSA-PBS에 새로운 96 웰 플레이트의 우물을 미리 작성. 모든 마이크로 칩은 HPLC 등급 물 네 우물의 행을 입력합니다.
주의 : 샘플을 몇 주 동안 4 ℃에서 유지 될 수 있지만, 전체 영상 일련 이틀 수행 될 때 최상의 결과가 달성된다. 양자점은 천천히 따라서 ESEM 이미징이 완료되기 전에 10 일 이상 기다려야하지 않는 것이 좋습니다, 샘플에서 분리하기 시작합니다.
참고 : 형광 이미지가 향후 분석을 위해 저장됩니다. 이미지에서 세포의 위치를 용이하게 죄 창의 코너 지역화 및 모서리에 상대적으로 위치 측정을 통해 전자 현미경 이미지와 상관 될 수있다.
주 : 고품질의 형광 이미지를 인쇄하고 ESEM 이미지를 기록 할 때 방향을 위해 그것들을 사용하는 것이 바람직하다.
전체 세포의 5. 젖은 ESEM-STEM
- 젖은 STEM에 대한 ESEM 준비
- 가스 차 전자 D를 탑재etector (GSED) 및 (시료 밑에 위치) STEM 검출기를 포함하는 펠티에 단계.
- 무대를 통해 냉각수의 흐름을 시작하고 3 ° C까지 온도를 설정합니다.
- 무대 XY 제로 좌표를 설정하고 약 6 mm로 작동 거리를 조정합니다.
- 마이크로 칩이 스티로폼 박스, 냉동 냉각 소자에 예를 들어, 냉각과 ESEM 촬상 동안, 96- 웰 플레이트를 유지한다.
- 미리 냉각 ESEM-STEM 단계로 샘플을로드하기 위해, 냉각 용기에서 96 웰 플레이트을 닫고 열린 ESEM 스테이지에 배치합니다. 옆에 새로운 클린 룸 조직을 넣습니다.
- 신속하게 잘 HPLC 등급의 물이 가득에 대한 두 번째 위해 네 번, 각 시간을 찍기에 의해 (이 위를 향하도록 셀) 마이크로 칩을 씻어.
- 클린 룸 조직에 마이크로 칩 잠깐의 뒷면을 가릴과 미리 냉각 단계에 마이크로 칩을 놓습니다. 세포가 젖은 남아 있는지 확인이 될 수 있습니다반사 표면에 의해 인식 (무딘 표면 결과를 건조).
- 냉각 HPLC 등급 물 3 μL (피펫 팁으로 표면에 닿지 않도록해야합니다)와 시료 표면을 젖은, 무대에서 샘플을 수정합니다.
- 샘플에 가까운 무대에 세 개의 추가 3 μL 물방울를 놓습니다.
- 시료 챔버를 닫고
- . 압력에게 아빠 (800) 사이에 1500을 다섯 번 순환에 의해 시료 챔버를 제거 (800) 아빠와 함께 자전거를 종료합니다.
- 에 전자빔 (30 kV로)를 스위치 마이크로 칩 창의 위치를 검색하는 데, 즉 두 검출기, GSED 및 STEM 탐지기와 낮은 배율하에 시료를 조사한다.
주 : 물 층이 너무 두꺼운 경우, 윈도우가 표시되지 않을 수있다. 이 경우, 760 파에 압력을 낮추는 시작하고 몇 분을 기다립니다. 창 먼저 GSED으로 보이게된다. - specim을 이동시킴으로써 이미지의 중심에서의 SiN 막 윈도우를 위치무대 EN과 750-720 아빠에 압력을 줄일 수 있습니다.
주 : 수층이 충분히 얇 으면, 윈도우는 STEM 검출기를 보이게된다. - 지금부터, 이미지를 기록하기 위해 STEM 검출기의 암 필드 세그먼트를 사용한다. 우선, 전체 윈도우 영역에있는 모든 셀을 도시 한 두 개의 이미지를 획득.
- , 광학 현미경의 이미지와 함께이 ESEM 이미지를 비교 죄 윈도우의 모서리를 찾습니다.
- 이 확대, 회전 및 미러링 수를 비교하여 두 현미경 양상의 프레임 좌표 연관. 두 이미지에 동일한 세포를 찾습니다.
- 이러한 eucentric 높이, 미세 초점과 렌즈의 비점 수차의 보정으로 이미지 설정을 조정하는 작은 기능을 아주 작은 먼지 입자 또는 셀 영역을 선택합니다. 적어도 50.000X의 배율 작품은 전자 탐침 전류 약 0.6 nA의 30 μS 화소의 드웰 시간, 1024 X 884 픽셀 크기의 이미지를 사용한다.
참고 : 기타 설정은 또한 ㄱ있다E는 한 전자 선량의 증가가 회피된다 쓰인다.
주 : 매우 청결 작업 때에도 프로토콜 청정실 환경에서 수행되지 않기 때문에, 칩 표면이 실질적으로 항상 일부 먼지 입자를 함유한다. - QD 표지 세포에서 줄기 이미지를 기록하려면, 형광 이미지를 참조하여 관심의 셀을 선택합니다.
참고 : 강한 QD 신호를 나타내는 세포로 시작하는 것이 가장 좋습니다. - 이 셀의 줄기 개요 이미지를 기록합니다.
- 셀 테두리가 볼 수있는 주변 지역으로 이동 50.000X 배율에 도달 확대합니다.
- 개별 양자점을 보여주는 기록 이미지, 20 ~ 30 마이크로 초 화소 체류 시간을 사용합니다. 번만 고배율 방사선 손상, 화상 영역마다 않기 위해.
참고 : 일반적으로,이 단계 모두 초점과 비점 수차의 보정에, 일부 미세 조정이 필요합니다. - 고배율 이미지, 줌아웃, AC 및 충분한 수의 촬영 후첩 다른 줄기 개요 이미지, 바로 어두운 사각형 높은 배율로 촬영 한 지역을 묘사.
주의 : 이러한 개요 이미지 나중에 ESEM 형광 이미지의 상관 관계 및 셀룰러 맥락 고배율 이미지의 정확한 위치를 결정하는 역할을한다. - 관심 다음 셀로 진행 관련 화상으로 시작 고배율 일련의 이미지를 기록하고 관련 화상으로 끝난다.
- ESEM 이미징 세션이 종료되면 챔버 배출을 시작하기 전에 8백50부터 9백까지 파에 압력을 증가시킨다.
주 : 압력이 증가가 여전히 습윤면에 마이크로 칩을 회수의 기회를 향상시킨다; 그러나, 이것은 항상 달성 될 수 없다. 원한다면 밖으로 건조 된 적이없는 샘플은 이후의 다른 시점에 ESEM에서 재조사, BSA-PBS로 복원 될 수있다.
Representative Results
그림 1과 2는 그대로, 완벽하게 수화 COS-7 세포에서 시각 QD655 표시, 막 결합 EGFR의 대표 이미지를 보여줍니다. 도 1에 DIC 이미지는 세포막 지형의 인상을주고,도 1b에 대응하는 형광 이미지는 EGF-비오틴 인큐베이션.도 1a의 3 분 후에 EGFR의 분포를 도시하고 B는 각각 두에서 함께 스티칭 40X 공기 목적으로 촬영 한 이미지. EGF 활성화 된 EGFR은 전체 세포 표면에 분포되어있다. 대부분의 세포에서 형광 (도 1b)의 약간의 향상은 EGFR (20)의 발생을 국부적으로 증가 나타내는 셀 에지에서 볼 수있다. 유사한 프로토콜을 이용하여 수행 대조 실험 (데이터는 제시하지 않음) 특정 EGFR 라벨링 검증. 이 컨트롤이 포함 : CE 이전 배양없이 1) 제어 표시비 바이오틴 EGF 및 STR-양자점과 EGF-비오틴, 즉, STR-양자점 만 배양하고, 2) 배양으로 재편.
사각형으로 표시된 3 개의 셀이 더 ESEM-STEM으로 조사 하였다. 그림 1C에 묘사 된 ESEM-STEM 이미지 - E는 이러한 세포의 낮은 배율 개요를 보여줍니다. 이러한 영상 전송 질화 실리콘 (SiN) 뷰잉 윈도우와 실리콘 마이크로 칩 상에 배치 셀 위에 상주 물의 박층 수화 상태에서의 전체 세포를 반영한다. 현미경 함유 수증기의 진공 챔버 및 샘플 온도와 압력의 균형은 세포 위에 액체의 얇은 층을 유지하도록 조절 하였다. 개별 셀을 용이하게 죄 막 창에 자신의 형상 및 위치의 계정 인식 할 수있다. 낮은 배율 ESEM-STEM 이미지는 이웃하는 셀쪽으로 셀 에지로부터 연장 filopodia 같은 미세 구조를 보여, 어떤 구조얇은 셀 영역 내부. 샘플을 통한 전송은 사용되는 에너지 (30 keV로)의 전자에 대한 수 없기 때문에 핵을 포함하여 세포질 두꺼운 중앙 영역이 하얗게.
고해상도 ESEM-STEM 이미지는 얇고, 주변 지역에서 기록되었다. 얇은 액체 층에있는 세포의 얇은 영역에서 나노 입자의 ESEM-STEM의 공간 해상도는 3 nm의 금액에 대한 이전 연구 (6)에서 산출 된 것입니다. 도 2a에 도시 된 네 개의 고해상도 이미지 - D가도 1C에 작은 사각형의 위치에 기록 된 - E. 배율만큼 밝은 포탄 형 봉 나타나는 개개의 양자점을 식별하기에 충분한 사용 하였다, 각각 개별 바인딩 EGFR. QD655는 6 × 14 nm의 2의 일반적인 크기를 가지고있다.
직사각형 영역에 대응하는도 2A는 (Figu에서 셀에 표시된1C 재) 막에 QD 라벨 이미지를 건너 대각선으로 접어 보여줍니다. 이 막 구조물은 주변 막 영역보다 더 높은 EGFR 밀도를 갖는다. 여러 위치에서, 두 개의 레이블은 가까이에 있었다. 20 및 24 나노 미터의 거리와 두 가지 예는 화살촉으로 표시됩니다. 레이블이 쌍 EGFR의 이량 체에 속하는 것으로 해석된다. 그림 2B 셀 (그림 1D, 왼쪽 사각형)의 가장자리에서 예를 보여주고, EGFR 단량체 및 이량 체뿐만 아니라 볼 수 있습니다. 그림 (c) (그림 1C 오른쪽 사각형) 낮은 형광 신호, 즉, 하부 EGFR 밀도 영역으로 기록 하였다. 그럼에도 불구하고, EGFR은 또한뿐만 아니라 이량 여기에서 발견되었다. 또한, 10 또는 11의 EGFR을 두 개의 클러스터가 존재 하였다 (타원 참조).도 2D 여러 단량체 이외에, 5-6 EGFR을 포함한 더 작은 클러스터를 가진 멤브레인 배 (도 1E)의 다른 예를 도시및 이량 체.
도 2의 모든 라벨을 위치 결정하고,이 데이터 쌍 상관 함수 21g (X)로부터 획득 될 수있는 정보의 종류의 예로서. 이러한 분석은이 프로토콜의 일부가 아닌 상기 프로 시저가 기술되었다 유의 다른 곳에서 6,7. g (X)는 기준 입자로부터 일정한 반경 방향 거리 (X) 내에서 발견되는 입자의 가능성의 척도이다. g (X) = 1 랜덤 분포를 나타내며, 더 큰 값은 클러스터링의 증거이다. 210 라벨의 총의 위치는 자동으로도 2A-D의 4 개의 이미지에서 검출하고, g (X)는 5 nm의 빈 크기 10 nm의 대역폭을 갖는 평활화 필터를 사용하여 계산 하였다. g (x)는 곡선 (도 3)은 25 ㎚의 바람직한 중심 간 QD 거리를 나타낸다. EGFR을 따라서 무작위로 지향하지만 그들 중 상당 부분이 선호하는 거리에 존재하지 않습니다. approximat에서전자 분자 모델 6 (도 3 인셋) 우리 QD와 EGF 결합 포켓 사이의 중심 간 거리가 금액 것으로 추정하기 ~에게 EGFR 이합체 부착 개의 양자점 사이에 14 nm의, 및 중심 대 중심 거리 ~ 27 nm의 (이 값이 때문에 링커의 유연성에 몇 나노 미터에 따라 다를 것입니다)을합니다. 바람직한 라벨의 거리에있어서의 정밀도 내에서 EGFR 다이머 라벨의 예상 거리에 따라서 일치한다. g (x)의 곡선과 일치하는 데이터 클러스터의 존재를 나타내는, 최대 300 nm의 거리의 1보다 크다. 이 분석은 EGFR의 화학 양론이 우리의 방법으로 연구 할 수 있음을 보여줍니다.
도 4는 라벨이 EGF-QD800 수행하고, 63X 오일 침지 목적은 형광 이미지를 사용한 것을 제외하고,도 2와 비슷한 결과를 나타낸다. 이 데이터는 이러한 전형적인 결과도 때 발견되는 것을 확인EGFR 라벨링 가까운 적색 스펙트럼에서 발광 양자점으로 수행된다.도 4a는 대표적인 세포의 형광 화상은,도 4b는 ESEM-STEM 개요 모드에서 동일한 셀을 도시하고도 4C는 기록 150,000 X 배율 이미지이며 셀 멤브레인의 상부 테두리에 (도 4b에 사각형을 참조). (2A)와 D를 그림과 같은 이미지가 막 배에 QD 표지 EGFR을 캡처하고, 단량체 이량 체 및 클러스터 수용체를 보여줍니다. 전자 밀도 QD 코어 ~ 5 nm의 자신의 작은 코어 크기 (22)과 일치하는 655 nm에서 발광 양자점의 코어보다 약간 작고 라운드를 표시합니다.
그림 1. 상호 DIC, EGF-QD655의 형광 및 ESEM-STEM은 완전히 수화 COS-7 세포에 EGFR을 표시 룽>. 원형질막의 인상을주는 지형의 SiN 막 윈도우 영역에 성장 된 세포의 (A) DIC 이미지. 중앙에 위치 된 SiN 막에 창을 나타내는 세포 (B) 형광 화상 (점선 사각형으로 표시). (C - E) A와 B의 사각형으로 표시 세포에서 세 ESEM-STEM 낮은 배율 이미지. 이들 세포 관련 이미지는이어서 기록 된 고해상도 이미지의 정확한 위치를 결정하는 역할을한다. (그림 2A-D 참조) 네 개의 고해상도 이미지의 위치는 흰색 사각형으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
반경 방향 거리의 함수로서도 3의 쌍의 상관 함수 g (X)는 인터 - 이상적 상대 x를 결정 도 2A-D에서 검출 된 모든 210 라벨 CLE 거리. 중심 간 QD 거리는 AG는 (X) = 1 랜덤 확률을 나타내고있다 랜덤 이상 발생의 훨씬 더 높은 가능성을 가지고 있음을 나타낸다 내지 25에서 피크. 점선은 임의의 분포의 눈 나타내는 g (X)에 대한 가이드이다. 삽입이 결합 된 EGF와 비오틴를 통해 연결된 스트렙 타비 딘 코팅 된 양자점과 EGFR 이합체의 대략적인 분자 모델을 보여줍니다. 스트렙 타비 딘의 모델은 EGF 및 EGFR은 1stp (스트렙 타비 딘), 1EGF (EGF)의 CPK 모델에서 얻어, 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO 및 2GS6 (EGFR) Jmol 버전에 의해 생성 된 RCSB 단백질 단백질 데이터뱅크에 구조 12.2.15. RCSB 리간드 Explorer 버전 1.0에서 그린으로 비오틴 모델입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 4. 실시 COS-7 세포 EGF-QD800으로 표시하고 상호 형광 및 ESEM-줄기 군데. (A) 형광 이미지, (B) 낮은 배율 개요 ESEM-STEM 이미지입니다. (C) 150,000X 배율 B 사각형의 위치에 기록 된 고해상도 이미지. , 단량체 이량 체 및 클러스터 된 EGFR이 EGF-QD655와 라벨 유사 검색됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
전체 세포와 같은 EGFR과 막 단백질의 공간적 분포 및 화학 양론을 공부하는 것은 그 기능과 11-14 이들의 가능한 변화에 대한 중요한 상황에 맞는 정보를 제공합니다. 이 정보는 직접 또는 전지 셀 (15) 간의 차이는 단백질의 위치 파악에 대해 손실되는 일반적으로 사용되는 생화학 적 방법을 이용하여 세포 내 수준의 단량체, 이합체, 및 클러스터의 분포를 연구하기 위해 도전. 그 화학량 개별 그대로 셀 4-7의 컨텍스트 내에서 연구 할 수 있도록 여기에 기재된 라벨과 현미경 방법은 몇 나노 미터 길이 규모 단백질 복합체의 시각화를 허용한다. 이것은 (슈퍼 해상도) 광학 현미경 (23)의 해상도는 단백질 복합체에 종사하는 분자를 구별하기에 충분하기 때문에 불가능합니다. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)는 앙상블 평균 기법 <이다24> SUP, 반드시 에너지 전달 (25)의 근거리의 결과로서 다이머 및 고차 클러스터를 인식하지 않는다. 근접 결찰 분석법 (26)는 실제로는 거리를 측정하지 않으며, 따라서 유사한 단백질 밀도 셀룰러 영역에서, 우연에 의해 검출 된 인접도의 숫자 선도 필연적으로 높은 단백질 농도와 셀룰러 영역을 구별하지만 단백질을 포함 할 수없는 않는다 레이블 사이에 별개의 거리를 나타내는 단지. 단백질 복합체의 성분을 시각화 할 필요는 고해상도 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 달성된다. 그러나, 전체 셀은 종래의 TEM 플라즈마 막 (27), 또는 세포막 리핑 통해 슬라이스 또는 임의로 형성된 막의 작은 조각 (28, 29)의 결과를 깨는 얇은 샘플 / 섹션의 요구에 의해 제한된다. 세포막 따라서 부족으로 이어지는 전체 묘화되지의 가능성이 중요한 세포 상황에 맞는 정보를 제공합니다.
세포 내 단백질의 화학량 다른 실험적 연구 과제인가 단백질 표지로부터 발생한다. 일반적으로 사용되는 immunolabeling 수용체와 레이블 사이에 일대일 화학량 만 가의 프로브로 달성 될 수있는 어려움을지지; 일차 및 이차 항체가 요구되는 경우는 그렇지 않다. 단백질 화학량 론에 대한 정보를 획득하기 위해서는 프로브가 수용체 상에 하나의 에피토프에 결합하고, 고유 형광 프로브 또는 다른 측면에 높은 원자 번호의 나노 입자에 대한 하나의 결합 부위를 갖는 것이 요구된다. 이웃 단일 단백질, 동종이 량체, 또는 더 큰 클러스터 사이의 차별이 가능하지 않을 수 있도록 둘째, 항체 - 라벨에 달성 할 수있는 정밀도는 적어도 EGFR 가족의 수용체를 들어, 30 nm의 그들의 큰 크기 (30)의 계정에 제한됩니다. 훨씬 작은 특정 레이블은 문학과 캘리포니아에 공지되어있다N 세포 내 라벨 (31)에 대해서도 적용 할 수 있지만, 사람들은 일반적으로 사용되지 않습니다. 전체 레이블 (EGF-비오틴 스트렙 타비 딘 - QD)의 길이는 EGFR과 동일한 치수이고, 충분히 작은은 이량 체를 검출 할 수 있도록. 더욱이, 설명 된 두 단계의 절차는 라벨 표지 유도 수용체 클러스터링을 피한다.
우리의 방법은 매우 어려운,별로 표지 단백질의 형광 현미경보다 더하지 않습니다. 단계의 수를 가산하고, 단계 중 하나에서 에러가 실험에서 완전한 실패로 이어질 수 있기 때문에, 실험, 신중을 실시 할 필요가있다. 마이크로 칩을 처리하는 것은 권장 TEM 그리드하지만 일부 교육 빈 칩의 처리보다 더 지루하지 않습니다. 전체 수화 세포의 ESEM-STEM은 아마 가장 어려운 측면, 그리고 양자점을 시각화하기 위해 필요에 따라 3 nm의 주위에 해상도에 도달하기 위해 적어도 숙련 된 작업자과 실천의 몇 일을 필요로한다. 방사선 댐조사에서 표본의 연령은 위험을 선물한다. 압력 및 온도는 조심스럽게 물 층을 유지하기 위해 감시한다. 또한, 수층의 두께는 셀마다 다를 수있다. 다른 곳에서 기술 된 바와 같이도 6 또한, 상기 시료 가스의 전자 검출기를 사용하여 수층의 존재를 모니터링하는 것이 바람직하다. 셀룰러 영역은 손상을 방지하기 위해 한 번 또는 두 번에 이미징되어야한다.
방법의 중요한 한계는 미세 구조에 대한 고해상도 정보가 존재하지 않는 점이다. 다른 기술들은, 예, 크라이 TEM 들어 단백질 구조 및 세포 미세 구조 (15)을 연구하기 위해 필요하다. 둘째, 시간 경과 현미경에 살고있는 세포에서 단백질의 다수의 동적 상호 작용을 연구하는 방사선 손상의 계정에 가능하지 않고, 최첨단 광학 현미경 (23)이 필요합니다. 현재, 우리의 방법은 L 이후 다이머의 절대 레벨을 판정 할 수 없다abeling 효율은 알 수 있지만, 우리는 미래에 같은 데이터를 추가 할 전망이다. 이 이합체가 존재하거나없는 경우 알려 그럼에도 불구하고 할 수있다. 문헌에서 이것은 15 % 주변에도 표지 효율이 충분한 통계적 유의성 32 량체를 검출하기에 충분히 있음을 공지한다.
그것은 특정 항체의 Fab 단편 바이오틴 통해 그들의 리간드 통해 다른 막 결합 수용체를 연구하기 쉽게 할 수있다, 또는 설명한 두 단계 라벨링 프로토콜을 사용하여 다른 작은 링커를 통해 7. 이미 양자점의 두 개의 서로 다른 색 (크기)이 사용될 수 있으며, 금 나노 입자 표지 6 일 이전에 사용한 것을 증명하고 있기 때문에, 동일한 실험의 여러 단백질 종에 라벨을 실현 가능한 것으로 보인다. 여러 단백질 종의 화학 양론의 연구를위한 중요한 과제에 대하여 얻어지는 상대적인 화학량 론의 양 정규화 종 또는 적어도 유사한 표지 효율을 보장한다표지 효율 필자. 그러나, 본 연구에서 사용 된 두 개의 다른 양자점은 (도 2 및 4 참조) 표지 효율 크게 다르지 보이지 않는다. 양자점 두 단계 라벨링 및 상호 형광 현미경 ESEM-STEM 관련된 기재된 방법은 전체 세포의 세포막 손상에 막 단백질의 복잡한 상호 작용을 연구하는 실용적인 방법을 제시한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | AF6000 + DMI6000B | |
| ESEM | FEI Company | Quanta 400 FEG | |
| DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid | Gibco | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) | Gibco | 16000-036 | |
| Cellstripper | Mediatech, Inc. | 25-056 Cl | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| PBS Roti-Stock 10x PBS | Carl Roth | 1058.1 | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) | Carl Roth | O163.2 | |
| Gelatin, from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041-500G | |
| Glycine | Carl Roth | T873.1 | |
| Epidermal Growth Factor | Molecular Probes | E3477 | Biotin-XX Conjugate (biotin EGF) |
| Sodium teraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | S9640-500G | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | |
| Qdot 655 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10121MP | |
| Qdot 800 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10173MP | |
| Silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | Custom made |
References
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