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Bioengineering

Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

Published: September 11, 2015 doi: 10.3791/53186
Automatic Translation
1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

Abstract

Este protocolo descreve a rotulagem de receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) em células de fibroblastos COS7, e microscopia de fluorescência correlata subseqüente e microscopia eletrônica de varredura ambiental (ESEM) de células inteiras em estado hidratado. Pontos quânticos fluorescentes (QDs) foram acoplados a EGFR por meio de um protocolo de marcação de dois passos, proporcionando uma marcação de proteínas eficiente e específico, evitando ao mesmo tempo induzida pelo rótulo agrupamento do receptor. A microscopia de fluorescência fornecida imagens visão geral dos locais celulares do EGFR. A microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) detector foi utilizado para detectar os rótulos QD com resolução nanométrica. As imagens resultantes correlativos fornecer dados da distribuição do EGFR celular, e a estequiometria, a nível molecular único no contexto natural da célula intacta hidratado. ESEM imagens de haste revelou o receptor estar presente como monómero, como homodímero, e em pequenos aglomerados. Marcando com dois QDs diferentes,isto é, um que emite a 655 nm e a 800 revelou resultados semelhantes característicos.

Introduction

Uma nova abordagem foi introduzida recentemente, a células inteiras imagem com proteínas marcadas em estado líquido usando STEM 1-3, ou microscopia de fluorescência correlativa e STEM 4-7. Esta metodologia é capaz de se estudar a distribuição espacial das proteínas da membrana e complexos de proteína incluindo a sua estequiometria no nível de molécula individual nas membranas plasmáticas de células inteiras intactas. Aqui, descrevemos um protocolo envolvendo uma rotulagem específica de dois passos de proteínas receptoras com pontos quânticos fluorescentes (QDs) 8, e microscopia de luz e correlativo ESEM-STEM. Como exemplo, estudou-se a EGFR, uma proteína de membrana que pertencem à superfamília de proteínas quinase. Após a ligação ao ligando, o receptor é activado e, em seguida, forma um dímero com o EGFR outra activado; a cascata de sinal subsequente conduz a proliferação de células 9. As mutações que conduzem à expressão ou actividade anormal de EGFR desempenham um papel central em muitos tipos de cancro 10. Estudo emg o arranjo espacial deste receptor de membrana em células completas fornece informações importantes sobre a sua função de contexto e possíveis alterações dos mesmos 11-14. Mas continua a ser um desafio para investigar a distribuição de monómeros EGFR, dímeros e clusters diretamente em um (sub) nível celular com métodos convencionais de microscopia biochemical- ou 15. O nosso método é capaz de visualizar os EGFR com uma resolução espacial de poucos nanómetros de tal forma que a localização de proteínas no complexo pode ser determinada. Mais importante ainda, a informação obtida sobre a distribuição estequiométrica refere-se à situação nativa da proteína na célula intacta.

A fim de alcançar uma curta distância entre a etiqueta e o receptor, o EGFR foi marcado directamente através do seu ligando EGF, usando uma ligação biotina-estreptavidina para um QD. Esta etiqueta pode ser detectado tanto com microscopia fluorescence- e eletrônica. Temos utilizado este rótulo para a imagem latente correlativo de células COS7 emlíquido fechado em uma câmara microfluídicos anteriormente 1,16,17. No entanto, em virtude de um múltiplo de estreptavidina moléculas por QD, esta etiqueta pode induzir a aglomeração do receptor, levando a uma baixa eficiência de marcação ou experiências bastante caros, e não é possível concluir, a estequiometria da proteína sob investigação. Agrupamento receptor induzida etiqueta pode ser evitada através da utilização do procedimento de marcação de dois passos aqui apresentados, o que resulta em uma sonda compreendendo EGF biotinilado a qual apenas um quantum dot-estreptavidina (STR-QD) está acoplado. As células são primeiro incubadas com o EGF biotinilado, e em seguida fixado. O passo de fixação determina o ponto no tempo em que os processos de proteína são parados (dependendo da velocidade de fixação). STR-QD é aplicada posteriormente, a segunda etapa do protocolo de rotulagem. Clustering não ocorre desde que o movimento da membrana dinâmica das proteínas é impedida uma vez que as proteínas são fixadas. Além disso, a solução STR-QD, que é amais caro componente do ensaio, pode ser aplicado em uma baixa concentração optimizada, e este segundo passo de rotulagem não é tempo-fundamental, ou seja, o QD pode ser acoplado em vários minutos.

Para estudar a estequiometria de EGFR como distribuídas em células inteiras, as amostras celulares foram preparadas em microchips de silício 18. Depois de aplicar a rotulagem QD em duas etapas, e a gravação das imagens de microscopia de fluorescência, as células foram enxaguadas com água pura, e fotografada em estado hidratado usando ESEM-STEM 19. As imagens resultantes correlativas fornecem informações sobre a distribuição celular do EGFR, e a estequiometria no seu contexto natural de células hidratadas. Um método semelhante foi utilizado para estudar proteínas HER2 em células de cancro da mama num estudo recente 7.

Protocol

1. Preparação de Rotulagem e Fixação Reagentes

  1. Preparar tampão de marcação (BSA-PBS-GEL) usando salina tamponada com fosfato esterilizado, pH 7,4 (PBS). Suplemento com 1% BSA (albumina bovina fracção V, livre de biotina) e 0,2% de gelatina (GEL, a partir de pele de peixe de água fria) e vortex / agite bem.
    Nota: Pode ser armazenado durante ~ 5 dias a 4 ° C.
  2. Preparar o tampão de lavagem (PBS-BSA) a partir de solução salina tamponada com fosfato autoclavado, pH 7,4. Suplemento com 1% de BSA e vortex / agite bem. Nota: Pode ser armazenado durante ~ 5 dias a 4 ° C.
  3. Preparar tampão borato 50 mM (BB) a partir de 200 mM de solução stock de ácido bórico, o pH ajustado a 8,3 com tetraborato de sódio 200 mM. Nota: Pode ser armazenado durante ~ 12 meses a 4 ° C.
  4. Preparar tampão de cacodilato 0,1 M (CB) de solução de estoque de cacodilato de sódio 0,2 M, pH ajustado para 7,4, suplementado com 0,1 M de sacarose.
    Nota: solução estoque aberto pode ser armazenado durante ~ 5 dias a 4 ° C.
  5. Prepare a glicina 0,1 M em PBS (LLY-PBS).
    Nota: Pode ser armazenado durante ~ 2 meses a 4 ° C.
  6. Prepare paraformaldeído a 3% na CB (3% PFA) de recém-feitos ou aberto frasco de 16% PFA, solução estoque, EM grau.
    Nota: solução estoque aberto pode ser armazenado durante ~ 5 dias a 4 ° C.
  7. Prepare glutaraldeído 2% na CB (2% GA) a partir de recém-feitos (ou aberto frasco de) solução estoque GA 25%, EM grau.
    Nota: solução estoque aberto pode ser armazenado durante ~ 5 dias a 4 ° C.
  8. Preparar solução de etiquetagem 300 nM de EGF-biotina
    1. Diluir solução-mãe de EGF-biotina 6 uM em BSA-PBS-GEL, usar um volume de 100-200 uL por microchip. Use dentro de algumas horas.
  9. Prepare 10 solução de etiquetagem nM STR-QD
    1. Centrifugue a solução de estreptavidina-QD durante 4 min a 8.000 x g, o sobrenadante e tomar diluir 1:10 em BB. Diferentes tipos de QDs pode ser utilizado, por exemplo, QD655, ou QD800. Dilui-se a concentração final de BSA-PBS-GEL, usar 75-100 ul por microchip. Use dentroalgumas horas.

2. Preparação de nitreto de silício membrana Microchips

  1. Limpar uma lâmina de vidro de microscópio, como usado para a microscopia de luz, com um tecido de sala limpa e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), etanol de qualidade.
  2. Em uma bancada de fluxo de ar laminar com um nível de poeira baixa, abra uma placa de Petri de diâmetro 100 mm, e colocar o vidro de microscópio limpa no prato; deixar a cápsula aberta.
  3. Com pinças limpas, preferencialmente revestidas com fibra de carbono ou outro revestimento, tomar 4-10 microchips com finas (50 nM) membranas de nitreto de silício, uma após a outra, para fora da sua caixa de armazenamento e para a lâmina de vidro. Pegue os microchips suavemente ao lado do corpo e evite tocar no lado superior frágil, que consiste na membrana de nitreto de silício fina. Tome muito cuidado para manter sempre o lado da membrana para cima e não tocá-lo.
    Nota: Os microchips deve ser rectangular e tem bordas planas perpendiculares ao seu nitreto de silício cobertocara, de modo que pode ser agarrada facilmente.
  4. Fechar a tampa da placa de petri e trazê-lo para uma hotte. Obter um novo tecido quarto limpo e depositá-lo ao lado da placa de Petri. Prepare duas provetas de 200 ml limpo de vidro por um enchimento com 50-70 ml de acetona, e o outro com um volume semelhante de etanol, ambos de qualidade para HPLC. Transfira os microchips da lâmina de vidro primeiro para o tecido sala limpa.
  5. A partir do tecido, microchips transferir um por um para o primeiro recipiente com acetona para remover a camada protectora resistir. Espera 2 min, enquanto se move suavemente a proveta algumas vezes para garantir que os microchips são bem enxaguado.
  6. Transfira os microchips diretamente no copo com etanol, sem deixá-los secar. Aguarde 2 min. Em seguida, transferir o copo para o ambiente de trabalho fluxo de ar laminar. Obter um novo tecido sala limpa.
  7. Transfira as batatas fritas para o tecido e deixe-os secar por alguns minutos. Transfira os microchips para a lâmina de vidro na placa de Petri, feche o prato,e trazê-lo para o limpador de plasma.
  8. Depositar a lâmina de vidro com os microchips para dentro do aspirador de plasma. Executar um programa de limpeza 5 minutos para tornar a superfície da membrana hidrofílica de nitreto de silício.
    Nota: Os ajustes adequados aplicados para o nosso limpador de plasma são: 70 mTorr, o fluxo de gás de 11,5 sccm para O 2 e 35,0 sccm para Ar, alvo de 50 W de frequência de rádio para a frente (RF), faixa de RF 5 W e max. RF reflectido.
  9. Coloque a lâmina de vidro com o microchip de volta para a placa de Petri, e feche a tampa. Tome cuidado para manter os microchips estéril a partir de agora.
  10. Examine as áreas das janelas dos microchips sob um microscópio de luz para possíveis rupturas de membranas ou restantes partículas de sujeira.
  11. Traga a placa de Petri para a bancada fluxo de ar laminar.
  12. Coloque os seguintes itens na bancada laminar do fluxo de ar: tubos / frascos contendo esterilizado 0,01% poli-L-lisina solução (. PLL, Peso Mol 150,000-300,000, esterilizada por filtração, e cultura de células testada), HPLCágua grau de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, meio DMEM sem soro, um novo tecido de sala limpa, um estéril placa de 24 poços (de uma placa de 12 poços também pode ser utilizado), uma solução estéril 96- bem placa, pontas de pipeta estéreis, uma pipeta, e plana, ponta arredondada, pinças.
  13. Pegue a placa de 24 poços, e preencher um bem com PLL, e dois poços com água para HPLC, use um aprox. volume de 1 ml por poço. Aqui a placa de 96 poços e para preencher todos os microchip dois poços com soro de DMEM suplementado e uma bem com DMEM isento de soro, usar um aprox. volume de 200 ul por poço.
  14. A partir de agora use uma pinça com pontas estéreis para lidar com os microchips. Alcançar este objectivo, por exemplo, por flamejante brevemente e, posteriormente, se refrescar as pontas das pinças.
  15. Primeiro transferir os microchips da lâmina de vidro sobre o tecido sala limpa.
    A partir do tecido, transferir até seis microchips para o PLL-cheia bem, incubar os microchips durante 5 min.
    NãoE: Para uma experiência com mais microchips, encher poços adicionais na placa de 24 poços.
  16. Subsequentemente enxaguar os microchips, colocando-os, um-por-um, para o primeiro poço cheio de água, e a partir daí para a segunda água enchido poços. Não deixe os microchips na água mais do que cerca de um minuto para evitar a remoção de PLL.
  17. Finalmente colocá-los individualmente em poços de DMEM-cheias de a placa de 96 poços. Armazenar a placa de 96 poços na incubadora de CO 2 até que a suspensão de células é preparada.

3. Preparação de células em Microchips

  1. Realizar uma subcultura de células COS7 para preparar uma suspensão de células com uma concentração de aprox. 5 x 10 5 células / mL. Certifique-se de que as células são separadas pelo mono.
  2. Aqui a placa de 96 poços com os microchips e adicionar uma gota de suspensão de células a cada micropastilha. Espere 5 min.
  3. Comece a examinar as áreas das janelas dos microchips com um microscópio invertido a CHOose o momento certo para transferi-lo para um novo bem com DMEM isento de soro.
    Nota: Uma boa densidade de células é conseguida com cerca de uma célula por 2.500 uM área 2, correspondendo a 24 células COS7 em um tamanho de janela de 150 x 400 m. Densidades celulares mais elevadas têm o risco de afectar achatamento máxima das células. Esteja ciente de que, depois de uma célula se estabeleceu sobre a membrana SIN, ele precisa de 3-5 min para desenvolver adesão suficiente para resistir flutuando durante a transferência para o novo bem.
  4. Transferir microchip para o poço seguinte quando as células aderiram suficientes para a janela. Mantenha os microchips sempre com as células para cima e evitar qualquer toque deste lado.
  5. Após a transferência, examinar cada janela microchip novamente. Se demasiadas células foram lavadas e o número de células restantes é insuficiente, re-triturar a suspensão de células (para quebrar aglomerados de células recentemente formadas) e repetir os passos 3,1-3,5.
  6. Quando todos os microchips transferidos têm o suficienteaderindo células nas suas áreas de janela, transferir as fichas para o último poço com DMEM isento de soro. Colocar a placa de 96 poços de volta na incubadora de CO 2 e deixar que as células recuperam e achatar para várias horas, melhor S / N.

4. EGFR Etiquetagem, Fixação, e microscopia de fluorescência

  1. Para os passos seguintes, utilizar um de 96 cavidades e uma placa de 24 poços. Pré-preencher poços com as respectivas soluções, e usar uma linha ou coluna por microchip. O 24- poços é usada sob o exaustor para as etapas de fixação com CB, PFA e GA. Sempre transferir microchips com as células voltadas para cima e evitar qualquer toque desse lado.
  2. Lavar microchips colocando os microchips em um poço com fresco BSA-PBS-GEL, em seguida, colocá-placa de 96 poços, numa incubadora a 37 ° C durante 5 min.
  3. Incubar com 300 nM de solução de EGF-biotina durante 3 min a 37 ° C. Porque as células vão começar a endocitose de EGFR marcado pelo FEG, faça o mais rápido possível para steP 4.4.
  4. Lavar 3 vezes com PBS e 1 vez com CB (agora a placa de 96 poços é novamente à TA).
  5. Incubar em 3% PFA durante 10 minutos.
  6. Lavar 1 vez com chips de CB, e 3 vezes com PBS.
  7. Incubar em Gly-PBS durante 2 minutos, lavar 2 vezes com PBS 1 hora.
  8. Incubar em 10 nM STR-QD para 10 min.
  9. Lavar 4 vezes com PBS-BSA.
  10. Submerge um microchip num prato de 35 mm com fundo de vidro pré-cheia com BSA-PBS a RT.
  11. Adquirir imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e imagens de fluorescência de células QD-rotulados.
    1. Use um objetivo ar 40X para fotos Índice de células marcadas com QD655. Utilize uma objectiva de imersão em óleo (por exemplo, 63X) para permitir a recolha mais eficiente da luz fluorescência emitida; isso é especialmente necessário quando imagiologia células marcadas com QD800.
    2. Use um cubo de filtro que expõe os QDs a luz de fluorescência de excitação entre 340 e 380 nm, e permite a coleta de luz emitida acima de 420 nm suimesa para a maioria dos QDs (filtro de cubo A neste caso).
    3. Minimizar a intensidade da luz para evitar a luz muito intensa que pode danificar a amostra. Definir o tempo de exposição de pelo menos 300 ms, de modo que os sinais de todos os QDs são capturados, notando que a fluorescência de QDs tem um comportamento intermitente.
    4. Ajustar a intensidade da luz, ea ampliação para fornecer imagens brilhantes sem ruído de imagem visível, minimizando a intensidade da luz.
      Nota: Em alternativa, o tempo de exposição mais curto pode ser utilizado se séries de imagem são tomadas a partir da mesma região. Estas séries podem ser processados ​​para produzir uma imagem de projecção máxima, que conduz a média e, portanto, a redução do ruído da imagem resultante.
  12. Coloque o microchip fotografada para trás (células voltada para cima) para um poço de uma placa de 96 poços preenchidos com BSA-PBS.
  13. Enxágüe microchips 1 vezes no CB.
  14. Incubar em GA 2% durante 10 min.
  15. Lavar 1 vez em CB, e 3 vezes com PBS-BSA.
  16. Loja microchips até ESEM iMaging, em BSA-PBS a poços pré-cheia de uma nova placa de 96 poços. Para cada microchip encher uma fileira de quatro poços com água de grau HPLC.
    Nota: As amostras podem ser mantidas a 4 ° C, durante várias semanas, no entanto, os melhores resultados são alcançados quando a série de imagem completo é realizada dentro de dois dias. QDs vai lentamente começar a separar da amostra, portanto, não é recomendado que esperar mais de 10 dias antes do imaging ESEM é feito.
    Nota: As imagens de fluorescência são armazenados para análise futura. As posições das células nas imagens podem ser facilmente correlacionados com imagens de microscopia eletrônica via localizar os cantos da janela do pecado e medir as posições relativas aos cantos.
    Nota: É aconselhável imprimir imagens de fluorescência de alta qualidade e usá-los para fins de orientação ao gravar as imagens ESEM.

5. Wet ESEM-STEM de células inteiras

  1. Prepare o ESEM para STEM molhado
    1. Monte o gasoso secundário elétron detector (gsed), e a fase de Peltier, que contém o detector de haste (localizado sob a amostra).
    2. Iniciar o fluxo de água de arrefecimento através da fase, e ajustar a temperatura para 3 ° C.
    3. Defina o xy fase coordena a zero, e ajustar a distância de trabalho para cerca de 6 mm.
  2. Durante a imagiologia ESEM, mantenha a placa de 96 poços com os microchips de cool, por exemplo em elementos de arrefecimento congelado, numa caixa de Styrofoam.
  3. Para carregar uma amostra para o estágio ESEM-STEM pré-arrefecida, pegue a placa de 96 poços para fora do recipiente de arrefecimento e colocá-lo perto do palco ESEM aberto. Coloque um novo tecido sala limpa ao lado dele.
  4. Enxaguar rapidamente um microchip (com as células para cima) mergulhando-o quatro vezes, cada vez por cerca de um segundo, em um poço cheio de água HPLC-grade.
  5. Blot a parte traseira do microchip brevemente sobre o tecido sala limpa e coloque o microchip para o estágio de pré-arrefecida. Certifique-se de que as células permanecem molhado, isso pode serreconhecido por uma superfície reflectora (secagem resulta numa superfície sem brilho).
  6. Molhar a superfície da amostra com 3 l de água de refrigeração HPLC-grade (certifique-se de não tocar a superfície com a ponta da pipeta), e corrigir a amostra no palco.
  7. Coloque três gotas de 3 ul de água adicionais na fase perto da amostra.
  8. Feche a câmara de amostra
  9. Purgar a câmara de amostra pelo ciclismo a pressão cinco vezes entre 800 e 1.500 Pa. Termine o ciclismo com 800 Pa.
  10. Alterne o feixe de elétrons (30 kV) e examinar a amostra sob o menor ampliação com ambos os detectores, ou seja, o gsed, eo detector STEM para procurar a localização da janela do microchip.
    Nota: Se a camada de água é muito grosso, a janela pode não estar visível. Neste caso, começar a baixar a pressão para 760 Pa e aguarde alguns minutos. A janela se torna primeiro visível com o gsed.
  11. Posicione janela membrana do pecado no centro da imagem movendo o SPECIMen fase e para reduzir a pressão de 750-720 Pa.
    Nota: Quando a camada de água é fina o suficiente, a janela também se torna visível com o detector STEM.
  12. A partir de agora usar o segmento de campo escuro do detector STEM para gravar imagens. Em primeiro lugar, adquirir uma ou duas imagens que mostram todas as células na área de janela completa.
  13. Compare estas imagens ESEM com as imagens de microscopia de luz, localizar os cantos da janela do pecado.
  14. Correlacionar a coordenar quadros de ambas as modalidades de microscopia, comparando a ampliação, rotação e possível espelhamento. Localize as mesmas células em ambas as imagens.
  15. Selecione partículas de sujeira muito pequenas ou uma região de células com pequenos recursos para ajustar as configurações de imagem, como a altura eucentric, o foco fino e a correção de astigmatismo lente. Trabalho com uma ampliação de pelo menos 50.000X, use uma corrente sonda elétron em torno de 0,6 nA, um tempo de permanência de pixel-30 uS, e um tamanho de imagem de 1024 x 884 pixels.
    Nota: Outras configurações também podem bE utilizada, desde que seja evitado um aumento da dose de electrões.
    Nota: Mesmo quando se trabalha muito limpo, as superfícies de chips, na prática, sempre conter algumas partículas de sujeira, pois o protocolo não é executado em um ambiente de sala limpa.
  16. Para gravar imagens estaminais a partir de células marcadas com QD, consulte as imagens de fluorescência e escolher uma célula de interesse.
    Nota: É melhor começar com uma célula mostrando sinais QD fortes.
  17. Gravar uma imagem panorâmica STEM desta célula.
  18. Ir para uma região periférica onde a borda da célula é visível e ampliar para alcançar ampliação 50.000X.
  19. Gravar imagens que mostram QDs individuais, use tempos de permanência de pixel de 20-30 ms. A fim de evitar danos causados ​​pela radiação, imagem cada região apenas uma vez com ampliação elevada.
    Nota: Normalmente, nesta fase tanto, o foco ea correção do astigmatismo, precisam de algum ajuste fino.
  20. Após a gravação de um número suficiente de imagens de alta ampliação, zoom-out, e acquire outra imagem panorâmica STEM, que descreve as regiões apenas gravados com alta ampliação como retângulos escuros.
    Nota: Estas fotos Índice servirá mais tarde para correlacionar ESEM e de fluorescência e imagens para determinar a localização precisa das imagens de alta ampliação dentro do contexto celular.
  21. Prossiga para a próxima célula de interesse, comece com uma imagem panorâmica, gravar uma série de imagens de alta ampliação, e terminam com uma imagem panorâmica.
  22. No fim de uma sessão de imagem ESEM, aumentar a pressão a 850-900 Pa antes de começar a ventilar a câmara.
    Nota: Este aumento da pressão aumenta a chance de recuperar o microchip com uma superfície ainda molhada; no entanto, este pode nem sempre ser alcançada. Uma amostra que nunca foi seco pode ser restaurada em BSA-PBS e, se desejado, de novo inquérito no ESEM num ponto posterior no tempo.

Representative Results

A Figura 1 e 2 mostram imagens representativas de QD655 marcado, EGFR ligado à membrana visualizadas em intactas, COS-7 de células totalmente hidratados. A imagem DIC na Figura 1 um dá uma impressão da topografia da membrana das células, e a imagem de fluorescência correspondente na Figura 1B representa a distribuição de EGFR após 3 min de EGF-biotina de incubação. A Figura 1A e B são cada costuradas de dois as imagens gravadas com um objetivo 40X ar. O EGFR EGF activado é distribuído sobre toda a superfície celular. Na maioria das células de um ligeiro aumento da fluorescência (Figura 1B) pode ser visto nas bordas das células, o que indica um aumento da ocorrência de EGFR localmente 20. As experiências de controlo efectuadas utilizando um protocolo semelhante verificada etiquetagem específica de EGFR (dados não mostrados). Esses controles incluem: 1) uma rotulagem controle sem incubação prévia do cells com EGF-biotina, ou seja, somente incubação com STR-QDs, e 2) uma incubação com não-biotinilado EGF e STR-QDs.

As três células marcadas com retângulos foram investigados com ESEM-STEM. As imagens ESEM-STEM representadas na Figura 1C - E mostram baixos súmulas ampliação dessas células. Estas imagens de transmissão de reflectir células inteiras em estado hidratado com uma fina camada de água que residem sobre a célula colocada em um microchip de silício com nitreto de silício (SiN) janela de visualização. A câmara de vácuo no microscópio continha vapor de água, e o equilíbrio entre a temperatura e a pressão da amostra foi ajustada para manter uma fina camada de líquido sobre as células. As células individuais podem ser facilmente reconhecidos em virtude da sua forma e localização na membrana da janela do pecado. As imagens ESEM-STEM baixa ampliação revelar estruturas finas, como filopodia, que se estende desde a borda da célula para as células vizinhas, e algumas estruturasno interior das regiões celulares mais finas. Regiões centrais celulares espessas, incluindo o núcleo parecem brancos por transmissão através da amostra, não é possível para que os electrões de energia utilizada (30 keV).

De alta resolução de imagens ESEM-tronco foram registrados nas regiões mais finos, periféricos. A resolução espacial para a ESEM-STEM de nanopartículas nas regiões finas de células em uma fina camada líquida foi determinada em um estudo prévio de 6 a ascender a 3 nm. Quatro imagens de alta resolução mostrada na Figura 2A - D foram registados nos locais dos pequenos rectângulos na Figura 1C - E. A ampliação utilizada foi suficiente para discernir QDs individuais, que aparecem como brilhantes, as hastes em forma de bala, cada um ligado a um indivíduo EGFR. O QD655 tem dimensões típicas de 6 x 2 14 nm.

A Figura 2A (correspondente à área rectangular indicada na célula na Figure 1C) mostra rótulos QD sobre uma membrana dobre na diagonal cruzando a imagem. Esta estrutura de membrana tem uma densidade mais elevada de EGFR do que as regiões vizinhas membrana. Em vários locais, dois rótulos estavam em estreita proximidade. Dois exemplos com distâncias de 20 e 24 nm são indicados com setas. Estes pares de etiquetas são consideradas como pertencentes ao dímeros de EGFR. A Figura 2B apresenta um exemplo a partir do bordo de uma célula (Figura 1D, rectângulo esquerdo), os monómeros EGFR e dímeros pode ser visto como bem. A Figura 2C (Figura 1C, rectângulo direita) foi gravado de uma região com um sinal de fluorescência mais baixa, ou seja, menor densidade EGFR. No entanto, o EGFR também foi encontrado em dímeros aqui também. Além disso, dois grupos de 10 ou 11 estavam presentes EGFR (ver elipses). A Figura 2D mostra um outro exemplo de uma prega de membrana (Figura 1E) com os conjuntos menores, incluindo 5-6 EGFR, além de vários monómerose dímeros.

Como um exemplo do tipo de informação que pode ser obtida a partir destes dados, a correlação par função 21 g (x) foi determinado para todas as posições de etiquetas na Figura 2. Note-se que esta análise não é parte deste protocolo eo procedimento foi descrito outras posições 6,7. g (x) é uma medida da probabilidade de uma partícula ser encontrado dentro de uma determinada distância radial a partir de X uma partícula de referência. g (x) = 1 representa uma distribuição aleatória, e um valor maior é evidência de aglomeração. As posições de um total de 210 marcadores foram automaticamente detectada nos quatro imagens da Figura 2A-D, e g (x) foi calculada utilizando um tamanho de bin de 5 nm e um filtro de alisamento com uma largura de banda de 10 nm. A curva (Figura 3) G (x) mostra um QD distância de 25 nm, de preferência de centro a centro. EGFR, portanto, não são orientadas aleatoriamente, mas uma fracção significativa deles reside a esta distância preferida. De um approximatmodelo molecular e 6 (Figura 3 inset) estima-se que a distância centro-a-centro entre o QD e a bolsa de ligação de EGF ascende a ~ a distância 14 nm, e de centro-a-centro entre os dois QDs ligados a um dímero de EGFR ser ~ 27 nm (este valor é susceptível de variar em alguns nanómetros, devido à flexibilidade do ligante). A distância da etiqueta preferida é assim consistente com a distância rótulo esperado para o dímero de EGFR dentro da precisão do método. O (X) g curva é maior do que a unidade para a distância de até 300 nm, indicando a presença de agregados, consistente com os dados. Esta análise mostra que a estequiometria do EGFR pode ser estudada com o nosso método.

A Figura 4 mostra um resultado semelhante, como a Figura 2, excepto que a marcação foi realizada com o EGF-QD800, e uma objectiva de imersão em óleo de 63X foi utilizado para a imagem de fluorescência. Estes dados confirmam que estes resultados típicos são também encontradas quandoa rotulagem EGFR é feito com QDs, que emitem no espectro vermelho perto. Figura 4A é a imagem de fluorescência de uma célula representante, a Figura 4B mostra a mesma célula no modo de visão geral ESEM-STEM e Figura 4C é uma imagem da ampliação 150.000 x, gravado na fronteira membrana superior da célula (ver rectângulo na Figura 4B). Semelhante à Figura 2A e D, as imagens capturar QD EGFR marcado com uma dobra na membrana e mostra os receptores monoméricos, diméricos, e agrupados. Note-se que o elétron núcleo QD densa parece mais redondo um pouco menor e que os núcleos de QDs emitindo a 655 nm, consistente com seu menor tamanho do núcleo 22 do ~ 5 nm.

figura 1
Figura 1. Correlative DIC, fluorescência e ESEM-STEM de EGF-EGFR marcado QD655 em COS-7 totalmente hidratados células rong>. image (A) DIC das células cultivadas em área de janela membrana do SiN, dando uma impressão topográfica da membrana plasmática. (B) imagem de fluorescência que mostra células na janela membrana SiN localização central (marcado pelo retângulo tracejado). (C - E) Três ESEM-STEM imagens de baixa ampliação das células marcadas com retângulos em A e B. Estas fotos Índice célula servem para determinar a localização precisa de imagens de alta resolução, posteriormente gravados. A localização de quatro imagens de alta resolução (mostrado na Figura 2A-D) estão marcados com retângulos brancos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
(A) Micrografia a ampliação 75,000X da área marcada na Figura 1B. Muitos monómeros são visíveis. Vários dímeros são indicados por pontas de seta. (B) e (C) as imagens adquiridas com uma ampliação de 50,000X da esquerda, direita, respectivamente, áreas de membranas marcadas na Figura 1C. Aglomerados de EGFR são descritas. Imagem (D) gravado com ampliação 50,000X no local marcado na Figura 1D. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Par função de correlação g (x) como função da distância radial x determinada para a inter-parti distâncias cle de todos os 210 etiquetas detectadas na Figura 2A-D. O pico a 25 nm indica que um QD distância centro-a-centro tem uma probabilidade muito mais elevada de ocorrência de forma aleatória, em que um g (x) = 1 indica um acaso. A linha pontilhada é um guia para o olho representando g (x) de uma distribuição aleatória. A inserção mostra um modelo molecular aproximado do dímero EGFR com EGF ligado e revestidas com estreptavidina QDs conectados via biotina. Os modelos de estreptavidina, o EGF e o EGFR foram obtidos a partir de modelos CPK do 1stp (estreptavidina), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO e 2GS6 (EGFR) estruturas na proteína RCSB Proteína banco de dados, criado por Jmol Versão 12.2.15. O modelo de biotina é tão desenhado em RCSB Ligand Explorer versão 1.0. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Exemplar COS-7 de células marcadas com EGF-QD800 e fotografada com fluorescência correlativa e ESEM-STEM. (A) imagem de fluorescência, (B) imagem ESEM-STEM visão geral baixa ampliação. (C) imagem de alta resolução gravado no local do retângulo em b no 150,000X ampliação. EGFR monoméricas, diméricas, e em cluster são detectados semelhante à rotulagem com EGF-QD655. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O estudo da distribuição espacial e estequiometria das proteínas de membrana, tais como o EGFR, em células inteiras fornece informações importantes sobre a sua função de contexto e possíveis alterações dos mesmos 11-14. É um desafio para estudar a distribuição de monómeros, dímeros e agregados directamente num nível subcelular usando métodos bioquímicos vulgarmente utilizados, para o qual a informação é perdida sobre a localização da proteína na célula ou diferenças entre as células 15. Os métodos de marcação e de microscopia descritas aqui permitem a visualização dos complexos de proteína sobre uma escala de comprimento de alguns nanómetros, de modo que a sua estequiometria podem ser estudados no contexto de células intactas, individuais 4-7. Isso não é possível com (resolução super) microscopia de luz 23 porque sua resolução é insuficiente para distinguir moléculas envolvidas em um complexo proteico. Förster Ressonância Energia Transferência (FRET) é uma técnica de média conjunto <sup> 24, e não necessariamente detectar os dímeros e agregados de ordem superior, como consequência do curto alcance da transferência de energia 25. Os ensaios de ligação de proximidade 26 realmente não medir distâncias e não são, portanto, capaz de distinguir entre uma região celular com uma alta densidade de proteína, inevitavelmente levando a uma série de proximidades detectados por acaso, de uma região celular com uma densidade de proteína semelhante, mas contendo proteína Complexos que exibem diferentes distâncias entre as etiquetas. A necessária alta resolução para visualizar os componentes de complexos de proteína é obtida por microscopia electrónica de transmissão (TEM). No entanto, TEM convencional de células inteiras é limitada pelo requisito de amostras finos / secções corta através da membrana de plasma 27, ou rasgando membrana do plasma ou que interrompem 28,29 resultando em pequenos pedaços de membrana formados aleatoriamente. A membrana de plasma, assim, não está representado como um todo, levando a uma faltainformação de contexto celular, possivelmente, crucial.

Outros desafios experimentais para o estudo de estequiometria de proteínas em células surgem a partir da marcação de proteínas aplicada. Comumente imunomarcação utilizados confirma a dificuldade que um-para-um entre o receptor e estequiometria etiqueta só pode ser conseguido com uma sonda monovalente; este não é o caso quando são necessários anticorpos primários e secundários. Para obter informações sobre a estequiometria da proteína, é necessário que uma sonda se liga exclusivamente a um epítopo no receptor e tem um local de ligação para uma sonda fluorescente ou um número atómico elevado nanopartícula, por outro lado. Em segundo lugar, a precisão obtida com a rotulagem anticorpo é restrito devido à sua grande tamanho 30 de a 30 nm, de modo que uma discriminação entre proteínas vizinhas individuais, homodímeros, ou aglomerados maiores não é possível, pelo menos não para os receptores da família de EGFR. Rótulos específicos muito menores são conhecidos na literatura e can ser aplicado até mesmo para a rotulagem intracelular 31, mas aqueles que não são comumente usados. O comprimento de todo o rótulo (FEG-biotina-estreptavidina-QD) é de uma dimensão similar ao EGFR, e suficientemente pequena para ser capaz de detectar o dímero. Além disso, o procedimento de marcação de duas etapas descrito evita rotulagem induzida agrupamento receptor.

O nosso método não é muito difícil, não muito mais do que a microscopia de fluorescência de proteínas marcadas. No entanto, um experimento precisa ser realizado com grande cuidado, uma vez que o número de passos e adiciona-se um erro em um dos passos pode conduzir a um fracasso completo no experimento. Manipular os microchips não é mais tedioso que a manipulação de grades TEM mas alguns chips de treinamento vazias é recomendado. ESEM-STEM de células hidratadas integrais é provavelmente o aspecto mais difícil, e requer, pelo menos, um operador qualificado e vários dias de prática, a fim de chegar a uma resolução de cerca de 3 nm, conforme necessário para visualizar as QDs. Barragem de radiaçãoidade da amostra sob investigação apresenta um risco. A pressão e a temperatura deve ser observadas com atenção para manter a camada da água. Além disso, a espessura da camada de água pode variar entre células. É aconselhável monitorizar a presença da camada de água, utilizando o detector de electrões acima do espécime gasoso, como descrito em outro lugar 6. Regiões celulares só deve ser trabalhada uma vez ou duas vezes, para evitar danos.

Uma limitação fundamental do método é que a informação de alta resolução sobre a ultraestrutura está ausente. Outras técnicas, por exemplo, crio TEM, são necessários para estudar a estrutura de proteínas, e a ultra-estrutura celular 15. Em segundo lugar, estudar a interação dinâmica de um múltiplo de proteínas em células vivas em time-lapse microscópio não é viável por conta de danos da radiação, e requer state-of-the-art microscopia de luz 23. Actualmente, o nosso método não é capaz de determinar o nível absoluto de dímeros uma vez que o Leficiência Abeling é desconhecida, mas esperamos adicionar esses dados no futuro. No entanto, é possível dizer se dímeros estão presentes ou não. A partir da literatura sabe-se, que mesmo uma eficiência de marcação cerca de 15% é suficiente para detectar dímeros com suficiente significância estatística 32.

É prontamente possível estudar outros receptores ligados à membrana através do seu ligando, por meio de fragmentos Fab de anticorpos biotinilados específicos, ou através de outras pequenas ligadores 7, utilizando o protocolo de marcação de duas etapas descrito. Uma vez que já demonstraram que duas cores diferentes (tamanhos de QDs) pode ser usado, e rotulagem de nanopartículas de ouro foi utilizado em trabalho anterior 6, parece viável para rotular várias espécies de proteína na mesma experiência. O principal desafio para o estudo da estequiometria de várias espécies de proteína é garantir uma eficiência de marcação semelhante para ambas as espécies ou, pelo menos, uma normalização da estequiometria relativa obtida no respeitoive eficiências de rotulagem. No entanto, os dois QDs diferentes utilizados neste estudo parecem não diferem muito em eficiência de marcação (ver Figuras 2 e 4). O método descrito envolvendo rotulagem de duas etapas com QDs, e microscopia de fluorescência correlativa e ESEM-STEM apresenta um método viável para estudar a complexa interação de proteínas de membrana nas membranas plasmáticas intactas de células inteiras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted fluorescence microscope Leica AF6000 + DMI6000B
ESEM FEI Company Quanta 400 FEG
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate Gibco 31966-021
DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid Gibco 14190-144
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) Gibco 16000-036
Cellstripper Mediatech, Inc. 25-056 Cl
Water, chromasolv Plus for HPLC Sigma-Aldrich 34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBS Carl Roth 1058.1
Ethanol, Rotisolv HPLC grade Carl Roth P076.2
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) Carl Roth O163.2
Gelatin, from cold water fish skin Sigma-Aldrich G7041-500G
Glycine Carl Roth T873.1
Epidermal Growth Factor Molecular Probes E3477 Biotin-XX Conjugate (biotin EGF)
Sodium teraborate decahydrate Sigma-Aldrich S9640-500G
Boric acid Sigma-Aldrich B6768-500G
Qdot 655 streptavidin conjugate Molecular Probes Q10121MP
Qdot 800 streptavidin conjugate Molecular Probes Q10173MP
Silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm DENS Solutions Custom made

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References

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Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo
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Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying … More

Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. J. Vis. Exp. (103), e53186, doi:10.3791/53186 (2015).

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