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Bioengineering

Correlative माइक्रोस्कोपी का उपयोग बरकरार कोशिकाओं में epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर की स्तुईचिओमेटरी का अध्ययन

Published: September 11, 2015 doi: 10.3791/53186
Automatic Translation
1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

Abstract

इस प्रोटोकॉल Cos7 fibroblast कोशिकाओं पर epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR), और बाद में correlative प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और हाइड्रेटेड राज्य में पूरे कोशिकाओं के पर्यावरण स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ESEM) की लेबलिंग का वर्णन है। फ्लोरिसेंट क्वांटम डॉट्स (QDs) रिसेप्टर के लेबल प्रेरित क्लस्टरिंग से परहेज करते हुए, एक कुशल और विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग उपलब्ध कराने, एक दो कदम लेबलिंग प्रोटोकॉल के माध्यम से EGFR करने के लिए मिलकर कर रहे थे। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी EGFR के सेलुलर स्थानों का अवलोकन छवियों प्रदान की है। स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) डिटेक्टर nanoscale संकल्प के साथ QD लेबल को पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप correlative छवियों हाइड्रेटेड बरकरार सेल की प्राकृतिक संदर्भ में एक आण्विक स्तर पर सेलुलर EGFR वितरण, और stoichiometry का डेटा प्रदान करते हैं। ESEM स्टेम छवियों रिसेप्टर homodimer के रूप में, मोनोमर के रूप में उपस्थित होना है, और छोटे समूहों में पता चला। दो अलग-अलग QDs साथ लेबलिंग,यानी, एक 655 एनएम पर उत्सर्जन और 800 पर इसी तरह के लक्षण परिणामों से पता चला।

Introduction

एक नया दृष्टिकोण स्टेम 1-3, या correlative प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग और 4-7 स्टेम तरल अवस्था में लेबल प्रोटीन के साथ छवि पूरे कोशिकाओं के लिए, हाल ही में शुरू की गई थी। इस पद्धति झिल्ली प्रोटीन और साबुत कोशिकाओं की अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली में एक अणु के स्तर पर उनकी stoichiometry सहित प्रोटीन परिसरों के स्थानिक वितरण का अध्ययन करने के लिए सक्षम है। यहाँ, हम एक फ्लोरोसेंट क्वांटम डॉट्स (QDs) के साथ रिसेप्टर प्रोटीन की एक दो कदम विशिष्ट लेबलिंग से जुड़े प्रोटोकॉल 8, और correlative प्रकाश माइक्रोस्कोपी और ESEM स्टेम का वर्णन है। उदाहरण के रूप में, हम EGFR, प्रोटीन काइनेज superfamily के अंतर्गत आता है कि एक झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन किया। Ligand बाध्यकारी पर, रिसेप्टर को सक्रिय करता है और फिर एक और सक्रिय EGFR के साथ एक डिमर रूपों; बाद में संकेत झरना सेल प्रसार 9 ड्राइव। असामान्य EGFR अभिव्यक्ति या गतिविधि के लिए अग्रणी म्यूटेशन कैंसर 10 के कई प्रकार में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। अध्ययन का विषयजी पूरे कोशिकाओं में इस झिल्ली रिसेप्टर के स्थानिक व्यवस्था अपने कार्य और 11-14 उसके संभावित परिवर्तनों के बारे में महत्वपूर्ण संदर्भ जानकारी प्रदान करता है। लेकिन यह सीधे biochemical- या पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तरीकों 15 के साथ एक (उप) सेलुलर स्तर पर EGFR मोनोमर्स, dimers, और समूहों के वितरण की जांच के लिए चुनौती बनी हुई है। हमारे विधि एक परिसर में प्रोटीन के स्थानों को निर्धारित किया जा सकता है कि इस तरह कुछ नैनोमीटर की एक स्थानिक संकल्प के साथ EGFRs visualizing के लिए सक्षम है। सबसे महत्वपूर्ण बात, stoichiometric वितरण के बारे में प्राप्त जानकारी बरकरार सेल में प्रोटीन की देशी स्थिति से संबंधित है।

लेबल और रिसेप्टर के बीच एक छोटी दूरी के लक्ष्य को हासिल करने के लिए, EGFR सीधे एक QD करने के लिए एक बायोटिन- streptavidin बंधन का उपयोग कर, अपने ligand EGF के माध्यम से चिह्नित किया गया। इस लेबल fluorescence- और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ दोनों का पता लगाया जा सकता है। हम Cos7 कोशिकाओं के correlative इमेजिंग में के लिए इस लेबल का इस्तेमाल किया हैएक microfluidic चैम्बर पहले से 1,16,17 में संलग्न तरल। हालांकि, QD प्रति अणुओं streptavidin की एक बहु के कारण, इस लेबल के एक कम लेबलिंग दक्षता या बल्कि महंगा प्रयोगों के लिए अग्रणी, रिसेप्टर क्लस्टरिंग उत्पन्न हो सकता है, और यह जांच के तहत प्रोटीन के stoichiometry पर समाप्त करने के लिए संभव नहीं है। लेबल प्रेरित रिसेप्टर क्लस्टरिंग जो केवल एक streptavidin-क्वांटम डॉट (एसटीआर-G) युग्मित है करने के लिए biotinylated EGF जिसमें एक जांच में जिसके परिणामस्वरूप, यहाँ प्रस्तुत दो कदम लेबलिंग प्रक्रिया को रोजगार से पूरी तरह से बचा जा सकता है। कोशिकाओं पहले biotinylated EGF साथ incubated, और फिर तय कर रहे हैं। नियतन कदम प्रोटीन प्रक्रियाओं (निर्धारण की गति पर निर्भर करता है) बंद कर दिया जाता है, जिस पर समय बिंदु निर्धारित करता है। एसटीआर-QD लेबलिंग प्रोटोकॉल के दूसरे चरण के रूप में उसके बाद लागू किया जाता है। प्रोटीन तय कर रहे हैं एक बार प्रोटीन की गतिशील झिल्ली गति रुकावट है के बाद से क्लस्टरिंग जगह नहीं ले करता है। इसके अलावा, एसटीआर-QD समाधान है, जो हैप्रयोग की सबसे महंगी घटक, एक अनुकूलित कम एकाग्रता में लागू किया जा सकता है, और लेबलिंग के इस दूसरे चरण यानी, QD कई मिनट में मिलकर किया जा सकता है, समय-महत्वपूर्ण नहीं है।

पूरे कोशिकाओं में वितरित रूप EGFR के stoichiometry का अध्ययन करने के लिए, सेलुलर नमूनों सिलिकॉन माइक्रोचिप्स 18 पर तैयार थे। दो कदम QD लेबलिंग, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों की रिकॉर्डिंग को लागू करने के बाद, कोशिकाओं शुद्ध पानी के साथ rinsed थे, और ESEM स्टेम 19 का उपयोग कर हाइड्रेटेड राज्य में imaged। जिसके परिणामस्वरूप correlative छवियों हाइड्रेटेड कोशिकाओं की अपनी प्राकृतिक संदर्भ में सेलुलर EGFR वितरण, और stoichiometry के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। इसी तरह की एक विधि हाल के एक अध्ययन 7 में स्तन कैंसर की कोशिकाओं में HER2 प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

Protocol

लेबलिंग और फिक्सेशन अभिकर्मकों की 1. तैयारी

  1. Autoclaved फॉस्फेट बफर खारा का उपयोग लेबलिंग बफर (बीएसए जेल-पीबीएस), 7.4 पीएच (पीबीएस) तैयार करें। 1% बीएसए (गोजातीय एल्बुमिन अंश वी, बायोटिन मुक्त) और 0.2% जिलेटिन (जेल, ठंडे पानी की मछली की त्वचा से) और भंवर के साथ पूरक / अच्छी तरह हिला।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 5 दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  2. Autoclaved फॉस्फेट बफर खारा, पीएच 7.4 से धोने बफर (बीएसए पीबीएस) तैयार करें। 1% BSA और भंवर के साथ पूरक / अच्छी तरह हिला। नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 5 दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  3. 200 मिमी से 50 मिमी borate बफर (बी बी) बोरिक एसिड शेयर समाधान तैयार, पीएच 200 मिमी सोडियम tetraborate साथ 8.3 करने के लिए समायोजित। नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 12 महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  4. 0.2 एम सोडियम cacodylate शेयर समाधान से 0.1 एम cacodylate बफर (सीबी) तैयार करें, पीएच 0.1 एम सुक्रोज के साथ पूरक, 7.4 करने के लिए समायोजित।
    नोट: खोला शेयर समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 5 दिन के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  5. (पीबीएस में जी 0.1 एम ग्लाइसिन तैयारभंडारण पीबीएस)।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 2 महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  6. ताजा बना या खोला 16% पीएफए ​​की शीशी, शेयर समाधान, ईएम ग्रेड से सीबी में 3% paraformaldehyde (3% पीएफए) तैयार करें।
    नोट: खोला शेयर समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 5 दिन के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  7. सीबी ताजा बना (या की शीशी खोली) से (2% जीए) 25% जीए शेयर समाधान, ईएम कक्षा में 2% glutaraldehyde तैयार करें।
    नोट: खोला शेयर समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 5 दिन के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  8. 300 एनएम EGF बायोटिन लेबलिंग समाधान तैयार
    1. , बीएसए जेल-पीबीएस में 6 माइक्रोन EGF बायोटिन शेयर समाधान पतला माइक्रोचिप प्रति 100-200 μl की मात्रा का उपयोग करें। कुछ घंटे के भीतर का प्रयोग करें।
  9. 10 एनएम एसटीआर-QD लेबलिंग समाधान तैयार
    1. 8000 XG पर 4 मिनट के लिए streptavidin-QD शेयर समाधान अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला ले और बी बी में 01:10 पतला। QDs के विभिन्न प्रकार के उदाहरण, QD655, या QD800 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। , बीएसए जेल-पीबीएस में अंतिम एकाग्रता के लिए पतला माइक्रोचिप प्रति 75-100 μl का उपयोग करें। भीतर का उपयोग करेंकुछ घंटा।

सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली माइक्रोचिप्स के 2. तैयारी

  1. एक साफ कमरे ऊतक और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) ग्रेड इथेनॉल के साथ, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में एक खुर्दबीन गिलास स्लाइड साफ करें।
  2. एक कम धूल स्तर के साथ एक लामिना airflow के कार्यक्षेत्र में, एक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश खुला, और डिश में साफ खुर्दबीन गिलास रखना; खुला पकवान छोड़ दें।
  3. अधिमान्यतया कार्बन फाइबर या अन्य कोटिंग के साथ लेपित साफ चिमटी के साथ, उनके भंडारण बॉक्स के बाहर और गिलास स्लाइड पर पतली (50 एनएम) सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली के साथ 4-10 माइक्रोचिप्स, एक के बाद एक, ले। धीरे अपने पक्ष में माइक्रोचिप्स ले लो और पतली सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली से मिलकर नाजुक ऊपरी पक्ष को छूने से बचें। हमेशा झिल्ली पक्ष रखने के लिए महान ख्याल रखना और उसे छू नहीं है।
    माइक्रोचिप्स आयताकार होना चाहिए और उनके सिलिकॉन नाइट्राइड को कवर सीधा सपाट किनारों है: नोटवे आसानी से सोचने के लिए मजबूर किया जा सकता है, ताकि सामना करना पड़ता है।
  4. पेट्री डिश के ढक्कन को बंद करें और एक धूआं हुड के लिए इसे लाने। एक नया कमरा साफ ऊतक जाओ और पेट्री डिश के पास जमा। 50-70 मिलीलीटर एसीटोन के साथ एक है, और इथेनॉल के एक समान मात्रा के साथ अन्य, HPLC ग्रेड के दोनों भरने से दो स्वच्छ 200 मिलीलीटर कांच बीकर तैयार करें। पहले साफ कमरे ऊतक पर कांच स्लाइड से माइक्रोचिप्स स्थानांतरण।
  5. ऊतक से, सुरक्षात्मक विरोध परत को हटाने के लिए एसीटोन के साथ पहली बीकर में एक-एक करके माइक्रोचिप्स एक हस्तांतरण। धीरे माइक्रोचिप्स अच्छी तरह से rinsed हैं कि यह सुनिश्चित करने के बीकर में कुछ बार चलती है, जबकि 2 मिनट रुको।
  6. उन्हें बाहर सूखी अनुमति के बिना सीधे इथेनॉल के साथ बीकर में माइक्रोचिप्स स्थानांतरण। 2 मिनट रुको। तब लामिना airflow के कार्यक्षेत्र को बीकर हस्तांतरण। एक नया कमरा साफ ऊतक जाओ।
  7. ऊतक पर चिप्स स्थानांतरण और कुछ मिनट के लिए उन्हें सूखी। पेट्री डिश में कांच स्लाइड पर माइक्रोचिप्स स्थानांतरण पकवान बंद,और प्लाज्मा क्लीनर के लिए इसे लाने।
  8. प्लाज्मा क्लीनर में माइक्रोचिप्स के साथ कांच स्लाइड जमा। सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली हाइड्रोफिलिक की सतह प्रस्तुत करने के लिए एक 5 मिनट के सफाई कार्यक्रम चलाते हैं।
    नोट: हमारी प्लाज्मा क्लीनर के लिए आवेदन किया उपयुक्त सेटिंग कर रहे हैं: 70 mTorr, ओ 2 के लिए 11.5 SCCM और गिरफ्तारी के लिए 35.0 SCCM, 50 डब्ल्यू आगे रेडियो फ्रीक्वेंसी (आरएफ) लक्ष्य, 5 डब्ल्यू आरएफ रेंज और मैक्स की गैस का प्रवाह। आरएफ परिलक्षित।
  9. वापस पेट्री डिश में माइक्रोचिप के साथ कांच स्लाइड रखो, और उसके ढक्कन को बंद करें। अब से बाँझ माइक्रोचिप्स रखने के लिए ध्यान रखना।
  10. संभव झिल्ली ruptures या शेष धूल कणों के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोचिप्स की खिड़की के क्षेत्रों की जांच।
  11. लामिना airflow के कार्यक्षेत्र को पेट्री डिश लाओ।
  12. लामिना airflow के कार्यक्षेत्र में निम्नलिखित मदों की जगह: ट्यूबों / बोतलें 0.01% पाली एल lysine समाधान निष्फल युक्त (। पीएलएल, मोल 150,000-300,000 गुम्मट, बाँझ फ़िल्टर, और सेल संस्कृति परीक्षण), एचपीएलसीग्रेड पानी, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, सीरम के बिना DMEM, एक नया कमरा साफ ऊतक, एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली (12 अच्छी तरह से थाली में भी इस्तेमाल किया जा सकता है), 96 एक बाँझ के साथ पूरक अच्छी तरह से थाली, बाँझ pipet सुझावों, एक पिपेट, और फ्लैट, गोल टिप, चिमटी।
  13. 24 अच्छी तरह से थाली ले लो, और PLL के साथ अच्छी तरह से एक को भरने, और HPLC ग्रेड पानी के साथ दो कुओं, लगभग एक का उपयोग करें। अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर की मात्रा। एक लगभग उपयोग, 96 अच्छी तरह से थाली ले लो और सीरम मुक्त DMEM के साथ अच्छी तरह से हर माइक्रोचिप के लिए दो DMEM पूरक सीरम के साथ कुओं और एक भरें। अच्छी तरह से प्रति 200 μl की मात्रा।
  14. माइक्रोचिप्स को संभालने के लिए बाँझ सुझावों के साथ उपयोग चिमटी पर अब से। संक्षेप में ज्वलंत और बाद में चिमटी के सुझावों बंद ठंडा करके, उदाहरण के लिए, इस लक्ष्य को हासिल।
  15. सबसे पहले साफ कमरे ऊतक पर कांच स्लाइड से माइक्रोचिप्स हस्तांतरण।
    ऊतक से, अच्छी तरह से पीएलएल-भरा में छह माइक्रोचिप्स को हस्तांतरण 5 मिनट के लिए माइक्रोचिप्स सेते हैं।
    नहींई: अधिक माइक्रोचिप्स के साथ एक प्रयोग के लिए, 24 अच्छी तरह से थाली में अतिरिक्त कुओं भरें।
  16. इसके बाद पहली बार पानी से भरे कुएं में, एक-एक करके, उन्हें रखने के द्वारा माइक्रोचिप्स कुल्ला, और वहाँ से दूसरे को अच्छी तरह से पानी से भरे में। पीएलएल के हटाने से बचने के लिए लंबे समय तक के बारे में एक मिनट से भी पानी में माइक्रोचिप्स मत छोड़ो।
  17. अंत में 96 अच्छी तरह से थाली के DMEM से भरे कुओं में व्यक्तिगत रूप से उन्हें जगह है। सेल निलंबन के लिए तैयार है जब तक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 96 अच्छी तरह से थाली स्टोर।

माइक्रोचिप्स पर कोशिकाओं के 3. तैयारी

  1. लगभग एक एकाग्रता के साथ एक सेल निलंबन तैयार करने के लिए Cos7 कोशिकाओं की एक उपसंस्कृति प्रदर्शन करते हैं। 5 × 10 5 कोशिकाओं / एमएल। कोशिकाओं मोनो बिखरे हैं सुनिश्चित करें।
  2. माइक्रोचिप्स के साथ 96 अच्छी तरह से थाली ले लो और एक माइक्रोचिप के लिए सेल निलंबन की एक छोटी बूंद जोड़ें। 5 मिनट रुको।
  3. चो के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ माइक्रोचिप्स की खिड़की के क्षेत्रों की जांच करने के लिए शुरूसीरम मुक्त DMEM के साथ एक नए कुएं में यह स्थानांतरित करने के लिए सही वक्त ose।
    नोट: कोशिकाओं का एक अच्छा घनत्व 150 x 400 माइक्रोन की एक खिड़की के आकार पर 24 Cos7 कोशिकाओं के लिए इसी 2,500 माइक्रोन 2 क्षेत्र के अनुसार लगभग एक सेल के साथ हासिल की है। उच्चतर सेल घनत्व कोशिकाओं की अधिक से अधिक सपाट बाधा को खतरा है। एक सेल पाप झिल्ली पर नीचे बसे है के बाद, यह नए कुएं में स्थानांतरण के दौरान बंद चल विरोध करने के लिए पर्याप्त आसंजन विकसित करने के लिए 3-5 मिनट की जरूरत है जागरूक बनो।
  4. पर्याप्त कोशिकाओं खिड़की पर पालन किया है जब अगले अच्छी तरह से करने के लिए माइक्रोचिप स्थानांतरण। ऊपर का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ हमेशा माइक्रोचिप्स रखें और इस पक्ष के किसी भी छूने से बचें।
  5. हस्तांतरण के बाद, फिर से एक माइक्रोचिप खिड़की की जांच। भी कई कोशिकाओं से धोया गया और शेष कोशिकाओं की संख्या अपर्याप्त है, तो फिर से Triturate सेल निलंबन (नवगठित सेल clumps को तोड़ने के लिए) और दोहराने 3.1-3.5 कदम।
  6. सभी स्थानांतरित माइक्रोचिप्स पर्याप्त है जबउनकी खिड़की के क्षेत्रों पर कोशिकाओं पालन। सीरम मुक्त DMEM के साथ पिछले कुएं में चिप्स हस्तांतरण सीओ 2 इनक्यूबेटर में वापस 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और कोशिकाओं को ठीक करते हैं और कई मानव संसाधन, सबसे अच्छा हे / N के लिए बाहर समतल।

4. EGFR लेबलिंग, फिक्सेशन, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. निम्न चरणों के लिए, एक 96 अच्छी तरह से और एक 24 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें। संबंधित समाधान के साथ कुओं पूर्व भरने, और माइक्रोचिप के प्रति एक पंक्ति या स्तंभ का उपयोग करें। 24 अच्छी तरह से थाली सीबी, पीएफए ​​और जीए साथ निर्धारण चरणों के लिए धूआं हुड के अंतर्गत प्रयोग किया जाता है। हमेशा सामना करना पड़ रहा कोशिकाओं के साथ माइक्रोचिप्स हस्तांतरण और इस पक्ष के किसी भी छूने से बचें।
  2. एक अच्छी तरह से ताजा बीएसए जेल-पीबीएस के साथ में माइक्रोचिप्स रखकर माइक्रोचिप्स कुल्ला, तो 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 96 अच्छी तरह से थाली जगह है।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 एनएम EGF बायोटिन समाधान के साथ सेते हैं। कोशिकाओं EGF लेबल EGFRs की endocytosis शुरू कर देंगे, क्योंकि काएं करने के लिए जितनी जल्दी हो सके आगे बढ़नापी 4.4।
  4. पीबीएस के साथ 3 बार, और सीबी के साथ एक समय (अब 96 अच्छी तरह से थाली आरटी पर फिर से है) कुल्ला।
  5. 10 मिनट के लिए 3% पीएफए ​​में सेते हैं।
  6. चिप्स सीबी के साथ एक समय, और पीबीएस के साथ 3 बार कुल्ला।
  7. 2 मिनट के लिए Gly-पीबीएस में सेते हैं 1 समय पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला।
  8. 10 मिनट के लिए 10 एनएम एसटीआर-QD में सेते हैं।
  9. बीएसए पीबीएस के साथ 4 बार कुल्ला।
  10. एक गिलास नीचे 35 मिमी पकवान आरटी पर बीएसए पीबीएस के साथ पहले से ही भरे में एक माइक्रोचिप डूब।
  11. QD लेबल की कोशिकाओं के अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियों और प्रतिदीप्ति छवियों मोल।
    1. QD655 साथ लेबल की कोशिकाओं का अवलोकन छवियों के लिए एक 40x हवा उद्देश्य का प्रयोग करें। उत्सर्जित प्रतिदीप्ति प्रकाश की सबसे कुशल संग्रह अनुमति देने के लिए (उदाहरण के लिए, 63X के लिए) एक तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें; QD800 के साथ लेबल कोशिकाओं इमेजिंग जब यह विशेष रूप से आवश्यक है।
    2. 420 एनएम सुई ऊपर उत्सर्जित प्रकाश का संग्रह 340 और 380 एनएम के बीच प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रकाश को QDs को उजागर करता है, और अनुमति देता है कि एक फिल्टर क्यूब का प्रयोग करेंसबसे QDs (इस मामले में फिल्टर क्यूब ए) के लिए मेज।
    3. नमूना नुकसान हो सकता है कि बहुत तीव्र प्रकाश से बचने के लिए प्रकाश की तीव्रता कम से कम। सभी QDs के संकेतों पर कब्जा कर लिया जाता है, ताकि QDs के प्रतिदीप्ति एक निमिष व्यवहार किया है, यह देखते हुए, कम से कम 300 मिसे के लिए जोखिम समय निर्धारित करें।
    4. प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करें, और प्रकाश की तीव्रता को कम करते हुए प्रवर्धन, दिखाई छवि शोर के बिना उज्ज्वल छवियाँ प्रदान करने के लिए।
      नोट: छवि श्रृंखला एक ही क्षेत्र से ले रहे हैं, तो वैकल्पिक रूप से, कम जोखिम समय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये श्रृंखला परिणामस्वरूप छवि का इस प्रकार औसत और शोर कम करने के लिए अग्रणी, एक अधिकतम प्रक्षेपण छवि उपज के लिए कार्रवाई की जा सकती।
  12. बीएसए पीबीएस के साथ भरा एक 96 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में वापस (कोशिकाओं का सामना करना पड़) imaged माइक्रोचिप रखें।
  13. सीबी में माइक्रोचिप्स एक बार कुल्ला।
  14. 10 मिनट के लिए 2% जीए में सेते हैं।
  15. सीबी में एक बार, और बीएसए पीबीएस के साथ 3 बार कुल्ला।
  16. ESEM मैं जब तक स्टोर माइक्रोचिप्सmaging, बीएसए पीबीएस में एक नया 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं पहले से भरे। हर माइक्रोचिप के लिए एचपीएलसी ग्रेड पानी के साथ चार कुओं की एक पंक्ति को भरने।
    नोट: नमूने के कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है, हालांकि, पूर्ण इमेजिंग श्रृंखला के दो दिनों के भीतर किया जाता है जब सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं। QDs में धीरे-धीरे यह इसलिए ESEM इमेजिंग किया जाता है पहले से अधिक 10 दिनों के इंतजार के लिए सिफारिश नहीं है, नमूना से अलग करने के लिए शुरू कर देंगे।
    नोट: प्रतिदीप्ति छवियों भविष्य के विश्लेषण के लिए जमा हो जाती है। छवियों में कोशिकाओं के पदों पर आसानी से पाप खिड़की के कोनों स्थानीयकृत और कोनों के सापेक्ष पदों को मापने के माध्यम से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ जोड़ा जा सकता है।
    नोट: यह उच्च गुणवत्ता प्रतिदीप्ति छवियों को मुद्रित और ESEM छवियों रिकॉर्डिंग जब उन्मुखीकरण प्रयोजनों के लिए उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है।

पूरे कोशिकाओं 5. गीले ESEM स्टेम

  1. गीला स्टेम के लिए ESEM तैयार
    1. गैसीय माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डी माउंटetector (GSED), और (नमूना नीचे स्थित) स्टेम डिटेक्टर युक्त Peltier मंच,।
    2. मंच के माध्यम से ठंडा पानी का प्रवाह शुरू, और 3 डिग्री सेल्सियस तक तापमान निर्धारित किया है।
    3. मंच XY शून्य करने के लिए निर्देशांक सेट, और लगभग 6 मिमी के लिए काम दूरी समायोजित करें।
  2. माइक्रोचिप्स एक स्टायरोफोम बॉक्स में जमे हुए ठंडा तत्वों पर उदाहरण के लिए, शांत के साथ ESEM इमेजिंग के दौरान, 96 अच्छी तरह से थाली रखने के लिए।
  3. Precooled ESEM स्टेम चरण में एक नमूना लोड करने के लिए, ठंडा कंटेनर के बाहर 96 अच्छी तरह से थाली ले और करीब खोला ESEM चरण के लिए जगह है। इसके बगल में एक नया कमरा साफ ऊतक रखो।
  4. जल्दी से एक अच्छी तरह से एचपीएलसी ग्रेड पानी से भर में, के बारे में एक दूसरे के लिए यह चार बार, हर बार सूई से (अप का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ) एक माइक्रोचिप कुल्ला।
  5. साफ कमरे ऊतक पर माइक्रोचिप संक्षेप की पीठ दाग और precooled चरण में माइक्रोचिप जगह है। कोशिकाओं गीला रहने सुनिश्चित करें कि, यह हो सकता हैएक परावर्तक सतह द्वारा मान्यता प्राप्त (एक सुस्त सतह में परिणाम सुखाने)।
  6. ठंडा एचपीएलसी ग्रेड पानी के 3 μl (pipet टिप के साथ सतह को छूने के लिए नहीं सुनिश्चित कर लें) के साथ नमूना सतह गीला, और चरण में नमूना ठीक।
  7. नमूना के करीब मंच पर तीन अतिरिक्त 3 μl पानी की बूंदों रखें।
  8. नमूना चैम्बर बंद
  9. । दबाव पा 800 और 1500 के बीच पांच बार साइकिल से नमूना कक्ष शुद्ध 800 फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ साइकिल चालन के अंत।
  10. पर इलेक्ट्रॉन बीम (30 केवी) स्विच और माइक्रोचिप खिड़की के स्थान के लिए खोज करने के लिए यानी दोनों डिटेक्टरों, GSED, और स्टेम डिटेक्टर के साथ सबसे कम वृद्धि के तहत नमूना जांच करते हैं।
    नोट: पानी की परत भी मोटी है, खिड़की दिखाई नहीं हो सकता। इस मामले में, 760 पा के लिए दबाव को कम करने के लिए शुरू और कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें। खिड़की पहली GSED साथ दिखाई हो जाता है।
  11. Specim ले जाकर छवि के केंद्र में पाप झिल्ली खिड़की स्थितिमंच और एन 750-720 पा के लिए दबाव कम।
    नोट: पानी की परत काफी पतली है, जब खिड़की भी स्टेम डिटेक्टर के साथ दिखाई हो जाता है।
  12. अब से छवियों को रिकार्ड करने के लिए स्टेम डिटेक्टर के अंधेरे क्षेत्र खंड का उपयोग करें। सबसे पहले, पूरा खिड़की क्षेत्र पर सभी कोशिकाओं दिखा एक या दो छवियों को प्राप्त।
  13. , प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ इन ESEM छवियों की तुलना पाप खिड़की के कोनों का पता लगाने।
  14. बढ़ाई, रोटेशन, और संभव मिरर की तुलना करके दोनों माइक्रोस्कोपी के तौर तरीकों की फ्रेम में समन्वय सहसंबंधी। दोनों छवियों में एक ही कोशिकाओं का पता लगा।
  15. ऐसे eucentric ऊंचाई, ठीक फोकस और लेंस stigmatism के सुधार के रूप में इमेजिंग सेटिंग्स, समायोजित करने के लिए छोटा सा सुविधाओं के साथ बहुत छोटे धूल कणों या एक सेल क्षेत्र का चयन करें। कम से कम 50.000X की बढ़ाई पर काम, एक इलेक्ट्रॉन जांच चालू लगभग 0.6 एनए, 30 μs के एक पिक्सेल-समय ध्यान केन्द्रित करना, और 1024 x 884 पिक्सल के एक छवि आकार का उपयोग करें।
    नोट: अन्य सेटिंग्स भी बी सकता हैई के रूप में लंबे समय इलेक्ट्रॉन खुराक की वृद्धि से बचा जाता है के रूप में इस्तेमाल किया।
    नोट: बहुत साफ काम कर यहां तक ​​कि जब प्रोटोकॉल एक साफ कमरे के वातावरण में निष्पादित नहीं है, क्योंकि चिप सतहों व्यवहार में हमेशा की तरह, कुछ धूल कणों में शामिल होंगे।
  16. QD लेबल की कोशिकाओं से स्टेम छवियों को रिकार्ड करने के लिए, प्रतिदीप्ति छवियों को देखें और ब्याज की एक सेल चुनें।
    नोट: यह मजबूत QD संकेतों दिखा एक सेल के साथ शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है।
  17. इस सेल की एक स्टेम सिंहावलोकन छवि रिकॉर्ड।
  18. सेल सीमा दिखाई दे रहा है, जहां एक परिधीय क्षेत्र के पास जाओ और 50.000X बढ़ाई तक पहुंचने के लिए ज़ूम।
  19. व्यक्तिगत QDs दिखा रिकार्ड छवियों, 20-30 μsec के पिक्सेल वास बार का उपयोग करें। केवल एक बार उच्च वृद्धि के साथ विकिरण क्षति, छवि हर क्षेत्र से बचने के लिए।
    नोट: आमतौर पर, इस स्तर दोनों, ध्यान और stigmatism के सुधार पर, कुछ ठीक समायोजन की जरूरत है।
  20. उच्च बढ़ाई छवियों, जूम आउट, और एसी के लिए पर्याप्त संख्या की रिकॉर्डिंग के बादगायकगण एक और स्टेम सिंहावलोकन छवि, सिर्फ अंधेरे आयतों के रूप में उच्च बढ़ाई के साथ दर्ज क्षेत्रों का चित्रण।
    नोट: ये सिंहावलोकन छवियों बाद में ESEM और प्रतिदीप्ति छवियों सहसंबंधी और सेलुलर संदर्भ में उच्च बढ़ाई छवियों का सटीक स्थान निर्धारित करने के लिए की सेवा करेंगे।
  21. , ब्याज की अगले सेल करने के लिए आगे बढ़ें एक सिंहावलोकन छवि के साथ शुरू, उच्च बढ़ाई छवियों की एक श्रृंखला रिकॉर्ड है, और एक सिंहावलोकन छवि के साथ खत्म होता है।
  22. ESEM एक इमेजिंग सत्र के अंत में, चैम्बर बाहर निकलने के लिए शुरू करने से पहले 850-900 पा के लिए दबाव बढ़ाने के लिए।
    नोट: दबाव की यह वृद्धि एक अभी भी गीला सतह के साथ माइक्रोचिप उबरने का मौका सुधार; हालांकि, यह हमेशा हासिल नहीं किया जा सकता है। अगर वांछित बाहर सूख नहीं किया गया है कि एक नमूना समय में एक बिंदु पर बाद में ESEM में reinvestigated, बीएसए पीबीएस में बहाल किया जा सकता है।

Representative Results

चित्रा 1 और 2 बरकरार, पूरी तरह से हाइड्रेटेड COS-7 कोशिकाओं में कल्पना QD655 लेबल, झिल्ली ही सीमित EGFR के प्रतिनिधि छवियों को दिखाने के। चित्रा 1 एक में डीआईसी छवि कोशिकाओं की झिल्ली स्थलाकृति के एक छाप देता है, और चित्रा 1 बी में इसी प्रतिदीप्ति छवि EGF बायोटिन ऊष्मायन। चित्रा 1 ए का 3 मिनट के बाद EGFR का वितरण दर्शाया गया है और बी प्रत्येक दो से सिले हैं एक 40x हवा उद्देश्य के साथ दर्ज की छवियों। EGF सक्रिय EGFR पूरे सेलुलर सतह पर वितरित किया जाता है। सबसे कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति (चित्रा 1 बी) के एक मामूली वृद्धि EGFR 20 के एक स्थानीय रूप से वृद्धि हुई घटना का संकेत है, सेल किनारों पर देखा जा सकता है। एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग कर आयोजित नियंत्रण प्रयोगों (नहीं दिखाया डेटा) विशिष्ट EGFR लेबलिंग सत्यापित। इन नियंत्रणों शामिल: सीई के पिछले ऊष्मायन के बिना 1) एक नियंत्रण लेबलिंगगैर biotinylated EGF और एसटीआर-QDs साथ EGF बायोटिन, यानी, एसटीआर-QDs साथ ही ऊष्मायन, और 2) एक ऊष्मायन के साथ LLS।

आयतों के साथ चिह्नित तीन कोशिकाओं को आगे ESEM-स्तंभ के साथ जांच की गई। चित्रा 1C में दर्शाया ESEM स्टेम चित्र - ई इन कोशिकाओं के कम बढ़ाई रूपरेखा दिखा। इन संचरण छवियों सिलिकॉन नाइट्राइड (पाप) देखने खिड़की के साथ एक सिलिकॉन माइक्रोचिप पर रखा सेल के ऊपर रहने वाले पानी की एक पतली परत के साथ हाइड्रेटेड राज्य में पूरे कोशिकाओं को दर्शाते हैं। माइक्रोस्कोप निहित जल वाष्प में निर्वात चैम्बर, और नमूना तापमान और दबाव के बीच संतुलन कोशिकाओं से अधिक तरल पदार्थ की एक पतली परत बनाए रखने के लिए समायोजित किया गया। व्यक्ति की कोशिकाओं को आसानी से पाप झिल्ली खिड़की पर उनके आकार और स्थान के कारण मान्यता प्राप्त किया जा सकता है। कम बढ़ाई ESEM स्टेम छवियों पड़ोसी कोशिकाओं की ओर सेल किनारे से बढ़ा है, ऐसे filopodia के रूप में ठीक संरचनाओं, पता चलता है, और कुछ संरचनाओंपतले सेल क्षेत्रों के अंदर। नमूना के माध्यम से प्रसारण इस्तेमाल ऊर्जा (30 कीव) के इलेक्ट्रॉनों के लिए संभव नहीं है क्योंकि नाभिक सहित मोटी केंद्रीय सेलुलर क्षेत्रों सफेद दिखाई देते हैं।

उच्च संकल्प ESEM स्टेम छवियों पतली, परिधीय क्षेत्रों में दर्ज किए गए। एक पतली तरल परत में कोशिकाओं की पतली क्षेत्रों में नैनोकणों के ESEM स्टेम के लिए स्थानिक संकल्प 3 एनएम के लिए राशि के लिए पिछले एक अध्ययन 6 में निर्धारित किया गया था। चित्रा 2A में दिखाया चार उच्च संकल्प छवियों - डी चित्रा 1C में छोटे आयतों के स्थानों पर दर्ज किया गया - ई बढ़ाई रूप में उज्ज्वल, गोली के आकार छड़ दिखाई दे रहा QDs में व्यक्तिगत विचार करने के लिए पर्याप्त था इस्तेमाल किया, हर एक व्यक्ति के लिए बाध्य EGFR। QD655 6 एक्स 14 एनएम 2 के विशिष्ट आयाम है।

आयताकार क्षेत्र के लिए इसी चित्रा 2A (figu में सेल पर संकेत1 सी आरई) एक झिल्ली पर QD लेबलों की छवि को पार तिरछे गुना से पता चलता है। यह झिल्ली संरचना आसपास झिल्ली क्षेत्रों की तुलना में एक उच्च EGFR घनत्व है। कई स्थानों पर, दो लेबल करीब निकटता में थे। 20 और 24 एनएम की दूरी के साथ दो उदाहरण तीर के साथ संकेत कर रहे हैं। लेबल की ये जोड़े EGFR dimers करने के लिए संबंधित के रूप में व्याख्या कर रहे हैं। चित्रा 2 बी एक सेल (चित्रा -1, बाएं आयत) के किनारे से एक उदाहरण देता है, EGFR monomers और dimers के रूप में अच्छी तरह से देखा जा सकता है। चित्रा -2 (चित्रा 1C, सही आयत) एक कम प्रतिदीप्ति संकेत, यानी, कम EGFR घनत्व के साथ एक क्षेत्र का दर्ज किया गया था। फिर भी, EGFR भी रूप में अच्छी तरह dimers में यहां पाया गया था। इसके अलावा, 10 या 11 EGFRs के दो समूहों उपस्थित थे (ellipses देखें)। चित्रा 2 डी कई मोनोमर्स के अलावा, 5-6 EGFRs सहित छोटे समूहों के साथ एक झिल्ली गुना (चित्रा 1E) का एक और उदाहरण से पता चलता हैऔर dimers।

चित्रा 2 में सभी लेबल पदों के लिए निर्धारित किया गया था इस डेटा, जोड़ी सहसंबंध समारोह 21 जी (x) से प्राप्त किया जा सकता है कि जानकारी की तरह का एक उदाहरण के रूप में। इस विश्लेषण इस प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है और प्रक्रिया में वर्णित किया गया है कि नोट कहीं और 6.7। जी (x) एक संदर्भ के कण से एक निश्चित रेडियल दूरी एक्स के अंदर पाया जा करने के लिए एक कण का मौका का एक उपाय है। जी (x) = 1 एक यादृच्छिक वितरण का प्रतिनिधित्व करता है, और एक बड़ा मूल्य क्लस्टरिंग के लिए सबूत है। 210 लेबल के एक कुल के पदों को स्वचालित रूप से चित्रा 2A-डी के चार छवियों में पता चला रहे थे, और जी (x) 5 एनएम के एक बिन आकार और 10 एनएम के एक बैंडविड्थ के साथ एक समरेखण फिल्टर का उपयोग कर की गणना की गई। जी (x) वक्र (चित्रा 3) 25 एनएम के एक पसंदीदा केंद्र के लिए केंद्र QD दूरी से पता चलता है। EGFRs इस प्रकार बेतरतीब ढंग से उन्मुख, लेकिन उनमें से एक महत्वपूर्ण अंश इस वरीय दूरी पर रहता है नहीं कर रहे हैं। एक approximat सेई आणविक मॉडल 6 (चित्रा 3 इनसेट) हम QD और EGF बाध्यकारी जेब के बीच केंद्र के लिए केंद्र की दूरी के बराबर है कि अनुमान लगाने के लिए ~ करने के लिए एक EGFR डिमर से जुड़ी दो QDs के बीच 14 एनएम, और केंद्र के लिए केंद्र की दूरी ~ 27 एनएम (इस मूल्य की वजह से लिंकर के लचीलेपन के लिए कुछ नैनोमीटर से भिन्न होने की संभावना है) हो सकता है। वरीय लेबल दूरी विधि की शुद्धता के भीतर EGFR डिमर के लिए उम्मीद लेबल दूरी के साथ इस प्रकार के अनुरूप है। जी (x) वक्र डेटा के साथ संगत समूहों की उपस्थिति का संकेत है, अप करने के लिए 300 एनएम की दूरी के लिए एकता की तुलना में बड़ा है। इस विश्लेषण EGFR के stoichiometry हमारे विधि के साथ अध्ययन किया जा सकता है दिखाता है।

चित्रा 4 लेबलिंग EGF की QD800 के साथ प्रदर्शन किया गया था, और एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य प्रतिदीप्ति छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था, सिवाय इसके कि चित्रा 2 के रूप में एक समान परिणाम से पता चलता है। इस डाटा को इन विशिष्ट परिणाम भी जब पाया जाता है कि इस बात की पुष्टिEGFR लेबलिंग के पास लाल स्पेक्ट्रम में फेंकना जो QDs, साथ किया जाता है। चित्रा -4 ए एक प्रतिनिधि सेल के प्रतिदीप्ति छवि, चित्रा 4 बी ESEM स्टेम सिंहावलोकन मोड में एक ही सेल से पता चलता है और चित्रा 4C दर्ज एक 150,000 एक्स बढ़ाई छवि है, सेल के ऊपरी झिल्ली सीमा पर (चित्रा 4 बी में आयत देखें)। 2A और डी चित्रा के लिए भी इसी तरह, छवियों को एक झिल्ली गुना पर QD लेबल EGFR पर कब्जा करने और, मोनोमेरिक dimeric, और क्लस्टर रिसेप्टर्स से पता चलता है। इलेक्ट्रॉन घने QD कोर ~ 5 एनएम के अपने छोटे कोर आकार 22 के साथ संगत 655 एनएम पर उत्सर्जन QDs की कोर की तुलना में कुछ छोटे और राउंडर, प्रतीत होता है कि ध्यान दें।

चित्र 1
चित्रा 1. correlative डीआईसी, EGF की QD655 के प्रतिदीप्ति और ESEM स्टेम पूरी तरह से हाइड्रेटेड COS-7 कोशिकाओं पर EGFR लेबल रोंग>। प्लाज्मा झिल्ली का एक स्थलाकृतिक छाप दे पाप झिल्ली खिड़की क्षेत्र पर विकसित कोशिकाओं, (ए) डीआईसी छवि। केन्द्र स्थित पाप झिल्ली खिड़की पर कोशिकाओं दिखा (बी) प्रतिदीप्ति छवि (धराशायी आयत द्वारा चिह्नित)। (सी - ई) ए और बी में आयतों के साथ चिह्नित कोशिकाओं से तीन ESEM स्टेम कम बढ़ाई छवियों। ये सेल सिंहावलोकन छवियों बाद में दर्ज की गई उच्च संकल्प छवियों का सटीक स्थान निर्धारित करने के लिए काम करते हैं। (2A चित्रा-डी में दिखाया गया है) चार उच्च संकल्प छवियों के स्थान सफेद आयतों के साथ चिह्नित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 1 बी में चिह्नित क्षेत्र के 75,000X बढ़ाई (ए) सूक्ष्मछवि। कई मोनोमर्स दिखाई दे रहे हैं। कई dimers तीर के साथ संकेत कर रहे हैं। (बी) और बाएं के 50,000X बढ़ाई हासिल (सी) छवियों, क्रमश: ठीक है, झिल्ली क्षेत्रों चित्रा 1C में चिह्नित। EGFRs के समूहों रेखांकित कर रहे हैं। चित्रा -1 में चिह्नित स्थान पर 50,000X बढ़ाई के साथ दर्ज (डी) छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
रेडियल दूरी के समारोह के रूप में 3 चित्र जोड़ी सहसंबंध समारोह जी (x) अंतर-गड्ड के लिए चुना गया x चित्रा 2A-डी में पता चला सभी 210 लेबल की CLE दूरी। एक केंद्र के लिए केंद्र QD दूरी एजी (x) = 1 एक यादृच्छिक मौका इंगित करता है, जिससे यादृच्छिक से होने वाली का एक बहुत उच्च मौका है इंगित करता है कि एनएम 25 में चोटी। धराशायी लाइन एक यादृच्छिक वितरण की आंख का प्रतिनिधित्व जी (x) के लिए एक गाइड है। इनसेट बाध्य EGF और बायोटिन के माध्यम से जुड़ा streptavidin लेपित QDs साथ EGFR डिमर की एक अनुमानित आणविक मॉडल से पता चलता है। streptavidin के मॉडल, EGF और EGFR 1stp (streptavidin), 1EGF (EGF) के CPK मॉडल से प्राप्त किया गया, 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO और 2GS6 (EGFR) Jmol संस्करण द्वारा बनाई गई RCSB प्रोटीन प्रोटीन डाटा, में संरचनाओं 12.2.15। RCSB Ligand एक्सप्लोरर संस्करण 1.0 में के रूप में तैयार बायोटिन मॉडल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4. अनुकरणीय COS-7 सेल EGF की QD800 के साथ लेबल और correlative प्रतिदीप्ति और ESEM स्टेम साथ imaged। (ए) प्रतिदीप्ति छवि, (बी) कम बढ़ाई सिंहावलोकन ESEM स्टेम छवि। (सी) 150,000X बढ़ाई बी में आयत के स्थान पर दर्ज उच्च संकल्प छवि। , Monomeric dimeric, और क्लस्टर EGFRs EGF की QD655 साथ लेबलिंग के लिए इसी तरह का पता लगाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

पूरे कोशिकाओं में इस तरह के EGFR के रूप में झिल्ली प्रोटीन, के स्थानिक वितरण और stoichiometry अध्ययन, अपने कार्य और 11-14 उसके संभावित परिवर्तनों के बारे में महत्वपूर्ण संदर्भ जानकारी प्रदान करता है। यह जानकारी सीधे कक्ष या कक्षों 15 के बीच मतभेद में प्रोटीन का स्थानीयकरण के बारे में खो दिया है, जिसके लिए आमतौर पर इस्तेमाल जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग कर एक subcellular स्तर पर मोनोमर्स, dimers, और समूहों के वितरण का अध्ययन करने के लिए चुनौती दे रहा है। अपनी stoichiometry व्यक्ति बरकरार कोशिकाओं 4-7 के संदर्भ में अध्ययन किया जा सकता है, ताकि यहां वर्णित लेबलिंग और माइक्रोस्कोपी तरीके में कुछ नैनोमीटर की लंबाई पैमाने पर प्रोटीन परिसरों के दृश्य की अनुमति। यह (सुपर संकल्प) प्रकाश माइक्रोस्कोपी 23 अपने संकल्प एक प्रोटीन परिसर में लगे हुए अणुओं भेद करने के लिए अपर्याप्त है क्योंकि साथ संभव नहीं है। Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) एक पहनावा औसतन तकनीक <है24> समर्थन, और जरूरी ऊर्जा हस्तांतरण 25 से कम दूरी का एक परिणाम के रूप में dimers और उच्च आदेश समूहों का पता नहीं लगा। निकटता बंधाव assays के 26 वास्तव में दूरी को मापने के लिए नहीं है और इस प्रकार एक समान प्रोटीन घनत्व के साथ एक सेलुलर क्षेत्र से, यादृच्छिक संयोग से पता चला proximities के एक नंबर के लिए अग्रणी अनिवार्य रूप से, एक उच्च प्रोटीन घनत्व के साथ एक सेलुलर क्षेत्र के बीच भेद लेकिन प्रोटीन युक्त करने में सक्षम नहीं हैं लेबल के बीच अलग-अलग दूरियों का प्रदर्शन करते परिसरों। प्रोटीन परिसरों के घटक कल्पना करने के लिए आवश्यक उच्च संकल्प संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा हासिल की है। हालांकि, पूरे कोशिकाओं के पारंपरिक मंदिर प्लाज्मा झिल्ली 27, या प्लाज्मा झिल्ली तेजस्वी के माध्यम से करने की क्रिया या झिल्ली के बेतरतीब ढंग से गठित छोटे-छोटे टुकड़ों में जिसके परिणामस्वरूप 28,29 तोड़ने पतली नमूने / वर्गों की आवश्यकता द्वारा सीमित है। प्लाज्मा झिल्ली इस प्रकार एक कमी करने के लिए अग्रणी, एक पूरे के रूप में imaged नहीं हैसंभवतः महत्वपूर्ण सेलुलर संदर्भ जानकारी।

कोशिकाओं में प्रोटीन stoichiometry के अध्ययन के लिए अन्य प्रयोगात्मक चुनौतियों एप्लाइड प्रोटीन लेबलिंग से पैदा होती है। आमतौर पर इस्तेमाल किया immunolabeling रिसेप्टर और लेबल के बीच एक-से-एक stoichiometry केवल एक मोनोवैलेन्ट जांच के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि कठिनाई भालू; प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए आवश्यक हैं जब यह मामला नहीं है। प्रोटीन stoichiometry बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, यह एक जांच रिसेप्टर पर एक मिलान करने के लिए विशिष्ट रूप से बांधता है और एक फ्लोरोसेंट जांच या दूसरे पक्ष पर एक उच्च परमाणु संख्या nanoparticle के लिए एक बाध्यकारी साइट है कि आवश्यक है। पड़ोसी एकल प्रोटीन, homodimers, या बड़े समूहों के बीच एक भेदभाव संभव नहीं है, तो यह है कि दूसरे, एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ प्राप्त सटीक कम से कम नहीं EGFR परिवार के रिसेप्टर्स के लिए, 30 एनएम के लिए अपने बड़े आकार 30 के अकाउंट में प्रतिबंधित है। बहुत छोटे विशिष्ट लेबल साहित्य और सीए में जाना जाता हैएन इंट्रासेल्युलर लेबलिंग 31 के लिए भी लागू किया जा सकता है लेकिन उन आमतौर पर इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं। पूरे लेबल (EGF की बायोटिन- streptavidin-G) की लंबाई EGFR रूप में एक समान आयाम की है, और पर्याप्त छोटा डिमर का पता लगाने में सक्षम हो। इसके अलावा, वर्णित दो कदम लेबलिंग प्रक्रिया लेबलिंग प्रेरित रिसेप्टर क्लस्टरिंग से बचा जाता है।

हमारे विधि बहुत मुश्किल है, बहुत ज्यादा नहीं लेबल प्रोटीन की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से अधिक नहीं है। चरणों की संख्या को कहते हैं और कदमों में से एक में एक त्रुटि प्रयोग में पूरी तरह विफल करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं हालांकि, बाद से एक प्रयोग है, महान देखभाल के साथ बाहर ले जाने की जरूरत है। माइक्रोचिप्स हैंडलिंग की सिफारिश की है मंदिर ग्रिड लेकिन कुछ प्रशिक्षण खाली चिप्स की हैंडलिंग की तुलना में अधिक कठिन नहीं है। पूरे हाइड्रेटेड कोशिकाओं के ESEM स्टेम शायद सबसे कठिन पहलू है, और QDs में कल्पना करने के लिए जरूरत के रूप में 3 एनएम के चारों ओर एक संकल्प तक पहुंचने के लिए कम से कम एक कुशल ऑपरेटर और अभ्यास के कई दिनों की आवश्यकता है। विकिरण बांधजांच के तहत नमूना साल की उम्र में एक जोखिम प्रस्तुत करता है। दबाव और तापमान को ध्यान से एक पानी की परत को बनाए रखने के लिए देखा जाना चाहिए। इसके अलावा, पानी की परत की मोटाई की कोशिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं। कहीं और 6 वर्णित के रूप में यह नमूना ऊपर गैसीय इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग कर पानी की परत की उपस्थिति पर नजर रखने की सलाह दी जाती है। सेलुलर क्षेत्रों केवल नुकसान से बचने के लिए एक या दो बार imaged किया जाना चाहिए।

विधि का एक प्रमुख सीमा फैटी बारे में उच्च संकल्प जानकारी अनुपस्थित है। अन्य तकनीक, उदाहरण के लिए, क्रायो मंदिर के लिए, प्रोटीन संरचना, और सेलुलर फैटी 15 का अध्ययन करने की जरूरत है। दूसरे, समय चूक माइक्रोस्कोप में जीवित कोशिका में प्रोटीन की एक बहु के गतिशील परस्पर क्रिया का अध्ययन विकिरण क्षति के कारण संभव नहीं है, और राज्य के अत्याधुनिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी 23 की आवश्यकता है। वर्तमान में, हमारे विधि एल के बाद से dimers के पूर्ण स्तर का निर्धारण करने में सक्षम नहीं हैabeling दक्षता अज्ञात है, लेकिन हम भविष्य में इस तरह के डेटा को जोड़ने की उम्मीद है। यह dimers वर्तमान या नहीं कर रहे हैं बताने के लिए अगर फिर भी संभव है। साहित्य से यह 15% के आसपास भी एक लेबलिंग दक्षता पर्याप्त सांख्यिकीय महत्व 32 के साथ dimers का पता लगाने के लिए पर्याप्त है कि, जाना जाता है।

यह विशिष्ट एंटीबॉडी के biotinylated फैब टुकड़े के माध्यम से, उनकी ligand के माध्यम से अन्य झिल्ली बाध्य रिसेप्टर्स अध्ययन करने के लिए आसानी से संभव है, या वर्णित दो कदम लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य छोटे linkers 7 के माध्यम से। हम पहले से ही QDs की दो अलग अलग रंग (आकार) का इस्तेमाल किया जा सकता है, और सोने nanoparticle लेबलिंग पूर्व कार्य 6 में इस्तेमाल किया गया था कि प्रदर्शन किया है के बाद से, यह एक ही प्रयोग में कई प्रोटीन प्रजातियों लेबल करने के लिए संभव लगता है। कई प्रोटीन प्रजातियों के stoichiometry के अध्ययन के लिए प्रमुख चुनौती सम्मान पर प्राप्त रिश्तेदार stoichiometry की एक सामान्य बनाने के दोनों प्रजातियों के लिए या कम से कम एक समान लेबलिंग दक्षता सुनिश्चित कर रहा हैलेबलिंग क्षमता ive। फिर भी, इस अध्ययन में इस्तेमाल दो अलग QDs (आंकड़े 2 और देखना 4) लेबलिंग दक्षता में ज्यादा अलग नहीं लग रहे हो। QDs साथ दो कदम लेबलिंग, और correlative प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और ESEM स्टेम शामिल वर्णित विधि पूरे कोशिकाओं की अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन के जटिल परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका प्रस्तुत करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted fluorescence microscope Leica AF6000 + DMI6000B
ESEM FEI Company Quanta 400 FEG
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate Gibco 31966-021
DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid Gibco 14190-144
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) Gibco 16000-036
Cellstripper Mediatech, Inc. 25-056 Cl
Water, chromasolv Plus for HPLC Sigma-Aldrich 34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBS Carl Roth 1058.1
Ethanol, Rotisolv HPLC grade Carl Roth P076.2
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) Carl Roth O163.2
Gelatin, from cold water fish skin Sigma-Aldrich G7041-500G
Glycine Carl Roth T873.1
Epidermal Growth Factor Molecular Probes E3477 Biotin-XX Conjugate (biotin EGF)
Sodium teraborate decahydrate Sigma-Aldrich S9640-500G
Boric acid Sigma-Aldrich B6768-500G
Qdot 655 streptavidin conjugate Molecular Probes Q10121MP
Qdot 800 streptavidin conjugate Molecular Probes Q10173MP
Silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm DENS Solutions Custom made

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References

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Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying … More

Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. J. Vis. Exp. (103), e53186, doi:10.3791/53186 (2015).

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