Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Studerer Støkiometrien av epidermal vekstfaktor reseptor i intakte celler bruker korrelative Mikros

Published: September 11, 2015 doi: 10.3791/53186
Automatic Translation
1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

Abstract

Denne protokollen beskriver merking av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) i COS7-fibroblast celler, og etterfølgende samsvar fluorescensmikroskopi og miljø scanning elektronmikroskopi (ESEM) av hele celler i hydrert tilstand. Fluorescerende kvanteprikker (QDS) ble koblet til EGFR via en to-trinns merking protokollen, og gir en effektiv og spesifikk proteinmerking, og samtidig unngå etikett-indusert gruppering av reseptoren. Fluorescensmikropskopi gitt oversiktsbilder av de cellulære plasseringene av EGFR. Skanningen transmisjonselektronmikroskopi (STEM) detektor ble brukt til å detektere de QD etiketter med nanoskala oppløsning. De resulterende korrelative bilder gir data for den cellulære EGFR fordeling, og støkiometrien på enkelt molekylært nivå i den naturlige sammenheng med den hydratiserte intakt celle. ESEM STEM-bildene viste reseptoren til å være tilstede som monomer, som homodimer, og i små klynger. Merking med to forskjellige QDS,dvs. man sender ut ved 655 nm og 800 avdekket lignende karakteristiske resultater.

Introduction

En ny tilnærming ble innført nylig, til bilde hele celler med merkede proteiner i flytende tilstand ved hjelp STEM 1-3, eller trene seg fluorescens mikroskopi og STEM 4-7. Denne metoden er i stand til å studere den romlige fordelingen av membranproteiner og proteinkomplekser inkludert deres støkiometri på enkelt molekyl nivået i de intakte plasmamembraner av hele celler. Her beskriver vi en protokoll som involverer en to-trinns spesifikk merking av reseptorproteinene med fluorescerende kvanteprikker (QDS) 8, og samsvar lysmikroskopi og ESEM-STEM. Som eksempel har vi studert EGFR, en membranprotein som hører til proteinkinase superfamilien. Ved ligandbindende, reseptoren aktiveres og deretter danner en dimer med en annen aktivert EGFR; den påfølgende signal kaskade driver celleproliferasjon 9. Mutasjoner som fører til unormal EGFR uttrykk eller aktivitet spiller en sentral rolle i mange typer kreft 10. Studying den romlige arrangement av denne membran reseptor i hele celler gir viktig kontekst informasjon om sin funksjon og mulige endringer av disse 11-14. Men det er fortsatt vanskelig å undersøke fordelingen av EGFR monomerer, dimerer, og klynger direkte på et (under-) cellulært nivå med biokjemiske- eller konvensjonelle fremgangsmåter 15 mikroskopi. Vår fremgangsmåte er i stand til å visualisere EGFRs med en romlig oppløsning på noen få nanometer slik at plasseringen av proteiner i et kompleks kan bestemmes. Viktigst, den oppnådde informasjon om den støkiometriske distribusjonen relaterer til den opprinnelige situasjonen for protein i den intakte cellen.

For å oppnå en kort avstand mellom etiketten og reseptoren, ble EGFR direkte merket via sin ligand EGF, ved hjelp av en biotin-streptavidin binding til en gang daglig. Denne etiketten kan påvises både med fluorescence- og elektronmikroskopi. Vi har brukt dette merket for samsvar avbildning av COS7 celler ivæske omsluttet av en mikrofluidkammer tidligere 1,16,17. Imidlertid, på grunn av et multiplum av streptavidin-molekyler pr QD, kan denne etiketten indusere clustering reseptoren, som fører til en lav virkningsgrad merking eller ganske dyre eksperimenter, og det er ikke mulig å konkludere med støkiometrien av proteinet som undersøkes. Etikett indusert reseptor clustering kan unngås fullstendig ved anvendelse av den to-trinns prosedyre merking er presentert her, som resulterer i en probe som omfatter biotinylert EGF til hvilken bare en streptavidin-kvante dot (STR-QD) er koplet. Cellene ble først inkubert med biotinylert EGF, og deretter løst. Fikseringstrinnet avgjør tidspunktet ved hvilket protein prosesser blir stoppet (avhengig av hastigheten av fiksering). STR-QD påføres deretter som annet trinn av merkingsprotokollen. Clustering finner ikke sted fordi dynamisk membran bevegelse av proteinene er hindret når proteinene er festet. Videre STR-QD-løsning, som erdyreste komponenten av forsøket, kan anvendes i en optimalisert lav konsentrasjon, og dette andre trinnet av merking er ikke tids avgjørende, det vil si, det QD kobles i flere minutter.

Å studere støkiometrien EGFR som distribueres i hele celler, var cellulære prøver forberedt på silisium mikrobrikker 18. Etter bruk av to-trinns QD merking, og registrering av fluorescens mikroskopi bilder, ble cellene skylt med rent vann, og avbildes i hydratisert tilstand ved hjelp ESEM STEM-19. De resulterende korrelative bilder gir informasjon om cellulær EGFR distribusjon, og støkiometri i sin naturlige sammenheng med hydrerte celler. En lignende metode ble brukt til å studere HER2 proteiner i brystkreftceller i en fersk studie 7.

Protocol

1. Utarbeidelse av Merking og Fixation reagenser

  1. Forbered merking buffer (BSA-GEL-PBS) ved anvendelse av autoklavert fosfat-bufret saltoppløsning, pH 7,4 (PBS). Supplement med 1% BSA (bovin albumin fraksjon V, biotin-fri) og 0,2% gelatin (GEL, fra kaldt vann fisk hud) og virvle / rist godt.
    Merk: Kan lagres i ~ 5 dager ved 4 ° C.
  2. Tilberede vaskebuffer (PBS-BSA) fra Autoclaved fosfatbufret saltvann, pH 7,4. Supplement med 1% BSA og virvle / rist godt. Merk: Kan lagres i ~ 5 dager ved 4 ° C.
  3. Forbered 50 mM borat buffer (BB) fra 200 mm borsyre lager løsning, pH justeres til 8,3 med 200 mm natriumtetra. Note: Kan lagres for ~ 12 måneder ved 4 ° C.
  4. Forbered 0,1 M kakodylatbuffer (CB) fra 0,2 M natriumkakodylat stamløsning, pH justert til 7,4, supplert med 0,1 M sukrose.
    Merk: Åpnet stamløsningen kan lagres for ~ 5 dager ved 4 ° C.
  5. Forbered 0,1 M glysin i PBS (GLY-PBS).
    Note: Kan lagres for ~ 2 måneder ved 4 ° C.
  6. Forbered 3% paraformaldehyde i CB (3% PFA) fra rykende fersk eller åpnet hetteglass med 16% PFA, stamløsning, EM klasse.
    Merk: Åpnet stamløsningen kan lagres for ~ 5 dager ved 4 ° C.
  7. Forbered 2% glutaraldehyd i CB (2% GA) fra rykende fersk (eller åpnet hetteglass) 25% GA stamløsning, EM klasse.
    Merk: Åpnet stamløsningen kan lagres for ~ 5 dager ved 4 ° C.
  8. Forbered 300 nM EGF-biotinmerking løsning
    1. Fortynne 6 mikrometer EGF-biotin stamløsning i BSA-GEL-PBS, bruke et volum på 100-200 mL per microchip. Brukes innen noen få timer.
  9. Forbered 10 nM STR-QD merking løsning
    1. Sentrifuger streptavidin-QD stamløsning i 4 minutter ved 8000 xg, ta supernatant og fortynnet 1:10 i BB. Forskjellige typer av QDS kan anvendes, for eksempel, QD655 eller QD800. Fortynne til endelig konsentrasjon i BSA-GEL-PBS, bruker 75-100 mikroliter per microchip. Brukes innennoen hr.

2. Utarbeidelse av siliciumnitrid Membranmicrochips

  1. Rens et mikroskop objektglass, som anvendes for lysmikroskopi, med et rent rom vev og høyytelses-væskekromatografi (HPLC) karakter etanol.
  2. I en laminær luftstrøm arbeidsbenk med et lavt støvnivå, åpne en 100 mm diameter petriskål, og legge renset mikroskop glass i formen; la fatet åpen.
  3. Med rene pinsett, fortrinnsvis belagt med karbonfiber eller annet belegg, ta 4-10 mikrobrikker med tynne (50 nm) silikonnitrid membraner, den ene etter den andre, ut av deres oppbevaringsboks og inn på objektglass. Ta tak i microchips forsiktig på sine sider og unngå å berøre den skjøre oversiden, som består av tynne siliciumnitrid membran. Ta stor forsiktighet for å alltid holde membranen side opp og ikke røre den.
    Merk: microchips skal være rektangulær og har flate kanter vinkelrett på deres siliciumnitrid dekketansikt, slik at de kan gripes lett.
  4. Lukk lokket på petriskålen og bringe den til en avtrekkshette. Få en ny location vev og sette den ved siden av petriskål. Forbered to rene 200 ml begerglass ved å fylle en med 50 til 70 ml aceton, og den andre med et tilsvarende volum av etanol, begge av HPLC-kvalitet. Overfør microchips fra glass-slide først på location vev.
  5. Fra vevet, overfører mikrobrikker en etter en inn i det første beger med aceton for å fjerne det beskyttende lag motstå. Vent 2 min, mens du forsiktig beveger begeret et par ganger for å sikre at microchips er godt skylt.
  6. Overføre microchips direkte inn i beger med etanol, uten å la dem tørke ut. Vent 2 min. Deretter overfører begeret til laminær luftstrøm benken. Få en ny clean room vev.
  7. Overfør chips på vev og la dem tørke i et par min. Overfør microchips på glasset lysbildet i petriskål, lukke fatet,og bringe den til plasma renere.
  8. Deponere glass lysbilde med microchips inn i plasma renere. Kjør en 5 min rengjøringsprogram for å gjøre overflaten av silikonnitrid hydrofil membran.
    Merk: Passende innstillingene som brukes for vår plasma renere er: 70 mTorr, gasstrøm på 11,5 SCCM for O 2 og 35,0 SCCM for Ar, 50 W frem radiofrekvens (RF) mål, 5 W RF rekkevidde og maks. reflektert RF.
  9. Sett glasset lysbilde med microchip tilbake i petriskål, og lukk lokket. Vær nøye med å holde mikrobrikker sterile fra nå av.
  10. Undersøke vinduet områder av mikrobrikker under et lysmikroskop for mulige brudd membran eller gjenværende smuss partikler.
  11. Bringe petriskål til laminær luftstrøm benken.
  12. Plasser følgende elementer i laminær luftstrøm benken: rør / flasker med innhold sterilisert 0,01% poly-L-lysin løsning (. PLL, molvekt 150,000-300,000, sterilfiltrert, og cellekultur testet), HPLCkvalitetsbestemt vann, Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, DMEM uten serum, et nytt rent rom vev, en steril 24-brønns plate (en 12-brønns plate kan også brukes), en steril 96- brønns plate, sterile pipettespisser, en pipette, og flat, avrundet tupp, pinsett.
  13. Ta 24-brønns plate, og fylle en brønn med PLL, og to brønner med HPLC-kvalitet vann, bruk en ca. volum på 1 ml pr brønn. Ta 96-brønns plate og fyll for hver mikrobrikke to brønner med serum supplert DMEM og ett godt med serum-free DMEM, bruke en ca. volum på 200 ul per brønn.
  14. Fra nå av bruke pinsett med sterile tips for å håndtere de microchips. Oppnå dette, for eksempel ved kort flammende og senere kjøling av tips av pinsett.
  15. Først overføre mikrobrikker fra glass-slide på location vev.
    Fra vevet, overføre opptil seks mikrobrikker inn i PLL-fylte brønn, inkuber mikrobrikker i 5 min.
    Ikkee: For et eksperiment med flere mikrobrikker, fylle flere brønner i 24-brønns plate.
  16. Deretter skylles de mikrobrikker ved å plassere dem, en etter en, inn i det første vannfylt brønn, og derfra inn i den andre vannfylte brønnen. Ikke la microchips i vannet lenger enn omtrent et minutt å unngå fjerning av PLL.
  17. Endelig plassere dem enkeltvis inn i DMEM-fylte brønner på 96-brønners plate. Oppbevar 96-brønns plate i CO 2 inkubator inntil cellesuspensjonen fremstilles.

3. Utarbeidelse av celler på Microchips

  1. Utføre en subkultur av COS7-celler for å fremstille en cellesuspensjon med en konsentrasjon på ca. 5 x 10 5 celler / ml. Sørg for at cellene er mono-spredt.
  2. Ta 96-brønns plate med microchips og legg en dråpe av cellesuspensjon til hver microchip. Vent 5 min.
  3. Begynn å undersøke vindusflater av mikrobrikker med en invertert mikroskop Choose det rette øyeblikket for å overføre den til en ny brønn med serum-free DMEM.
    Merk: En god tetthet av celler som er oppnådd med en celle pr omtrent 2500 mikrometer 2 område, tilsvarende 24 COS7-celler på en vindusstørrelse på 150 x 400 mikrometer. Høyere celletettheter har risiko for å hindre maksimal avflating av cellene. Vær oppmerksom på at etter en celle har lagt seg ned på SIN membran, må det 3-5 min til å utvikle nok vedheft til å motstå flytende av under overføring til den nye brønnen.
  4. Overfør microchip til neste godt når tilstrekkelige celler har levd på vinduet. Hold microchips alltid med cellene vendt opp og unngå berøring av denne siden.
  5. Etter overføringen undersøke hver microchip vinduet igjen. Hvis for mange celler ble vasket av og antall gjenværende cellene er utilstrekkelig, re-triturate cellesuspensjonen (for å bryte opp nydannede celleklumper) og gjentar trinn 03.01 til 03.05.
  6. Når alle overførte mikrobrikker har nokholde celler på deres vinduspartier, overfører flisen inn i den siste brønn med serumfritt DMEM. Plasser 96-brønns plate tilbake i CO 2 inkubator og la cellene komme seg og flate ut i flere timer, best O / N.

4. EGFR Merking, Fixation, og Fluorescensmikroskopi

  1. For de neste trinnene, kan du bruke en 96-brønn og en 24-brønns plate. Pre-fill brønner med de respektive løsninger, og bruke en rad eller kolonne per mikrochip. 24- brønns plate blir brukt under avtrekkshette for festemåten med CB, PFA og GA. Alltid overføre microchips med cellene vendt opp og unngå berøring av denne siden.
  2. Skyll mikrobrikker ved å plassere mikrobrikker i en brønn med frisk BSA-GEL-PBS, og deretter plassere 96-brønners plate i inkubator ved 37 ° C i 5 min.
  3. Inkuber med 300 nM EGF-biotin løsningen i 3 minutter ved 37 ° C. Fordi cellene vil starte endocytose av EGF-merket EGFRs, fortsett så fort som mulig for å step 4,4.
  4. Skyll 3 ganger med PBS og en gang med CB (nå 96-brønners plate er igjen ved RT).
  5. Inkuber i 3% PFA i 10 min.
  6. Skyll chips en tid med CB, og 3 ganger med PBS.
  7. Inkuber i GLY-PBS i 2 minutter, skylles 2 ganger med en gang PBS.
  8. Inkuber i 10 nM STR-QD i 10 min.
  9. Skyll 4 ganger med BSA-PBS.
  10. Senk en mikrobrikke i et glass-bottom 35 mm fatet forhåndsutfylt med BSA-PBS ved RT.
  11. Erverve differensial interferens kontrast (DIC) bilder og fluorescens bilder av QD-merkede celler.
    1. Bruk en luft objektiv 40X for oversiktsbilder av celler merket med QD655. Bruk en oljeneddyppingsobjektivet (for eksempel 63X) for å tillate en mest mulig effektiv samling av det emitterte fluorescerende lyset; Dette er spesielt nødvendig når avbildning celler merket med QD800.
    2. Bruk et filter kube som eksponerer QDS til fluorescenseksitasjon lys mellom 340 og 380 nm, og tillater innsamling av emittert lys over 420 nm suibord for de fleste QDS (Filter kuben A i dette tilfellet).
    3. Minimer lysintensiteten å unngå for intenst lys som kan skade prøven. Still eksponeringstiden til minst 300 msek, slik at signalene fra alle QDS er fanget, og bemerker at fluorescensen av QDS har en blinkende oppførsel.
    4. Juster lysintensiteten, og forsterkningen for å gi skarpe bilder uten synlige bildestøy, samtidig som lysintensiteten.
      Merk: Alternativt kan kortere eksponeringstid brukes hvis bildeserien er tatt fra samme region. Disse seriene kan behandles for å gi et maksimalt fremspring bilde, som fører til gjennomsnitts og dermed støy reduksjon av det resulterende bildet.
  12. Sett avbildes tilbake mikrobrikke (celler vendt oppover) inn i en brønn i en 96-brønns plate som er fylt med BSA-PBS.
  13. Skyll microchips 1 ganger i CB.
  14. Inkuber i 2% GA i 10 min.
  15. Skyll en gang i CB, og 3 ganger med BSA-PBS.
  16. Lagre microchips inntil ESEM jegmaging, i BSA-PBS ferdigfylte brønner i en ny 96-brønners plate. For hver mikrobrikke fylle en rad med fire brønner med HPLC-grade vann.
    Merk: Prøvene kan oppbevares ved 4 ° C i flere uker, men de beste resultater oppnås når den fullstendige bildeserien utføres i løpet av to dager. QDS vil sakte begynne å løsne fra prøven, det anbefales derfor ikke å vente mer enn 10 dager før ESEM bildebehandling er gjort.
    Merk: Fluorescens bilder blir lagret for senere analyse. Posisjonene til cellene i bildene lett kan korreleres med elektronmikroskopi bilder via lokalisere hjørnene av SiN vinduet og måling av stilling i forhold til hjørnene.
    Merk: Det anbefales å skrive ut høykvalitets fluorescens bilder og bruke dem til orienteringsformål når opptaket de ESEM bilder.

5. Wet ESEM-STEM av hele celler

  1. Forbered ESEM for våt STEM
    1. Monter gasssekundærelektron dpåvisnings (GSED), og Peltier scenen, som inneholder STEM detektor (under prøven).
    2. Starte strømmen av kjølevann gjennom scenen, og sett temperaturen til 3 ° C.
    3. Satt scenen xy-koordinater til null, og tilpasse arbeidsavstand til ca 6 mm.
  2. Under ESEM imaging, holder 96-brønns plate med microchips kjølig, for eksempel på frosne kjøleelementer i en isoporboks.
  3. For å laste inn en prøve til forkjølt ESEM-STEM scenen, ta 96-brønns plate ut av kjøletanken og plassere den nær åpnet ESEM scenen. Sett en ny clean room vev ved siden av seg.
  4. Raskt skylle en mikrobrikke (med cellene vendt opp) ved å dyppe den fire ganger, hver gang for ca et sekund, i en brønn fylt med HPLC-grade vann.
  5. Blot baksiden av mikrochip kort på location vev og plasser microchip inn i forkjølt scenen. Sørg for at cellene forblir våt, kan dette væregjenkjent av en reflekterende overflate (tørking resulterer i en matt overflate).
  6. Fukt prøveoverflaten med 3 pl avkjølt HPLC-grade vann (pass på at du ikke berører overflaten med pipette spissen), og fikse prøven i den fasen.
  7. Plasser tre ytterligere 3 mL vanndråper på scenen i nærheten av prøven.
  8. Lukke prøvekammeret
  9. Rens prøvekammeret ved å sykle trykket fem ganger mellom 800 og 1500 Pa. Avslutt sykling med 800 Pa.
  10. Slå elektronstråle (30 kV) på og undersøke prøven under laveste forstørrelse med begge detektorene, dvs. den GSED, og STEM detektor for å søke etter plasseringen av microchip vinduet.
    Merk: Hvis vannlaget er for tykt, kan det hende at vinduet ikke være synlig. I dette tilfellet, begynne å senke trykket til 760 Pa og vente et par min. Vinduet første blir synlig med GSED.
  11. Plasser SiN membran vinduet i midten av bildet ved å flytte specimen scene og redusere trykket til 750-720 Pa.
    Merk: Når vannlaget er tynt nok, blir vinduet også synlig med STEM detektoren.
  12. Fra nå av bruke mørke feltet segmentet av STEM detektor for å ta bilder. Først erverve ett eller to bilder som viser alle celler på hele vinduet området.
  13. Sammenlign disse ESEM bilder med lyset mikroskopi bilder, finn hjørnene av SiN vinduet.
  14. Korrelere koordinere rammer av både mikros modaliteter ved å sammenligne forstørrelse, rotasjon og mulig speiling. Finn de samme cellene i begge bildene.
  15. Velg svært små partikler eller en celle region med små funksjoner for å justere bildeinnstillingene, slik som eucentric høyde, den fine fokus og korrigering av objektivet stigmatism. Arbeid med en forstørrelse på minst 50.000X, bruke et elektron probe strøm rundt 0,6 nA, en piksel-oppholdstid på 30 mikrosekunder, og en bildestørrelse på 1024 x 884 piksler.
    Merk: Andre innstillinger kan også be brukes så lenge som en økning av elektron dose unngås.
    Merk: Selv når du arbeider veldig rent, vil chip flater i praksis alltid inneholde noen partikler, fordi protokollen ikke er utført i et rent rom miljø.
  16. For å ta opp STEM bilder fra QD-merkede celler, se fluorescens bilder og velge en celle av interesse.
    Merk: Det er best å starte med en celle som viser sterke QD signaler.
  17. Spill en oversikt STEM bilde av denne cellen.
  18. Gå til en perifer region der cellen grensen er synlig og zoome inn for å nå 50.000X forstørrelse.
  19. Ta bilder som viser individuelle QDS, bruke pikseloppholdstider på 20-30 usek. For å unngå stråleskade, bildet hver region bare én gang med stor forstørrelse.
    Merk: Vanligvis på dette stadiet begge, fokus og korrigering av stigmatism, trenger litt finjustering.
  20. Etter innspillingen av et tilstrekkelig antall høy forstørrelse bilder, zoom-out, og ackoret annen oversikt STEM bilde, som viser regionene bare tatt opp med høy forstørrelse som mørke rektangler.
    Merk: Disse oversiktsbilder vil senere tjene til å korrelere ESEM og fluorescens bilder og for å fastslå den nøyaktige plasseringen av de høye forstørrelse bildene innenfor den cellulære sammenheng.
  21. Fortsett til neste celle av interesse, starter med et oversiktsbilde, spille inn en serie med høy forstørrelse bilder og avslutte med et oversiktsbilde.
  22. Ved slutten av en ESEM avbildningssesjon, øke trykket til 850-900 Pa før man begynner å ventilere kammeret.
    Merk: Denne økningen av trykket øker sjansen for å utvinne mikrochip med en fortsatt fuktet overflate; men dette kan ikke alltid oppnås. En prøve som aldri har blitt tørket ut kan gjenopprettes i BSA-PBS og, hvis ønskelig, reinvestigated i ESEM på et senere tidspunkt.

Representative Results

Figur 1 og 2 viser representative bilder av QD655 merket, membran-bundet EGFR visualisert i intakte, fullt hydrerte COS-7-celler. DIC bildet i figur 1 et gir et inntrykk av membranen topografi av cellene, og den tilsvarende fluorescens bildet i figur 1b viser fordelingen av EGFR etter 3 min av EGF-Biotin inkubasjon. Figur 1A og B hver er sydd sammen av to bilder som er tatt med et luft objektiv 40X. EGF-aktiverte EGFR er fordelt over hele celleoverflaten. I de fleste cellene en svak forbedring av fluorescens (figur 1B) kan ses på cellekantene, noe som indikerer en lokalt øket forekomst av EGFR 20. Kontroll eksperimenter utført ved anvendelse av en lignende protokoll verifisert spesifikk EGFR merking (data ikke vist). Disse kontrollene følger med: 1) en kontrollmerking uten tidligere inkubasjon av cells med EGF-biotin, dvs. bare inkubasjon med STR-QDS, og 2) en inkubasjon med ikke-biotinylert EGF og STR-QDS.

De tre celler merket med rektangler ble videre undersøkt med ESEM-STEM. De ESEM-STEM bilder avbildet i Figur 1C - E viser lave forstørrelse oversikter over disse cellene. Disse overføringsbilder reflektere hele celler i hydratisert tilstand med et tynt lag av vann som befinner seg over cellen plassert på en silisium mikrobrikke med silisiumnitrid (SiN) visningsvinduet. Vakuumkammeret i mikroskopet inneholdt vanndamp, og balansen mellom prøvens temperatur og trykk ble regulert for å opprettholde et tynt lag av væske over cellene. De enkelte cellene kan lett gjenkjennes på grunn av sin form og plassering på SiN membranen vinduet. De med lav forstørrelse ESEM-STEM Bildene avslører gode strukturer, slik som filopodia, som strekker seg fra cellekanten mot nabocellene, og noen strukturerinne tynnere celle regioner. Tykke sentrale cellulære regioner, inkludert nucleus ser hvitt ut, fordi overføring gjennom prøven er ikke mulig for elektroner av den anvendte energi (30 keV).

Høyoppløselige ESEM-STEM bildene ble tatt opp i de tynnere, perifere regioner. Romlig oppløsning for ESEM-STEM av nanopartikler i tynne regioner av celler i en tynn væske laget ble bestemt i en tidligere studie 6 å beløpe seg til 3 nm. Fire bilder med høy oppløsning er vist i figur 2A - D ble registrert ved plasseringen av de små rektangler i figur 1C - E. Den brukte forstørrelse var tilstrekkelig til å skjelne enkelt QDS, som fremstår som lyse, kuleformede stenger, hver bundet til en individuell EGFR. Den QD655 har typiske dimensjoner på 6 x 14 nm 2.

Figur 2A (tilsvarende det rektangulære området som er angitt på cellen i Figure 1C) viser QD etiketter på en membran brett diagonalt krysset bildet. Denne membranstruktur har en høyere tetthet EGFR enn de omkringliggende membranregionene. På flere steder, to etiketter var på nærhet. To eksempler med avstander på 20 og 24 nm er angitt med pilspisser. Disse parene av etikettene blir tolket som tilhørende EGFR dimerer. Figur 2B gir et eksempel fra kanten av en celle (figur 1D, venstre rektangel), kan EGFR monomerer og dimerer sees også. Figur 2C (figur 1C, høyre rektangel) ble registrert av en region med lavere fluorescens-signal, det vil si lavere EGFR tetthet. Likevel EGFR ble også her i dimerer også. I tillegg er to grupper på 10 eller 11 EGFRs var til stede (se ellipser). Figur 2D viser et annet eksempel på en membran fold (figur 1E) med mindre grupper, inkludert 5-6 EGFRs, i tillegg til flere monomererog dimerer.

Som et eksempel på den type av informasjon som kan oppnås fra disse data, de to korrelasjonsfunksjonen 21 g (x) ble bestemt for alle etikett stillinger i figur 2. Legg merke til at denne analysen er ikke en del av denne protokollen, og fremgangsmåten ble beskrevet andre steder 6,7. g (x) er et mål på muligheten for en partikkel som befinner seg i en viss radial avstand x fra et referanse partikkel. g (x) = 1 representerer en tilfeldig fordeling, og en større verdi er bevis for clustering. Posisjonene til totalt 210 etiketter ble automatisk registrert i de fire bilder av figur 2A-D, og g (x) ble beregnet ved hjelp av en hylle størrelse på 5 nm og et utjevningsfilter med en båndbredde på 10 nm. Den g (x) kurve (figur 3) viser en foretrukket senter-til-senter avstand på QD 25 nm. EGFRs er således ikke tilfeldig orientert, men en betydelig del av dem ligger i denne foretrukne avstand. Fra en omtrentelige molekylær modell 6 (figur 3 innfelt) Vi anslår at senter-til-senter avstanden mellom QD og EGF-bindingslommen utgjør ~ 14 nm, og senter-til-senteravstanden mellom de to QDS festet til en EGFR dimer til være ~ 27 nm (denne verdien er egnet til å variere fra noen få nanometer på grunn av fleksibiliteten til linkeren). Den foretrukne etiketten avstand er således i overensstemmelse med den forventede etikett distansen for EGFR dimer innenfor nøyaktigheten av metoden. Den g (x) kurve er større enn enhet for avstand på opp til 300 nm, noe som indikerer tilstedeværelse av klynger, i samsvar med dataene. Denne analysen viser at støkiometrien av EGFR kan studeres med vår metode.

Figur 4 viser et lignende resultat som i fig 2, med unntak av at merkingen ble utført med EGF-QD800, og en 63X oljeneddyppingsobjektivet ble anvendt for fluorescensen bildet. Disse data bekrefter at disse typiske resultater er også funnet nårEGFR merking er gjort med QDS, som avgir i det nære røde spektrum. Figur 4A er fluorescensen bilde av en representativ celle, Figur 4B den samme celle i ESEM-STEM oversikt modus og 4C er et 150 000 x forstørrelse, innspilt på den øvre membrancellekant (se rektangel i figur 4B). I likhet med figur 2A, og D, bildene fange QD-merket EGFR på en membran fold og viser monomere, dimere, og gruppert reseptorer. Merk at elektronet tette QD kjerne synes noe mindre og rundere enn kjernene av QDS utslipp på 655 nm, i samsvar med sin mindre kjernestørrelse 22 av ~ 5 nm.

Figur 1
Figur 1. korrelative DIC, fluorescens og ESEM-STEM av EGF-QD655 merket EGFR på fullt hydrerte COS-7 celler Rong>. (A) DIC bilde av cellene dyrket i SiN membranen vindusområdet, noe som gir et topografisk bilde av plasmamembranen. (B) Fluorescens bilde som viser celler på sentralt SiN membran vindu (markert med stiplet rektangel). (C - E) Tre ESEM-STEM lav forstørrelse bilder fra cellene merket med rektangler i A og B. Disse oversikt celle Bildene er å fastslå den nøyaktige plasseringen av senere innspilte bilder med høy oppløsning. Plasseringen av fire bilder med høy oppløsning (vist i Figur 2A-D) er merket med hvite rektangler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
(A) Micrograph på 75,000X forstørrelse av området markert i figur 1B. Mange monomerer er synlige. Flere dimerene vises med pilspisser. (B) og (C) bilder ervervet på 50.000 som forstørrelse av venstre henholdsvis høyre, membran områder markert i figur 1C. Klynger av EGFRs er skissert. (D) bilde som er tatt med 50.000 som forstørrelse på stedet markert i figur 1D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Pair korrelasjonsfunksjonen g (x) som funksjon av den radiale avstanden X bestemt for inter-parti cle avstander på alle 210 etiketter påvist i figur 2A-D. Toppen ved 25 nm indikerer at en senter-til-senter QD avstand har en mye større sjanse for å inntreffe enn tilfeldig, hvorved ag (x) = 1 angir en tilfeldig mulighet. Den stiplede linjen er en guide for øyet som representerer g (x) av en tilfeldig fordeling. Det innfelte viser en tilnærmet molekylmodell av EGFR dimer bundet med EGF og streptavidin belagte QDS festet via biotin. Modellene av streptavidin, ble EGF og EGFR hentet fra CK modeller av 1stp (streptavidin), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO og 2GS6 (EGFR) strukturer i RCSB Protein Protein Databank, laget av pmol versjon 12.2.15. Biotin modellen er slik det er tegnet i RCSB Ligand Explorer versjon 1.0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

/53186/53186fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksempler på COS-7 celle merket med EGF-QD800 og avbildes med samsvar fluorescens og ESEM-STEM. (A) Fluorescens bilde, (b) lav oversikt forstørrelse ESEM STEM-bildet. (C) Høyoppløselig bilde som er tatt på plasseringen av rektangelet i b på 150,000X forstørrelse. Monomere, dimeriske, og gruppert EGFRs oppdages lik merking med EGF-QD655. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Studerer den romlige fordeling og støkiometri av membranproteiner, slik som EGFR, på hele celler, gir viktig kontekstinformasjon om sin funksjon og mulige endringer derav 11-14. Det er utfordrende å undersøke fordelingen av monomerer, dimerer og klynger direkte på en subcellulære nivå ved hjelp av vanlig anvendte biokjemiske metoder, for hvilken informasjon går tapt om lokaliseringen av proteinet i cellen eller forskjeller mellom cellene 15. Merke og mikroskopifremgangsmåter som er beskrevet her tillater visualisering av proteinkompleksene på en lengdeskala på noen få nanometer, slik at dets støkiometri kan studeres i sammenheng med individuelle intakte celler, 4-7. Dette er ikke mulig med (super oppløsning) lysmikroskopi 23 fordi dens oppløsning er tilstrekkelig til å skille molekyler involvert i et proteinkompleks. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er et ensemble gjennomsnittsteknikken <sup> 24, og ikke nødvendigvis gjenkjenne dimerer og høyere ordens klynger som følge av den korte rekkevidde av energioverføring 25. Nærhetsligerings-analyser 26 trenger faktisk ikke måle avstander og er således ikke i stand til å skille mellom et cellulært område med et høyt protein tetthet, uunngåelig fører til et antall oppdaget proximities tilfeldigheter, fra et cellulært område med en lignende protein tetthet, men inneholdende proteinet komplekser utviser tydelige avstander mellom etikettene. Den nødvendige høy oppløsning for å visualisere bestanddelene i proteinkomplekser blir oppnådd ved transmisjons-elektronmikroskopi (TEM). Imidlertid er konvensjonelle TEM av hele celler begrenset av kravet om tynne prøver / seksjoner igjennom plasmamembranen 27, eller plasmamembranen rippe eller brytes av 28,29 resulterer i tilfeldig dannede små biter av membranen. Plasmamembranen er således ikke avbildet som en helhet, som fører til en mangelmuligens avgjørende cellular kontekstinformasjon.

Andre eksperimentelle utfordringer for studiet av proteinet støkiometri i celler som skriver seg fra den anvendte proteinmerking. Vanligvis brukes immunolabeling bærer vanskelighetsgrad som en-til-en-støkiometri mellom reseptor og etikett kan bare oppnås med et enverdig sonde; Dette er ikke tilfelle når det primære og sekundære antistoff er nødvendig. For å oppnå informasjon om proteinet støkiometri, er det nødvendig at en probe binder unikt til en epitop på reseptoren og har ett bindingssete for en fluorescerende probe, eller et høyt atomnummer nanopartikkel på den andre siden. For det andre, er presisjonen oppnåelig med antistoff-merking begrenset på grunn av deres store størrelse 30 for å 30 nm, slik at en diskriminering mellom nabo enkle proteiner, homodimerer, eller større klynger ikke er mulig, i det minste ikke for reseptorer av EGFR familien. Mye mindre av de etikettene er kjent i litteraturen og can brukes selv for intracellulær merking 31, men de er ikke brukte. Lengden av hele etiketten (EGF-biotin-streptavidin-QD) er av samme dimensjon som den EGFR, og tilstrekkelig små til å være i stand til å detektere dimer. Dessuten unngår den beskrevne to-trinns prosedyre merking merking indusert reseptoren gruppering.

Vår metode er ikke særlig vanskelig, for ikke mye mer enn fluorescens mikroskopi av merkede proteiner. Imidlertid må et forsøk for å utføres med stor forsiktighet, siden antall trinn legger opp og en feil i en av de trinnene kan føre til en fullstendig svikt i forsøket. Håndtering av microchips er ikke mer kjedelig enn håndteringen av TEM nett, men noen opplærings tomme chips anbefales. ESEM-STEM av hele hydrerte celler er sannsynligvis det mest vanskelige aspektet, og krever i det minste en dyktig operator og flere dager med praksis for å oppnå en oppløsning på rundt 3 nm som nødvendig for å visualisere QDS. Stråling damalder av prøven under undersøkelse utgjør en risiko. Trykket og temperaturen bør være nøye overvåket for å opprettholde et vannsjikt. Videre kan tykkelsen på vannlaget varierer mellom cellene. Det er tilrådelig å overvåke nærværet av vannsjiktet ved hjelp av det gassformede elektrondetektoren over prøven, som beskrevet andre steder 6. Cellular regioner skal kun avbildet en eller to ganger for å unngå skade.

En viktig begrensning ved fremgangsmåten er at høy oppløsning informasjon om ultrastruktur er fraværende. Andre teknikker, for eksempel, kryo TEM, er nødvendig for å studere proteinstruktur, og celle ultrastructure 15. Dernest, studere den dynamiske samspillet av et multiplum av proteiner i levende celle i time-lapse mikroskop er ikke gjennomførbart på grunn av stråleskader, og krever state-of-the-art lysmikroskopi 23. For tiden, er foreliggende fremgangsmåte ikke er i stand til å bestemme den absolutte nivået av dimerer siden labeling effektivitet er ukjent, men vi regner med å legge slike data i fremtiden. Det er likevel mulig å se om dimerer er tilstede eller ikke. Fra litteraturen er det kjent at selv en merking virkningsgrad omkring 15% er nok til å detektere dimerer med tilstrekkelig statistisk signifikans 32.

Det er lett mulig å studere andre membranbundne reseptorer via sin ligand, via biotinylert Fab-fragmenter av spesifikke antistoffer, eller via andre små linkere 7 ved hjelp av den beskrevne to-trinns merking protokollen. Siden vi har allerede vist som kan brukes for to forskjellige farger (størrelser) av QDS, og gull nanopartikkel merking ble anvendt i tidligere arbeids 6, synes det mulig å merke multiple proteintype i det samme eksperiment. Hovedutfordringen for studiet av støkiometrien av flere proteinarter er å sikre en tilsvarende merkeeffekt for begge arter eller i det minste en normalisering av den oppnådde relative støkiometri på respektive merking effektivitet. Likevel, har de to forskjellige QDS brukt i denne studien ikke synes å variere mye i merking effektivitet (se figur 2 og 4). Den beskrevne metode omfatter to trinn med merking QDS, og samsvarende fluorescens mikroskopi og ESEM-STEM presenterer en levedyktig metode for å studere komplekst samspill mellom membranproteiner i de intakte plasmamembraner av hele celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted fluorescence microscope Leica AF6000 + DMI6000B
ESEM FEI Company Quanta 400 FEG
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate Gibco 31966-021
DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid Gibco 14190-144
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) Gibco 16000-036
Cellstripper Mediatech, Inc. 25-056 Cl
Water, chromasolv Plus for HPLC Sigma-Aldrich 34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBS Carl Roth 1058.1
Ethanol, Rotisolv HPLC grade Carl Roth P076.2
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) Carl Roth O163.2
Gelatin, from cold water fish skin Sigma-Aldrich G7041-500G
Glycine Carl Roth T873.1
Epidermal Growth Factor Molecular Probes E3477 Biotin-XX Conjugate (biotin EGF)
Sodium teraborate decahydrate Sigma-Aldrich S9640-500G
Boric acid Sigma-Aldrich B6768-500G
Qdot 655 streptavidin conjugate Molecular Probes Q10121MP
Qdot 800 streptavidin conjugate Molecular Probes Q10173MP
Silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm DENS Solutions Custom made

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid. ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).
  2. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).
  3. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).
  4. Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
  5. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).
  6. Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy. Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).
  7. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy. Science Advances. under revision, (2015).
  8. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).
  9. Herbst, R. S. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).
  10. Normanno, N., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366, 2-16 (2006).
  11. Hofman, E. G., et al. EGF induces coalescence of different lipid rafts. J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).
  12. Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib. J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).
  13. Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).
  14. Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding. FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).
  15. Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).
  16. Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).
  17. Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).
  18. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
  19. Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase. Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).
  20. Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464, 783-787 (2010).
  21. Stoyan, D., Stoyan, H. Estimating pair correlation functions of planar cluster processes. Biom. J. 38, 259-271 (1996).
  22. Gao, J., et al. In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots. Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).
  23. Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).
  24. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).
  25. Warren, C. M., Landgraf, R. Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control. Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).
  26. Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).
  27. Hoenger, A., McIntosh, J. R. Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).
  28. Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy. Micron. 37, 14-34 (2006).
  29. Pinto da Silva, P., Kan, F. W. Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces. J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).
  30. Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments. Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).
  31. Orlov, I., et al. Live cell immunogold labelling of RNA polymerase. II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).
  32. Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy. Front. Immunol. 4, 427 (2013).

Tags

Bioteknologi quantum dot bestemt protein etiketten fluorescens mikroskopi miljø scanning elektronmikroskopi ESEM skanning transmisjonselektronmikroskopi STEM
Studerer Støkiometrien av epidermal vekstfaktor reseptor i intakte celler bruker korrelative Mikros
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying … More

Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. J. Vis. Exp. (103), e53186, doi:10.3791/53186 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter