Abstract
Detta protokoll beskriver märkning av epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) på COS7 fibroblastceller, och efterföljande korrelativ fluorescensmikroskopi och svepelektronmikroskop (ESEM) på hela celler i hydratiserat tillstånd. Fluorescerande kvantprickar (QDs) kopplades till EGFR via ett två-stegs märkningsprotokoll, som ger en effektiv och specifik proteinmärkning, samtidigt som man undviker etikett-inducerad klusterbildning av receptorn. Fluorescensmikroskopi uppgivet bilder av cellulära platser av EGFR. Avsöknings transmissionselektronmikroskopi (STEM) detektor användes för att detektera de QD etiketter med nanoskala upplösning. De resulterande korrelat bilder ger uppgifter om cellulära EGFR distribution och stökiometrin vid den enda molekylär nivå i naturskön miljö av den hydratiserade intakt cell. ESEM-STEM bilder visade receptorn att vara närvarande som monomer, som homodimer, och i små kluster. Märkning med två olika QDs,dvs en som emitterar vid 655 nm och vid 800 visade liknande karakteristiska resultat.
Introduction
En ny strategi infördes nyligen, att bilden hela celler med märkta proteiner i flytande tillstånd med hjälp av STEM 1-3, eller korrelat fluorescensmikroskopi och STEM 4-7. Denna metod är i stånd att studera den geografiska fördelningen av membranproteiner och proteinkomplex inklusive deras stökiometri på enda molekyl nivå i intakta plasmamembran av hela celler. Här beskriver vi ett protokoll som innebär en tvåstegs särskild märkning av receptorproteiner med fluorescerande kvantprickar (QDs) 8, och korrelat ljusmikroskopi och ESEM-STEM. Som exempel studerade vi EGFR, ett membranprotein som tillhör proteinkinassuperfamiljen. Vid ligandbindning, aktiverar receptorn och sedan bildar en dimer med en annan aktiverad EGFR; den efterföljande signalkaskad driver cellproliferation 9. Mutationer som leder till onormalt EGFR-uttryck eller aktivitet spelar en central roll i många typer av cancer 10. Studying den rumsliga arrangemang av denna membranreceptor i hela celler ger viktig sammanhang information om dess funktion och eventuella ändringar av dessa 11-14. Men det är fortfarande svårt att sondera fördelningen av EGFR-monomerer, dimerer, och kluster direkt på en (sub) cellulär nivå med biochemical- eller konventionella mikroskopi metoder 15. Vår metod är kapabel att visualisera EGFR: er med en spatial upplösning på några få nanometer sådana att deras placering proteiner i ett komplex kan bestämmas. Viktigast, den inhämtade informationen om den stökiometriska fördelningen avser inhemska situationen av proteinet i den intakta cellen.
För att uppnå en kort sträcka mellan etiketten och receptorn, var EGFR direkt märkt genom dess ligand EGF, med användning av en biotin-streptavidin-bindning till en QD. Denna etikett kan detekteras både med fluorescence- och elektronmikroskopi. Vi har använt denna etikett för korrelat avbildning av COS7-celler ivätska innesluten i en mikroflödessystem kammare tidigare 1,16,17. Men på grund av en multipel av streptavidin molekyler per QD, kan denna etikett inducera receptorklusterbildning, vilket leder till en låg effektivitet märkningen eller snarare dyra experiment, och det är inte möjligt att dra slutsatser om stökiometrin av proteinet under utredning. Etikett inducerad receptorklusterbildning kan undvikas helt och hållet genom att använda tvåstegsförfarande märkning presenteras här, vilket resulterar i en sond innefattande biotinylerad EGF till vilka endast en streptavidin-quantum dot (STR-QD) är kopplad. Cellerna inkuberas först med biotinylerad EGF, och sedan fixeras. Fixeringssteget avgör tidspunkten vid vilken protein processer stoppas (beroende på hastigheten av fixering). STR-QD tillämpas därefter som andra steget av märkningen protokollet. Kluster sker inte, eftersom dynamiska membranet rörelse av proteinerna är hindrad när proteinerna är fasta. Vidare STR-QD-lösning, som är dendyraste komponenten av experimentet, kan appliceras på ett optimerat låg koncentration, och detta andra steg med märkningen är inte tids avgörande, dvs kan QD kopplas i flera minuter.
För att studera stökiometrin av EGFR som distribueras i hela celler, cellprover var beredda på kiselmikrochips 18. Efter applicering av två steg QD märkning och registrering av fluorescensmikroskopi bilder, sköljdes cellerna med rent vatten, och avbildas i hydratiserat tillstånd med hjälp av ESEM-STEM 19. De resulterande korrelat bilder ger information om den cellulära EGFR distribution och stökiometrin i deras naturliga sammanhang hydratiserade celler. En liknande metod användes för att studera HER2 proteiner i bröstcancerceller i en nyligen genomförd studie 7.
Protocol
1. Framställning av märkning och Fixering reagenser
- Förbered buffert etikettering (BSA-GEL-PBS) med användning av autoklaverad fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 (PBS). Komplettera med 1% BSA (bovint albumin fraktion V, biotin fritt) och 0,2% gelatin (GEL, från kallt vatten fiskskinn) och skaka / skaka väl.
Obs: Kan förvaras ~ 5 dagar vid 4 ° C. - Förbered tvättbuffert (BSA-PBS) från autoklaverat fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4. Komplettera med 1% BSA och virvel / skaka väl. Obs: Kan förvaras ~ 5 dagar vid 4 ° C.
- Förbered 50 mM boratbuffert (BB) från 200 mM borsyra stamlösning, pH justerades till 8,3 med 200 mM natriumtetraborat. Obs: Kan förvaras ~ 12 månader vid 4 ° C.
- Bered 0,1 M kakodylatbuffert (CB) från 0,2 M natriumkakodylat förrådslösning, pH justerades till 7,4, kompletterad med 0,1 M sackaros.
Obs: öppnad förrådslösningen kan lagras under ~ 5 dagar vid 4 ° C. - Bered 0,1 M glycin i PBS (GLY-PBS).
Obs: Kan förvaras ~ 2 månader vid 4 ° C. - Förbered 3% paraformaldehyd i CB (3% PFA) från nyligen gjorda eller öppnas flaska med 16% PFA, förrådslösning, EM klass.
Obs: öppnad förrådslösningen kan lagras under ~ 5 dagar vid 4 ° C. - Förbered 2% glutaraldehyd i CB (2% GA) från nyligen gjort (eller öppnas injektionsflaska) 25% GA stamlösning, EM klass.
Obs: öppnad förrådslösningen kan lagras under ~ 5 dagar vid 4 ° C. - Bered 300 nM EGF-biotinmärkning lösning
- Späd 6 iM EGF-biotin stamlösning i BSA-GEL-PBS, använd en volym på 100-200 il per mikrochip. Använd inom ett par timmar.
- Förbered 10 nM STR-QD märkning lösning
- Centrifugera streptavidin-QD stamlösning för 4 min vid 8000 xg, ta supernatanten och späd 1:10 i BB. Olika typer av QDs kan användas, till exempel, QD655 eller QD800. Späd till slutlig koncentration i BSA-GEL-PBS, använd 75-100 pl per mikrochip. Använd inomnågra timmar.
2. Framställning av kiselnitrid Membranmikrochips
- Rengör ett mikroskopobjektglas, som används för Ijusmikroskopi, med ett rent rum vävnad och högupplösande vätskekromatografi (HPLC) betyg etanol.
- I ett laminärt luftflöde arbetsbänk med en låg dammnivå, öppna en 100 mm diameter petriskål, och lägga den rengjorda mikroskop glas i skålen; lämna skålen öppen.
- Med rena pincett, företrädesvis belagda med kolfiber eller annan beläggning, ta 4-10 mikrochips med tunna (50 nm) kiselnitrid membran, den ena efter den andra, ur deras förvaringsbox och på objektglas. Ta mikrochips försiktigt vid sina sidor och undvika att vidröra den bräckliga övre sidan, som består av det tunna kiselnitrid-membran. Var mycket noga med att alltid hålla membranet uppåt och inte röra det.
Obs! Mikrochips ska vara rektangulär och har platta kanter vinkelrätt mot deras kiselnitrid omfattasansikte, så att de kan gripas lätt. - Stäng locket på petriskålen och föra den till ett dragskåp. Skaffa en ny renrum vävnad och placera det bredvid petriskål. Bered två rena 200 ml glasbägare genom att fylla en med 50-70 ml aceton, och den andra med en liknande volym etanol, båda av HPLC-kvalitet. Överför mikrochips från glasskivan först på renrumsvävnaden.
- Från vävnaden, överföra mikrochips en efter en in i den första bägaren med aceton för att avlägsna det skyddande resistskiktet. Vänta 2 min, under försiktigt flytta bägaren ett fåtal gånger för att säkerställa att mikrochips är väl sköljda.
- Överför mikrochips direkt i bägaren med etanol, utan att låta dem torka ut. Vänta 2 min. Sedan överföra bägaren till laminärt luftflöde arbetsbänken. Skaffa en ny renrum vävnad.
- Överför marker på vävnaden och låt dem torka i några minuter. Överför mikrochips på glasskiva i petriskålen, stäng skålen,och föra den till plasma renare.
- Deponera glasskiva med mikrochips in i plasma-renare. Kör ett 5 min rengöringsprogram för att göra ytan av kiselnitriden membranet hydrofil.
Obs: Lämpliga inställningar ansökt om vår plasma renare är: 70 mTorr, gasflödet av 11,5 sccm för O 2 och 35,0 sccm för Ar, 50 W framåt radiofrekvens (RF) mål, 5 W RF-området och max. reflekterade RF. - Placera glasskiva med mikrochip tillbaka in i petriskålen och stäng locket. Var noga med att hålla mikrochips sterilt från och med nu.
- Undersök fönster områden av mikrochips under ett ljusmikroskop för eventuella membran spricker eller återstående smutspartiklar.
- Ta med petriskål till laminärt luftflöde arbetsbänken.
- Placera följande i laminärt luftflöde bänken: rör / flaskor som innehåller steriliserad 0,01% poly-L-lysin lösning (. PLL, molekylvikt 150,000-300,000, sterilfiltrerades, och cellodling testade), HPLCkvalitet vatten, Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum, DMEM utan serum, en ny renrum vävnad, en steril 24-brunnsplatta (en 12-brunnars platta kan också användas), en steril 96- brunnar, sterila pipettspetsar, en pipett, och platt, rundad spets, pincett.
- Ta 24-brunnar, och fylla en brunn med PLL, och två brunnar med HPLC-kvalitet vatten, använd en ca.. volym av 1 ml per brunn. Ta 96-brunnar och fyll i varje mikrochip två brunnar med serum kompletterat DMEM och en brunn med serumfritt DMEM, använda en ca. volym av 200 | il per brunn.
- Från och med nu använder pincett med sterila tips för att hantera mikrochips. Uppnå detta exempelvis genom att kort flammande och därefter kylning av tips av pincetten.
- Först överföra mikrochips från glasskiva på renrumsvävnaden.
Från vävnaden, överföra upp till sex mikrochip i PLL fyllda väl, inkubera mikrochips under 5 min.
Intee: För ett experiment med flera mikrochips, fyll ytterligare brunnar i 24-brunnar. - Därefter skölj mikrochips genom att placera dem, en-för-en, in i den första vattenfylld väl, och därifrån in i den andra vattenfyllda väl. Låt inte mikrochips i vattnet längre än ungefär en minut för att undvika borttagning av PLL.
- Slutligen placera dem individuellt i DMEM-fyllda brunnar i 96-brunnar. Förvara 96-brunnar i CO-2-inkubator tills cellsuspension framställes.
3. Beredning av celler på Microchips
- Utför en subkultur av COS7-celler för att framställa en cellsuspension med en koncentration av ca.. 5 × 10 5 celler / ml. Se till att cellerna är mono-spridda.
- Ta 96-brunnar med mikrochips och tillsätt en liten droppe av cellsuspensionen till varje mikrochip. Vänta 5 min.
- Börja med att undersöka fönsterpartier av mikrochips med ett inverterat mikroskop för att choose rätt ögonblick för att överföra den till en ny brunn med serumfritt DMEM.
Obs: En god täthet av celler uppnås med cirka en cell per 2500 pm 2 område, vilket motsvarar 24 COS7 celler på en fönsterstorlek på 150 x 400 pm. Högre celldensiteter har risken att hindra maximal plattning av cellerna. Var medveten om att efter en cell har lugnat ner sig på SIN membranet, behöver den 3-5 minuter att utveckla tillräckligt vidhäftning till motstå flytande av under överföring till den nya brunnen. - Överför mikrochip till nästa brunn när tillräckligt många celler har vidhäftat på fönstret. Håll mikrochips alltid med cellerna uppåt och undvika beröring av denna sida.
- Efter överföringen, undersöka varje mikrochip fönstret igen. Om alltför många celler tvättades bort och antalet återstående cellerna är otillräcklig, åter finfördela cellsuspensionen (för att bryta upp nybildade cellklumpar) och upprepar steg 3,1-3,5.
- När alla överförda mikrochips har tillräckligtvidhäftande celler på sina fönsterytor, överför flisen in i den sista bra med serumfritt DMEM. Placera 96-brunnar tillbaka in i CO 2 inkubator och låta cellerna återhämta sig och platta ut för flera h, bäst O / N.
4. EGFR märkning, Fixering, och fluorescensmikroskopi
- För de följande stegen, använda en 96-brunn och en 24-brunnsplatta. Pre-fylla brunnarna med respektive lösningar, och använda en rad eller kolumn per mikrochip. Den 24-brunnar används under dragskåp för fixerings steg med CB, PFA och GA. Överföra alltid mikrochips med cellerna vända upp och undvika beröring av denna sida.
- Skölj mikrochips genom att placera mikrochips i en brunn med färskt BSA-GEL-PBS, sedan placera 96 brunnars platta i inkubator vid 37 ° C under 5 minuter.
- Inkubera med 300 nM EGF-biotin-lösning under 3 min vid 37 ° C. Eftersom cellerna börjar endocytos av EGF-märkta EGFR: er, fortsätt så snabbt som möjligt för att stes 4,4.
- Skölj 3 gånger med PBS och en gång med CB (nu 96 brunnar är återigen vid RT).
- Inkubera i 3% PFA i 10 minuter.
- Skölj marker en tid med CB, och 3 gånger med PBS.
- Inkubera i GLY-PBS under 2 minuter, skölj 2 gånger med en tid PBS.
- Inkubera i 10 nM STR-QD under 10 minuter.
- Skölj 4 gånger med BSA-PBS.
- Sänk ett mikrochip i ett glas-botten 35 mm skål förfylld med BSA-PBS vid RT.
- Förvärva differential interferens kontrast (DIC) bilder och fluorescens bilder av QD-märkta celler.
- Använd en 40X luft mål för översiktsbilder av celler märkta med QD655. Använd en oljeimmersionsobjektiv (till exempel 63X) för att möjliggöra den mest effektiva samlingen av det emitterade fluorescensljus; Detta är särskilt viktigt när avbildning celler märkta med QD800.
- Använda ett filter kub som exponerar QDs till fluorescensexcitation ljus mellan 340 och 380 nm, och tillåter insamlingen av emitterat ljus ovanför 420 nm suibord för de flesta QDs (Filter kub A i det här fallet).
- Minimera ljusintensiteten för att undvika alltför intensivt ljus som kan skada provet. Ställ in exponeringstiden till minst 300 ms, så att signalerna från alla QDs fångas, notera att fluorescens QDs har en blinkande beteende.
- Justera ljusintensiteten, och amplifiering för att åstadkomma ljusa bilder utan synlig bildbrus, under minimering av ljusintensitet.
Anmärkning: Alternativt kan kortare exponeringstid användas om bild serie tas från samma region. Dessa serier kan bearbetas för att ge en maximal projektionsbild, vilket leder till medelvärdes och därmed brusreducering av den resulterande bilden.
- Placera den avbildade mikrochip tillbaka (celler uppåt) i en brunn på en 96-brunnar fyllda med BSA-PBS.
- Skölj mikrochips 1 gånger i CB.
- Inkubera i 2% GA under 10 min.
- Skölj en gång i CB, och 3 gånger med BSA-PBS.
- Store mikrochips fram ESEM jagmaging, i BSA-PBS förfylld brunnar av en ny 96-brunnsplatta. För varje mikrochip fylla en rad med fyra brunnar med HPLC-kvalitet vatten.
Obs: Proverna kan förvaras vid 4 ° C under flera veckor, men de bästa resultaten uppnås när den färdiga avbildnings serien utförs inom två dagar. QDs kommer sakta börjar lossna från provet, det rekommenderas därför inte att vänta mer än 10 dagar innan ESEM avbildning sker.
Obs: Fluorescens bilder lagras för framtida analys. Positionerna för cellerna i bilderna kan lätt korreleras med elektronmikroskopbilder via lokalisera hörnen på SiN fönster och mäta positioner i förhållande till hörnen.
Obs: Det är lämpligt att skriva ut fluorescens bilder av hög kvalitet och använda dem för orienteringsändamål vid inspelning ESEM bilderna.
5. Wet ESEM-STEM av hela celler
- Förbered ESEM våt STEM
- Montera gasformiga sekundära elektron detector (GSED) och Peltier skede, som innehåller den STEM detektorn (placerad under provet).
- Starta flödet av kylvatten genom scenen, och ställ in temperaturen till 3 ° C.
- Ställ scenen xy-koordinater till noll, och justera arbetsavståndet till cirka 6 mm.
- Under ESEM bildbehandling, hålla 96-brunnar med mikrochips svalna, till exempel på frusna kylelement i en frigolitlåda.
- För att ladda ett prov i förkyld ESEM-STEM skede ta 96-brunnar ur kylnings behållaren och placera den nära den öppnade ESEM scenen. Sätt ett nytt renrum vävnad bredvid det.
- Snabbt skölja ett mikrochip (med cellerna uppåt) genom att doppa det fyra gånger, varje gång i ungefär en sekund, i en välfylld med HPLC-kvalitet vatten.
- Blot baksidan av mikrochip kort på renrums vävnad och placera mikrochip i förkylda scenen. Se till att cellerna förblir våt, kan detta varaerkänts av en reflekterande yta (torka resulterar i en matt yta).
- Blöt provytan med 3 il kyld HPLC-kvalitet vatten (se till att inte röra vid ytan med pipettspetsen), och fixera provet i scenen.
- Placera tre ytterligare 3 il vattendroppar på scenen nära till provet.
- Stäng provkammare
- Rensa provet kammaren genom att cykla trycket fem gånger mellan 800 och 1500 Pa. Avsluta cykling med 800 Pa.
- Slå elektronstrålen (30 kV) på och undersöka provet under lägsta förstoringen med båda detektorerna, dvs den GSED, och STEM detektor för att söka efter placeringen av mikrochip fönstret.
Obs: Om vattenskiktet är för tjockt kan fönstret inte syns. I det här fallet, börja sänka trycket till 760 Pa och vänta ett par minuter. Fönstret först blir synlig med GSED. - Placera SiN membran fönstret i mitten av bilden genom att flytta specimsv scenen och reducera trycket till 750-720 Pa.
Anmärkning: När vattenskiktet är tillräckligt tunn, blir fönstret också synlig med STEM-detektor. - Från och med nu använda mörkfälts segment av STEM detektor för att spela in bilder. Först förvärvar en eller två bilder som visar alla celler på hela fönsterytan.
- Jämför dessa ESEM bilder med ljusmikroskopiska bilder, lokalisera hörn av SiN fönster.
- Korrelera koordinatramar både mikroskopi formerna genom att jämföra förstoring, rotation och eventuellt spegling. Leta samma celler i båda bilderna.
- Välj mycket små smutspartiklar eller en cell region med små funktioner för att justera bildbehandlingsinställningar, såsom eucentric höjd, den fina fokus och korrigering av lins stigmatism. Arbetet med en förstoring på minst 50.000X, använder en elektronsondström omkring 0,6 nA, en pixel-uppehållstid på 30 ps, och en bildstorlek på 1024 x 884 pixlar.
Obs: Andra inställningar kan också be användas så länge som en ökning av elektrondosen undviks.
Obs: Även när du arbetar mycket ren, kommer spånytor i praktiken alltid innehålla några smutspartiklar, eftersom protokollet inte genomförs i en renrumsmiljö. - Om du vill spela STEM bilder från QD-märkta celler, se fluorescens bilder och välj en cell av intresse.
Obs: Det är bäst att börja med en cell som visar starka QD signaler. - Spela in ett STEM översiktsbilden av denna cell.
- Gå till en perifer region där cellen gränsen är synlig och zooma in för att nå 50.000X förstoring.
- Spela in bilder som visar enskilda QDs, använder pixeluppehållstider av 20-30 ps. För att undvika strålningsskador, avbilda varje region endast en gång med hög förstoring.
Obs: Vanligtvis i detta skede både fokus och korrigering av stigmatism, behöver finjustering. - Efter inspelningen av ett tillräckligt antal med hög förstoring bilder, zooma ut, och acquire annan STEM översiktsbilden, skildrar regioner just spelats in med hög förstoring som mörka rektanglar.
Obs: Dessa översiktsbilder kommer senare användas för att korrelera ESEM och fluorescens bilder och för att bestämma den exakta placeringen av de höga förstoring bilder i det cellulära sammanhanget. - Fortsätt till nästa cell av intresse, börja med en översiktsbilden, spela in en serie med hög förstoring bilder, och avslutas med en översiktsbilden.
- I slutet av en ESEM bildsession, öka trycket till 850-900 Pa innan att ventilera kammaren.
Obs: Denna ökning av trycket ökar chansen att återvinna mikrochip med ännu våta ytan; men detta kan inte alltid uppnås. Ett prov som aldrig har torkats kan återupprättas i BSA-PBS och, om så önskas, en förnyad undersökning vid ESEM vid en senare tidpunkt.
Representative Results
Figur 1 och 2 visar representativa bilder av QD655 märkt, membranbundet EGFR visualiseras i intakta, helt hydratiserade COS-7-celler. DIC bilden i fig 1 en ger ett intryck av membran topografi av cellerna, och den motsvarande fluorescensbild i figur 1b visar fördelningen av EGFR efter tre min av EGF-biotin inkubering. Figur 1A och B är vardera sys samman från två bilder som spelats in med en 40X luft mål. Fonden aktiverade EGFR fördelas över hela cellytan. I de flesta celler en lätt ökning av fluorescens (Figur 1B) kan ses vid cellkanterna, vilket indikerar en lokalt ökad förekomst av EGFR 20. Kontrollexperiment utförda med användning av ett liknande protokoll verifierat specifika EGFR märkning (data ej visade). Dessa kontroller som medföljer: 1) en kontrollmärkning utan föregående inkubation av cells med EGF-biotin, dvs endast inkubation med STR-QDs och 2) en inkubering med icke-biotinylerad EGF och STR-QDs.
De tre rutor markerade med rektanglar var ytterligare undersöktes med ESEM-STEM. ESEM-STEM bilder som visas i figur 1C - E visar låg förstoring översikter av dessa celler. Dessa överförings bilder speglar hela celler i hydratiserat tillstånd med ett tunt lager av vatten som är bosatta över cellen placeras på en kisel mikrochip med kiselnitrid (SiN) fönstret. Vakuumkammaren i mikroskopet innehöll vattenånga, och balansen mellan provtemperatur och tryck inställdes för att upprätthålla ett tunt skikt av vätska över cellerna. De enskilda cellerna kan lätt kännas igen på grund av sin form och placering på SiN membranfönstret. De låg förstoring ESEM-STEM bilder avslöjar fina strukturer, såsom filopodia, som sträcker sig från cellkanten mot angränsande celler, och vissa strukturerinuti de tunnare cellregionerna. Tjocka centrala cellulära regioner, däribland kärnan verkar vita eftersom överföringen genom provet är inte möjligt för elektroner av den använda energin (30 keV).
Högupplösta ESEM-STEM bilderna sparas i de tunnare, randområden. Den rumsliga upplösningen för ESEM-STEM av nanopartiklar i de tunna regioner av celler i ett tunt vätskeskikt bestämdes i en tidigare studie sex uppgå till 3 nm. Fyra högupplösta bilder som visas i figur 2A - D registrerades vid de platser där de små rektanglar i figur 1C - E. Den använda förstoringen var tillräcklig för att urskilja enskilda QDs, utgivna som ljusa, skottformade stavar, vardera bundna till en enskild EGFR. Den QD655 har typiska dimensionerna 6 x 14 nm 2.
Figur 2A (motsvarande det rektangulära området som anges på cellen i Figure 1C) visar QD etiketter på ett membran viker diagonalt korsar bilden. Denna membranstruktur har en högre EGFR densitet än omgivande membran regionerna. På flera platser, två etiketter var på nära håll. Två exempel med avstånden 20 och 24 nm indikeras med pilar. Dessa par av etiketter tolkas som tillhör EGFR dimerer. Figur 2B ger ett exempel från kanten av en cell (Figur 1D, vänster rektangel), kan EGFR monomerer och dimerer ses också. Figur 2C (Figur 1C, höger rektangel) spelades in av en region med en lägre fluorescenssignal, dvs lägre EGFR densitet. Ändå EGFR konstaterades också här i dimerer också. Dessutom finns två kluster av 10 eller 11 EGFR: er var närvarande (se ellipser). Figur 2D visar ett annat exempel på en membran gånger (figur 1E) med mindre kluster inklusive 5-6 EGFR: er, förutom flera monomereroch dimerer.
Som ett exempel på den typ av information som kan erhållas från dessa data, paret korrelationsfunktionen 21 g (x) bestämdes för alla etikett positioner i Figur 2. Observera att denna analys är inte en del av detta protokoll och förfarandet beskrevs annorstädes 6,7. g (x) är ett mått på risken för en partikel som finns inom ett visst radiellt avstånd x från en referenspartikel. g (x) = 1 representerar en slumpmässig fördelning, och ett större värde är bevis för klustring. Positionerna för totalt 210 etiketter har automatiskt detekteras i de fyra bilder av fig 2A-D, och g (x) beräknades med användning av en lagerstorlek av 5 nm och en utjämningsfilter med en bandbredd på 10 nm. Den g (x) kurva (figur 3) visar en föredragen centrum-till-centrum QD avstånd av 25 nm. EGFR: er är således inte slumpmässigt orienterade men en betydande del av dem bor på denna föredragna avstånd. Från en approximate molekylär modell 6 (Figur 3 infälld) uppskattar vi att centrum till centrum avståndet mellan QD och EGF bindningsfickan uppgår till ~ 14 nm, och centrum till centrum avståndet mellan de två QDs knutna till en EGFR dimer till vara ~ 27 nm (detta värde kan variera från några få nanometer på grund av flexibiliteten hos länk). Den föredragna etikett avstånd överensstämmer således med den förväntade etikettavstånd för EGFR dimer inom precision av metoden. Den g (x) kurva är större än ett för avstånd på upp till 300 nm, vilket indikerar närvaron av kluster, i överensstämmelse med data. Denna analys visar att stökiometrin för EGFR kan studeras med vår metod.
Figur 4 visar ett liknande resultat som i figur 2, med undantag av att märkningen utfördes med EGF-QD800, och en 63x oljeimmersion objektiv användes för fluorescensbild. Dessa data bekräftar att dessa typiska resultat finns också närEGFR märkningen har utförts med QDs, som emitterar inom en snar röda spektrumet. Figur 4A är fluorescensbild av en representativ cell, visar figur 4B samma cell i ESEM-STEM översiktsläget och figur 4C är en 150.000 x förstoring bild, inspelad vid det övre membranet kanten av cellen (se rektangel i figur 4B). Liknande fig 2A och D, bilderna fånga QD-märkt EGFR på ett membran vikning och visar monomera, dimera, och klustrade receptorer. Observera att elektronen tät QD kärna verkar något mindre och rundare än kärnorna hos QDs emitterar vid 655 nm, i linje med deras mindre kärnstorlek 22 av ~ 5 nm.
Figur 1. Korrelat DIC, fluorescens och ESEM-STEM av EGF-QD655 märkt EGFR på fullt hydratiserade COS-7-celler Rong>. (A) DIC bild av cellerna odlas på SiN membranfönsterområdet, vilket ger en topografisk bild av plasmamembranet. (B) Fluorescens bild som visar celler på den centralt belägna SiN membran fönster (markerad med den streckade rektangeln). (C - E) Tre ESEM-STEM låg förstoring bilder från rutor markerade med rektanglar i A och B. Dessa cellöversiktsbilder tjänar till att fastställa den exakta platsen för senare inspelade högupplösta bilder. Placeringen av fyra högupplösta bilder (som visas i figur 2A-D) är märkta med vita rektanglar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Par korrelationsfunktionen g (x) som en funktion av det radiella avståndet x bestämd för inter parti kel avstånd alla 210 etiketter som upptäckts i figur 2A-D. Toppen vid 25 nm visar att ett centrum till centrum QD avstånd har en mycket större chans att inträffa än slumpmässigt, varvid ag (x) = 1 indikerar en slumpen. Den streckade linjen är en guide för ögat representerar g (x) av en slumpmässig fördelning. Den infällda bilden visar en ungefärlig molekylmodell av EGFR dimer med bundet EGF och streptavidinbelagda QDs anslutna via biotin. Modellerna för streptavidin, var EGF och EGFR erhålls från CPK modeller av 1stp (streptavidin), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO och 2GS6 (EGFR) strukturer i RCSB Protein Protein Databank, skapad av Jmol Version 12.2.15. Biotin modellen är som dras i RCSB Ligand Explorer Version 1.0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/53186/53186fig4.jpg "/>
Figur 4. Exempel på COS-7-cell märkt med EGF-QD800 och avbildas med korrelativ fluorescens och ESEM-STEM. (A) Fluorescens bild, (B) låg förstoring översikt ESEM-STEM bild. (C) Högupplöst bild som spelats in i läget för rektangeln ib på 150,000X förstoring. Monomera, dimera och klustrade EGFR: er detekteras liknande märkning med EGF-QD655. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Studera den geografiska fördelningen och stökiometri av membranproteiner, såsom EGFR, i hela celler ger viktig sammanhang information om dess funktion och eventuella ändringar av dessa 11-14. Det är en utmaning att studera fördelningen av monomerer, dimerer, och kluster direkt på en subcellulär nivå med hjälp av allmänt använda biokemiska metoder, för vilka information går förlorad om lokaliseringen av proteinet i cellen eller skillnader mellan celler 15. Märknings och mikroskopi metoder som beskrivs här tillåter visualisering av proteinkomplex på en längdskala av ett fåtal nanometer så att dess stökiometri kan studeras inom ramen för enskilda, intakta celler 4-7. Detta är inte möjligt med (superupplösning) ljusmikroskopi 23 grund av att upplösningen är otillräcklig för att särskilja molekyler som deltar i ett proteinkomplex. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) är en ensemble medelvärdesteknik <sup> 24, och inte nödvändigtvis detektera dimerer och högre kluster order som en konsekvens av den korta räckvidden för energiöverförings 25. Proximity ligeringsprodukterna analyser 26 egentligen inte mäta avstånd och är därför inte i stånd att skilja mellan en cellulär region med en hög proteinhalt densitet, vilket oundvikligen leder till ett antal upptäckta proximities av slumpen, från en cellulär region med en liknande proteindensitet men innehåller protein komplex som uppvisar distinkta avstånd mellan etiketterna. Den erforderliga hög upplösning för att visualisera beståndsdelarna i proteinkomplex uppnås med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM). Emellertid är konventionella TEM av helceller begränsas av kravet av tunna prover / sektioner skära genom plasmamembranet 27, eller plasmamembranet krusning eller bryts loss 28,29 vilket resulterar i slumpvis formade små bitar av membranet. Plasmamembranet är således inte avbildas som en helhet, vilket leder till en bristav eventuellt avgörande cellulära kontextinformation.
Andra experimentella utmaningar för studier av protein stökiometri i celler härrör från den applicerade proteinmärkning. Vanligen används immunomärkning bär svårigheten att en-till-en stökiometri mellan receptor och etikett endast kan uppnås med en monovalent sond; detta är inte fallet när primära och sekundära antikroppar krävs. För att erhålla information om protein stökiometrin, krävs det att en sond binder unikt till en epitop på receptorn och har ett bindningsställe för en fluorescerande sond eller ett högt atomnummer nanoparticle på den andra sidan. För det andra är precision uppnås med antikroppsmärkning begränsas på grund av sin storlek 30-30 nm, så att en diskriminering mellan angränsande enstaka proteiner, homodimerer eller större kluster inte är möjligt, åtminstone inte för receptorer av EGFR familjen. Mycket mindre specifika etiketter är kända i litteraturen och can tillämpas även för intracellulär märkning 31 men de är inte vanligt förekommande. Längden på hela etiketten (EGF-biotin-streptavidin-QD) är av liknande dimensioner som EGFR, och tillräckligt liten för att kunna detektera dimeren. Dessutom undviker det beskrivna tvåstegsförfarande märkning märkning inducerad receptorklusterbildning.
Vår metod är inte särskilt svårt, inte mycket mer än fluorescensmikroskopi av märkta proteiner. Dock måste ett experiment som skall utföras med stor omsorg, eftersom antalet steg lägger upp och ett fel i ett av stegen kan leda till ett totalt misslyckande i experimentet. Hantering av mikrochips är inte mer tråkiga än hanteringen av TEM galler men vissa utbildnings tomma chips rekommenderas. ESEM-STEM av hela hydratiserade celler är förmodligen den svåraste aspekten, och kräver minst en skicklig aktör och flera dagars praktik i syfte att nå en lösning kring 3 nm som behövs för att visualisera QDs. Dammen Strålningålder exemplaret under utredningen utgör en risk. Trycket och temperaturen bör noggrant såg att upprätthålla ett vattenskikt. Vidare kan tjockleken av vattenskiktet variera mellan celler. Det är tillrådligt att övervaka förekomsten av vattenskiktet med hjälp av gasformiga elektrondetektor ovanför provet, som beskrivs på annat håll 6. Cellulära regioner bör endast avbildas en eller två gånger för att undvika skador.
En viktig begränsning med denna metod är att med hög upplösning information om ultrastrukturen är frånvarande. Andra tekniker, till exempel, kryo TEM, behövs för att studera proteinstruktur, och den cellulära ultrastrukturen 15. För det andra studerade det dynamiska samspelet av en multipel av proteiner i levande cell i tidsförlopp mikroskop inte är möjligt på grund av strålningsskador, och kräver toppmoderna Ijusmikroskopi 23. För närvarande inte i stånd att bestämma den absoluta nivån av dimerer sedan l vår metodabeling effektivitet är okänd men vi räknar med att lägga till sådana uppgifter i framtiden. Det är icke desto mindre möjligt att avgöra om dimerer är närvarande eller inte. Från litteraturen är det känt att även en märkning cirka 15% är tillräckligt för att upptäcka dimerer med tillräcklig statistisk signifikans 32.
Det är lätt möjligt att studera andra membranbundna receptorer via deras ligand, via biotinylerade Fab-fragment av specifika antikroppar, eller genom andra små linkers 7 med hjälp av den beskrivna två-steg märkningsprotokoll. Eftersom vi redan har visat att två olika färger (storlekar) för QDs kan användas, och guldnanopartiklar märkning användes i tidigare arbete 6, verkar det möjligt att märka multipla proteinspecies i samma experiment. Den största utmaningen för studiet av stökiometrin av flera protein arter som ger samma effektivitetsmärkning av båda arterna eller åtminstone en normalisering av den erhållna relativa stökiometrin på respektive märkningseffektivitet. Ändå behöver de två olika QDs användes i denna studie verkar inte skilja sig mycket i märkningseffektiviteten (se fig 2 och 4). Den beskrivna metoden involverar två steg märkning med QDs och korrelat fluorescensmikroskopi och ESEM-STEM presenterar en livskraftig metod för att studera det komplexa samspelet mellan membranproteiner i intakta plasmamembran av hela celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | AF6000 + DMI6000B | |
| ESEM | FEI Company | Quanta 400 FEG | |
| DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid | Gibco | 14190-144 | |
| Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) | Gibco | 16000-036 | |
| Cellstripper | Mediatech, Inc. | 25-056 Cl | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| PBS Roti-Stock 10x PBS | Carl Roth | 1058.1 | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) | Carl Roth | O163.2 | |
| Gelatin, from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041-500G | |
| Glycine | Carl Roth | T873.1 | |
| Epidermal Growth Factor | Molecular Probes | E3477 | Biotin-XX Conjugate (biotin EGF) |
| Sodium teraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | S9640-500G | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | |
| Qdot 655 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10121MP | |
| Qdot 800 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10173MP | |
| Silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | Custom made |
References
- Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid. ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).
- Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).
- Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).
- Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).
- Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy. Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).
- Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy. Science Advances. under revision, (2015).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).
- Herbst, R. S. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).
- Normanno, N., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366, 2-16 (2006).
- Hofman, E. G., et al. EGF induces coalescence of different lipid rafts. J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).
- Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib. J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).
- Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).
- Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding. FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).
- Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).
- Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).
- Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
- Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase. Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).
- Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464, 783-787 (2010).
- Stoyan, D., Stoyan, H. Estimating pair correlation functions of planar cluster processes. Biom. J. 38, 259-271 (1996).
- Gao, J., et al. In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots. Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).
- Warren, C. M., Landgraf, R. Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control. Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).
- Hoenger, A., McIntosh, J. R. Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).
- Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy. Micron. 37, 14-34 (2006).
- Pinto da Silva, P., Kan, F. W. Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces. J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).
- Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments. Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).
- Orlov, I., et al. Live cell immunogold labelling of RNA polymerase. II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).
- Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy. Front. Immunol. 4, 427 (2013).
