Abstract
التهاب الدماغ الخداج (EOP) هو المصطلح الذي يشمل نظام العصبي المركزي (CNS) التشوهات المرتبطة الولادة المبكرة. ولأفضل الأهداف مسبقا متعدية وكشف استراتيجيات علاجية جديدة لإصابات الدماغ المرتبطة الولادة المبكرة، يجب نماذج ما قبل السريرية من EOP تشمل آليات مماثلة الإصابة العالمية قبل الولادة لوحظ في البشر وإشراك عناصر متعددة من النظام الأم والجنين المشيمة،. من الناحية المثالية، ينبغي أن نماذج تنتج مجموعة مماثلة من عجز وظيفي في الحيوان ناضجة وألخص جوانب متعددة من الفيزيولوجيا المرضية. لتقليد النظامية عيوب الإنسان المشيمة نضح، underperfusion المشيمة و / أو شريوأمنيونيتيس المرتبطة التهاب الناجم عن العوامل المسببة للأمراض في أوائل الولادة قبل الأوان، وضعنا نموذجا للما قبل الولادة عابرة النظامية نقص الأكسجة نقص التروية (TSHI) جنبا إلى جنب مع lipopolysaccharide في داخل الأمنيوسي (LPS). في الحوامل الفئران سبراغ داولي، TSHI عبر الرحم انسداد الشريان سن يوم الجنينية 18 (E18) يؤدي الى خلل underperfusion المشيمة متدرج المرتبطة بزيادة الضرر CNS في الجنين. عندما يقترن حقن LPS البينية الذي يحيط بالجنين، يتم زيادة التهاب المشيمة وتفاقم الضرر CNS مع الأبيض المرتبطة المسألة، مشية والتصوير شذوذ. قبل الولادة TSHI وTSHI + LPS الشتائم قبل الولادة تلبية العديد من المعايير لنموذج EOP بما في ذلك تلخص الإهانة داخل الرحم، مما تسبب في فقدان الخلايا العصبية، الخلايا قليلة التغصن والمحاور، وفقدان subplate، وعجز وظيفي في الحيوانات البالغة التي تحاكي تلك التي لوحظت في الأطفال الذين يولدون للغاية قبل الأوان. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج يسمح للتشريح الالتهاب الناجم عن أنواع الإصابات المختلفة.
Introduction
مع أكثر من 12٪ من الرضع الذين ولدوا في الولايات المتحدة قبل سن 37 أسبوعا يقدر الحمل 1، إصابات الدماغ فترة ما حول الولادة (PBI) من الخداج هو سببا مهما من أسباب العجز الدائم. PBI من الخداج، اعتلال الدماغ يطلق عليه أيضا من الخداج (EOP)، ويؤثر على الجهاز العصبي المركزي بأكمله (CNS). إصابة الجهاز العصبي المركزي غالبا ما يبدأ في الرحم، وتزداد سوءا بسبب عمليات ما قبل الولادة بما في ذلك شريوأمنيونيتيس ومضاعفات ما بعد الولادة مثل نقص الأكسجين وتعفن الدم. PBI من الشتائم النظامية يغير من النمو العصبي ويؤدي إلى الشلل الدماغي، الصرع، التأخر المعرفي والعديد من الاضطرابات العصبية والنفسية التي تؤثر على التنظيم العاطفي والذاكرة وظيفة تنفيذية 1،2. على الرغم من إحراز تقدم كبير، لا يزال هناك فهم محدود لكيفية العواقب الخلوية والجزيئية من إصابة الجهاز العصبي المركزي من الولادة المبكرة تترجم إلى العديد من عقابيل عصبية في الأطفال الذين يولدون قبل الأوان. هذا النقص في المعرفة هندالمتطلبات البيئية في الوقت الحقيقي تشخيص CNS شدة الإصابة والجرعات علم التدخلات الناشئة. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال الاستراتيجيات العلاجية المناسبة للفئة العمرية لهذه الفئة من السكان المعرضين للخطر المريض بعيد المنال.
التهاب داخل الرحم هو شائع جدا في الخداج الشديد وينطوي على سلسلة التهابات الجنين-الأم والمشيمة معقدة 3. العدوى داخل الرحم غالبا ما يكون تحت الإكلينيكي. النتائج المشيمة محددة تتفق مع التهاب حاد، أو شريوأمنيونيتيس] نسيجية، هي المحددات الرئيسية للاستجابة التهابية الجنين وهي تتزامن مع إصابات الدماغ المرتبطة الولادة المبكرة 3-5. والواقع أن الاستجابة الالتهابية الجنين لها آثار إكلينيكية واضحة المعالم لتحقيق نتائج على المدى الطويل من الولادة المبكرة. الرضع الذين صغير بالنسبة لسن الحمل (SGA) أو الذين يعانون من عدوى معرضون بشكل استثنائي إلى عجز عصبي 3،4. شريوأمنيونيتيس هي الولادة قبل الأوان التشخيص المرضي النموذجية التالية
لتقليد النظامية عيوب المشيمة نضح الإنسان وشريوأمنيونيتيس المرتبطة الناجم عن العوامل المسببة للأمراض الالتهاب، وضعنا نموذجا للما قبل الولادة عابرة النظامية نقص الأكسجة نقص التروية (TSHI) جنبا إلى جنب مع lipopolysaccharide في داخل الأمنيوسي (LPS) في الفئران. كان هدفنا على التكيف نموذجنا للTSHI وحدها في الفئران 12-16 لتشمل التهاب داخل الرحم،لتسهيل النمذجة قبل السريرية للإصابة الجهاز العصبي المركزي المرتبطة الولادة المبكرة. TSHI كشفت وحده الخسارة المستمرة لخلايا النسب oligodendroglial، العصبونات القشرية، وزيادة موت الخلايا، ورفع مستويات خلوى الموالية للالتهابات، مع فترات الدماغية تقدمية مما أدى إلى نمط متدرج الإصابة بما يتفق مع إصابات الدماغ قبل الولادة 16. وقد أثبتت تعديلات على مكونات الدماغية من هذا النموذج أيضا العجز في ترميز الذاكرة، قصيرة والذاكرة طويلة المدى والتعديلات العضلات والعظام خفيفة في الفئران مع تقدمهم في السن 17-19. في الواقع، لقد أثبتنا سابقا أن الجمع بين TSHI + LPS يلخص بصمات المرضية من EOP، بما في ذلك دبقية قليلة التغصن وفقدان الخلايا العصبية، والإصابة محور عصبي، التهاب الخلوية والتشوهات الوظيفية 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق الرعاية المؤسسية واللجان استخدم في مستشفى بوسطن للأطفال على حد سواء وجامعة مركز العلوم الصحية ولاية نيو مكسيكو جميع الإجراءات التجريبية.
ملاحظة: قبل البدء في الإجراء، وختم، وتعقيم الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والستائر الجراحية. بالإضافة إلى ذلك، تعد الأدوية اللاحقة للعمليات الجراحية في قارورة معقمة بما في ذلك 0.125٪ bipivucaine و 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين. إعداد أيضا حل lipopolysaccharide في (LPS) sterilely: 0.04 ملغ / مل LPS (0111: B4) في المياه المالحة العقيمة التي تحتوي على تمييع صبغة زرقاء ايفان.
1. التخدير
- حمل التخدير في يوم 18 (E18) حامل الفئران سبراغ داولي الجنينية بمزيج من 3٪ الأيزوفلورين متوازن 70٪ نيتروجين و 30٪ أكسجين.
- إزالة الفئران من غرفة تحريض ووضع مستلق على الفئران رايات الجراحية بطانية المياه المنتشرة التي حددت في 37 ° C. نقل التخدير لمخروط الأنف وتقليل isofluraمستوى ني إلى 2٪.
- بلطف تطبيق مرهم للعين إلى كل عين لمنع جفاف القرنية. أثناء إجراء رصد مستمر في درجة الحرارة ومعدل التنفس ومعدل ضربات القلب من الحيوان. وينبغي أن يظل علم وظائف الأعضاء الأمهات مستقر في جميع أنحاء الداخلي.
2. الجراحية الإعدادية وفرك
- باستخدام كليبرز الحيوانات الصغيرة إزالة كل الشعر في منطقة البطن السفلى. يحلق في نمط مستطيلة مع الحرص على تجنب الخدش الحلمات أو توليد الحلاقة طفح التي يمكن أن تكون مزعجة للتمريض في المستقبل من الجراء ولدت حية.
- إعداد جلد البطن بالتناوب تطبيق بوفيدون اليود و 70٪ من الإيثانول فرك مع قطعة قطن معقمة. تكرار فرك بحيث بوفيدون اليود و 70٪ من الإيثانول هي كل تطبيق 3X بالتناوب في الموضة. اسمحوا الجافة.
- تأكيد عمق التخدير عن طريق عدم وجود إصبع القدم قرصة المنعكس. في غياب رد الفعل والمحفزات للألم والحد من مستوى الأيزوفلورين إلى 1٪.
- استخدام المناشف الجراحية المعقمة،ثنى الحيوان. احرص على وضع الستائر في زاوية مناسبة بحيث أنها تعظيم كمية السائل الري أنها تمتص في حين عدم عرقلة تدفق الدم إلى الرحم قرون.
3. البطن البطن
- باستخدام مشرط جعل شق خط الوسط 3 سم في جلد البطن المعدة. بصراحة تشريح طبقة الجلد من اللفافة البطن مع مقص. باستخدام ملقط ومقص جراحي، رفع طبقة اللفافي البطن وإجراء شق في ألبا اوعائي الخط للوصول إلى التجويف البريتوني.
- وضع الشاش الجراحي على السطح الخارجي من شق وبلل بمحلول ملحي معقم. باستخدام الملقط حادة والضغوط الخارجية على البطن، إزالة بلطف قرون الرحم من التجويف البريتوني وترتيب على شاش مبلل.
- تجنب بعناية التشابك والاتصال مع الأمعاء. ترتيب الأجنة باستخدام ملقط عن طريق الاتصال الأنسجة العضلية فقط بين الحويصلات الذي يحيط بالجنين الفردية.فضح وعزل شرايين الرحم 4 باستخدام تشريح حادة.
يجب الحرص على تشريح شرايين الرحم: ملاحظة. الأنسجة المحيطة والأوعية أنفسهم حساسة للغاية. تلف الأوعية الأمهات يمكن أن يسبب النزيف، وفي الحالات الشديدة، وفاة الجنين والأم.
4. التنسيب من تمدد الأوعية الدموية كليب
- وضع فأر 30 G كليب تمدد الأوعية الدموية في كل الشريان الرحمي. ضمان وقف تدفق الدم، بما في ذلك الداني والقاصي البقول، وسواد من السفن الرحم بما في ذلك مشيمة الفردية. تغطية قرون المكشوفة والجراحي الميداني كامل مع الشاش وري بمحلول ملحي معقم. احرص على إبقاء مجال رطبة مع الري تقريبا كل 10 دقيقة.
- بعد 60 دقيقة، وإزالة الشاش ولري الحقل. ضمان قرون الرحم والأوعية وترطيبها بشكل كاف لإزالة مقطع ناجحة. بلطف إزالة كل مقطع تمدد الأوعية الدموية باستخدام ملقط. الحرص على عدم تسبب صدمة للسفينة، وصيانةسلامة الأنسجة العين أثناء الإزالة.
- تماما ري قرون الرحم والميدان، مع الحرص على إزالة أي المواضيع الضالة من الشاش من الحويصلات الذي يحيط بالجنين.
5. حقن lipopolysaccharide في الدخول إلى الأمنيوسي الحويصلات
- عند قاعدة كل الكيس السلوي الفردية، فقط الأمامي لوحة المشيمة، وضخ 100 ميكرولتر من LPS (4 ميكروغرام / كيس) مع صبغة زرقاء المخفف ايفان في لالسائل الذي يحيط بالجنين. استخدام الملقط حادة لتحقيق الاستقرار وتناوب كل الكيس السلوي في لموقف الأمثل للحقن. صبغة زرقاء مخفف ايفان هو عامل تباين التي هي مفيدة في تأكيد موضع الحقنة المناسبة والحقن.
ملاحظة: لا تستخدم إلا لغاية في الدقة حقنة الأنسولين مع 0.3 مل تعلق 8 ملم 31 G إبرة لحقن داخل الأمنيوسي. وذلك باستخدام إبر عيار أكبر تؤدي إلى فقدان السائل الذي يحيط بالجنين المزمنة، وفاة الجنين واستيعابهم من الحمل. كميات صغيرة من تسرب السائل الذي يحيط بالجنين على إزالة حقنة يمكن أن يكون mitigATED بواسطة الضغط المباشر على الكيس السلوي. بعض الأجنة الفئران قد تحمل قدرا من قلة السائل السلوي. ومع ذلك، فقد السوائل الذي يحيط بالجنين الحادة من ثقب مع الإبر كبيرة قياس، أو ثقب عرضي مما أدى إلى تسرب السوائل المزمن، والنتائج في فقدان الجنين، وفي الحالات الشديدة، وفقدان الحمل المجاورة. - لري الرحم قرون 3X بمحلول ملحي معقم.
6. إغلاق البطن
- باستخدام ملقط، والعودة بعناية قرون الرحم إلى التجويف البريتوني. ضمان مساحة كافية بين الحويصلات الذي يحيط بالجنين وشق خط الوسط، وإعادة تقريب-حواف طبقة عضلي لفافي باستخدام تشغيل خياطة 3-0 الحرير. يكون على بينة من وضع الحويصلات الذي يحيط بالجنين في حين إغلاق شق العضلات. أن يكون حريصا على عدم خياطة داخل أو من خلال الكيس.
- إعادة تقريب طبقة الجلد، وذلك باستخدام تشغيل خياطة 3-0 الحرير، وإغلاق طبقة الجلد.
ملاحظة: يجب إغلاق البطن في طبقتين من خيوط مستمرة للسماح للللبشرة وتوسيع العضلات مع زيادة الحمل. خيوط مستمرة تسمح لتوزيعها بالتساوي التوتر الجرح. هي أقل المطلوب الغرز توقف كما عقدة متعددة هي مزعجة ويمكن أن تمضغ بسهولة عن طريق الفئران على التعافي من التخدير. لم يتم المطلوب الدبابيس الجراحية. يجب أن تقطع ذيول عقدة جراحية قصيرة جدا (<3 مم). - حقن 1 مل من 0.125٪ بوبيفكين تحت الجلد حواف الجرح حول باستخدام إبرة 26 G. إدارة جرعة واحدة من 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين تحت الجلد في مؤخر العنق.
- إيقاف الأيزوفلورين والفئران الجاف منشفة الضرورة. وضع في قفص نظيف المنزل ورصد الانتعاش من التخدير. ضمان الفئران لا يصبح منخفض الحرارة.
7. ما بعد الجراحة والعناية الانتعاش
- مراقبة الفئران كل 8-12 ساعة لمدة 72 ساعة وبعد ذلك يوميا حتى ولدت الجراء (حوالي E22 أو E23). إدارة جرعات إضافية من البوبرينورفين q8-12 ساعة / 72 ساعة أو PRN وفقا لما تمليه IACUC.
- مراقبة الفئران لعلامات الألم، وعدم الراحة، والنزيف المهبلي أو نزيف من موقع الجراحية. تفقد الغرز وشق والحرص على ضمان الفئران لا مضغ أو إزالة الغرز قبل الأوان. وإن كان نادرا للغاية، الفئران التي تضر الغرز هم في خطر لتفزر الجرح.
ملاحظة: أحيانا الفئران قد استوعب كميات كبيرة من الفراش أو المواد غير الغذائية، ووصف بيكا، كأثر جانبي للإدارة البوبرينورفين. على الرغم من النادر جدا، يجب مراقبة الفئران لبيكا والمحتملة لاحقة انسداد الأمعاء.
8. معالجة الأنسجة وCryosectioning
- للتحضير لالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ من الدماغ بعد الولادة، وإزالة الجراء من قفص المنزل على بعد الولادة يوم 2 (P2). باستخدام مقص جراحي قطع رأس الفئران الوليدة وبلطف إزالة الدماغ من الجمجمة.
- إسقاط الإصلاح المخ في 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي 7 مل من 4٪ لامتصاص العرق في الفوسفات مخزنة المالحة(PBS). وضع الدماغ في 4 درجات مئوية، وإصلاح لمدة 72 ساعة.
- بعد 72 ساعة، نقل أدمغة إلى حل PBS العقيمة التي تحتوي على 30٪ سكروز (ث / ت) والعودة إلى 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بمجرد إسقاط العقول في حل السكروز هم على استعداد ليكون مقطوع على ناظم البرد. - بسرعة تجميد العقول وجبل على مدقة ناظم البرد لاقتناء أقسام الاكليلية المجمدة. قطع 20 ميكرون أقسام الاكليلية المجمدة وجبل على الشرائح. يتم جمع ضمان أقسام متسلسل.
- تسمح الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. متجر الشرائح في -20 درجة مئوية.
9. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ
- خذ الشريحة التي شنت أقسام المجمدة ودافئة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: إعداد جميع الحلول الطازجة. - مكان الشرائح على شريحة دفئا مجموعة إلى 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- نقل الشرائح إلى رف تلطيخ. تراجع الشرائح 10X في الماء منزوع الأيونات المزدوج المقطر ([ده 2 O).
- احتضان الشرائح في 100٪ الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق. منظمة الشفافية الدوليةلي في الهيماتوكسيلين يمكن أن يكون الأمثل اعتمادا على درجة من تلطيخ الأرجواني.
- تراجع الشرائح 4X في الاستفادة من H 2 O، واسمحوا الوقوف في نظيفة الصنبور H 2 O لمدة 1 دقيقة.
- تراجع الشرائح 15X في الكحول الحمضية (250 مل 70٪ من الإيثانول + 1 مل تتركز حمض الهيدروكلوريك).
- تراجع الشرائح 4X في الاستفادة من H 2 O، واسمحوا الوقوف في نظيفة الصنبور H 2 O لمدة 1 دقيقة.
- احتضان في 1٪ كربونات الليثيوم لمدة 2 دقيقة.
- تراجع الشرائح 4X في الاستفادة من H 2 O، واسمحوا الوقوف في نظيفة الصنبور H 2 O لمدة 1 دقيقة.
- احتضان في 95٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
- تراجع الشرائح 7X في 100٪ يوزين. عدد من الانخفاضات في يوزين يمكن تعديل اعتمادا على درجة من تلطيخ الوردي.
- تراجع الشرائح 5X في 95٪ من الإيثانول.
- 5X شريحة تراجع في التغيير جديدة من 95٪ من الإيثانول.
- احتضان الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة.
- احتضان الشرائح في التغيير جديدة من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة.
- احتضان الشرائح في 100٪ الزيلين لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: الخطوات الزيلين وcoverslipping ينبغي أن يحدث في غطاء الدخان. - احتضان الشرائح في تغييرات جديدة من الزيلين لمدة 15 دقيقة.
- ساترة مع Permount واسمحوا الجافة في غطاء الدخان.
- صورة الشرائح مع المجهر الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد TSHI + LPS في E18، الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ يكشف تشوهات كبيرة في أنسجة كل من المشيمة (الشكل 1) والدماغ (الشكل 2). مشيمة فحص على E19 E21 هي وذمي بشكل صارخ مع نزيف الصغير، ونخر في جميع أنحاء الساقط والمتاهة. ويلاحظ أيضا ارتشاح التهابي كبير وزيادة في الأوعية الدموية. أدمغة فحص على P2 تكشف ventriculomegaly، وكذلك المادة البيضاء وفقدان subplate الخلايا العصبية مقارنة شمس. سابقا، وقد أبلغنا أن TSHI + LPS يحرض الالتهاب وتعطي المادة البيضاء الثابتة وتشوهات محور عصبي يصاحب ذلك يعانون من إعاقة حركية كبير في الشباب البالغين 20. TSHI + LPS أيضا يقلل بشكل ملحوظ كلوريد البوتاسيوم شارك في نقل 2 (KCC2) تعبير البروتين، وكلوريد شارك في نقل المركزي في تطوير حمض الغاما γ (GABA) تثبيط ergic في القشرة في P15 (الشكل 3 قوية> *، P <0.05). هذه البيانات متوافقة مع upregulation التنموي ضعف من KCC2 خلال فترة ما بعد الولادة الحرجة من دائرة النضج وهذه النتائج تتفق مع التقارير السابقة لدينا من آثار TSHI وحدها في قرن آمون CA3 13.
الشكل 1: TSHI + LPS يحرض التشوهات النسيجية كبيرة في المشيمة بعد عابرة في الرحم نقص الأكسجة نقص التروية والإدارة LPS البينية الذي يحيط بالجنين في يوم الجنينية 18 (E18)، مشيمة من الأجنة E19 TSHI + LPS (B) هي ذمي بشكل صارخ مع نزيف (الأسهم)، نخر وزيادة ارتشاح التهابي مقارنة صورية (A، شريط النطاق = 100 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2: TSHI + LPS يحرض التشوهات النسيجية كبيرة في الدماغ بعد عابرة في الرحم نقص الأكسجة نقص التروية والإدارة LPS البينية الذي يحيط بالجنين في يوم الجنينية 18 (E18)، ventriculomegaly بعد الولادة، subplate الخلايا العصبية وفقدان المادة البيضاء لوحظ في الجراء تعرض ل المزدوج TSHI + LPS (B) مقارنة صورية (A) بشكل حاد في P2. (مقياس بار = 100 ميكرون؛ يرة سورية = subplate، WM = المادة البيضاء، LV = البطين الجانبي) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: TSHI + LPS يقلل KCC2 التعبير البقع الغربية يؤديها من ذاكرة.الاستعدادات الغشاء من الأنسجة تشريح الدقيقة القشرية، وتظهر في الرحم عابرة النظامية نقص الأكسجة نقص التروية والإدارة LPS البينية الذي يحيط بالجنين في يوم الجنينية 18 (E18) يقلل بشكل ملحوظ التعبير عن KCC2، عصبون محددة كلوريد البوتاسيوم شارك في نقل المركزي في تطوير الدوائر الدماغية متكاملة وكبت، في يوم ما بعد الولادة 15. (ن = 10/06، يعني ± SEM، تي الطالب اختبار، * P <0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التهاب الدماغ الخداج من الصعب نموذج في الحيوانات بسبب التفاعل المعقد بين مسببات، دوام النمو العصبي، تعقيد تشكيل شبكة الدماغي البشري، وتداخل آليات الإصابة، والظواهر المتنوعة للCNS شتائم اضحة في الخدج الإنسان. ويرتبط EOP مع نقاط الضعف المحددة الخلية من نوع (أي قليلة التغصن غير ناضجة) 21، وكذلك مختلف مسارات ينظم تنمويا (أي subplate، نقل غشاء ومفارز مستقبلات) 12،13،22. ومع ذلك، يمكن إحراز تقدم كبير عندما النماذج الحيوانية تكرار حالة الإنسان قدر الإمكان. هنا، قمنا بتطوير نموذج إهانة ما قبل الولادة التي تتضمن عدم تجانس آليات الإصابة CNS لوحظ في خديج، والسماح للتقييم لاحق كل من تلف المادة الرمادية والبيضاء والانتعاش. في البشر، والعدوى البكتيرية تصاعدي تضعف السلى وprecipitaالتمزق المبكر للأغشية الشركة المصرية للاتصالات. بالإضافة إلى ذلك، العيوب نضح المشيمة تؤكد واجهة المشيمة وتعطل التوازن المشيمة. وهكذا، underperfusion المشيمة يضاعف إصابة الجهاز العصبي المركزي من العدوى داخل الرحم. لا يمكن إنكاره، فإنه يشكل تحديا لنموذج السيناريو السريرية شيوعا من الصعود الالتهابات البكتيرية التي تسبق شريوأمنيونيتيس في القوارض لما لها من الرحم على الوجهين. كل قرن الرحم لديها عنق الرحم الخاص بها، ويتم تنفيذ الحمل متعددة في وقت واحد. على الرغم من هذه التحديات، وقد تم تكييف نماذج ما قبل السريرية لإشراك عناصر متعددة من وحدة الأم والمشيمة والجنين وتدرج في الرحم التهاب بدرجات متفاوتة. في حين لا يوجد نموذج ما قبل السريرية الفردية مثالية لاختبار كل فرضية محددة، والنموذج الذي وصفها في هذه الوثيقة تتضمن التغيرات الخلوية والجزيئية، وضعف السلوكي والوظيفي، ونظام الأم والمشيمة والجنين، وإصابة الجنين داخل الرحم والتهاب المشيمة عنصر مشترك لذلك أماهنيويورك قبل الأوان ولادة 20،23.
اختيار الأنواع المستخدمة لنموذج الآثار EOP تفسير البيانات التجريبية في سياق القيود المتأصلة التي تشكلها هذه الأنواع. في أبسط الشروط، لا ولادة لا يساوون إلى نقطة مماثلة من التنمية CNS في جميع الحيوانات 24. النموذج الذي وصفها هنا لا يمكن أن يؤديها في كل من الفئران الحوامل والفئران، على الرغم من بقاء الجرو في الفئران وانخفضت بشكل ملحوظ في السدود الخبرة أو شدد. وتمشيا مع التقارير السابقة لدينا، وفقدان الجنين في الفئران عند الولادة (P0) هو زيادة في الحيوانات TSHI + LPS (حوالي 40٪) مقارنة صورية، LPS وTSHI وحدها، ولكن الجراء على قيد الحياة لا تظهر اختلافات كبيرة الوزن خلال P28 20. على غرار الاختلافات بين الأنواع، توقيت الإصابة أثناء الحمل له دور حاسم في مسار النمو العصبي للذرية. تنظيم الزمانية المكانية من مراحل نمو الخلايا العصبية الانتشار والهجرة وزراعية مختلفةrentiation يختلف بين مختلف الثدييات 24-26. هذه البرامج التنموية خلية محددة تؤثر على التعرض للإصابة. على سبيل المثال، تداخل توقيت النسب دبقية قليلة التغصن وGABAergic تطوير الخلايا العصبية مع توقيت الولادة المبكرة يجعل هذه الخلايا عرضة بشكل خاص لإهانات فترة ما حول الولادة 27-29. وهكذا، تم تطوير هذا النموذج في الفئران E18 (وبنجاح تترجم إلى E17 الفئران على C57BL / 6 الخلفية)، وهذا توقيت يتوافق مع الإهانة قبل الولادة العالمية داخل الرحم الذي يحدث عند الرضع الإنسان ولادة قبل الخدج للغاية في 23-25 أسبوعا من الحمل 20 . أظهرنا سابقا الأكثر تضررا O4-مناعيا قليلة التغصن غير ناضجة في هذه المرحلة من تطوير 16. خسارتهم يرتبط مع بقاء انخفضت ونضوج 14، مع تخفيضات أبرز في O4 + وO1 + مراحل النسب 16، بما يتفق مع التقارير السابقة التي محققين آخرين 30. علاوة على ذلكلقد أثبتنا الخسارة المبكرة للsubplate، وانخفاض التعبير KCC2، وانخفاض الاستيلاء على عتبة وضعاف مشية 12،13،15 تتفق مع dysregulated GABAergic يشير في الخدج 31.
النموذج الذي وصفها هنا يقدم فوائد عديدة على النماذج السابقة في القوارض تستخدم لدراسة إصابات الدماغ فترة ما حول الولادة من الولادة المبكرة 23. اشتماله على نظام الأم والمشيمة والجنين كله ويسبب كل من الدماغ وإصابة المشيمة. نشرنا سابقا مقارنات بين صورية، TSHI وحده، وحده، ولبس TSHI + LPS والاختلاف في النتائج الفنية والكيمياء الحيوية 20، والاختلاف مع متدرج TSHI 16. بينما التحقيقات السابقة من عملية ربط الشريان السباتي من جانب واحد ونقص الأكسجة النظامية في الفئران حديثي الولادة ألقت نظرة الآلية إلى عدة عمليات الفيزيولوجية المرضية (أي قابلية قليلة التغصن غير ناضجة لنقص التروية)، متعدية المباشرة وreleva السريريالامتحانات التنافسية الوطنية لمثل هذه النماذج هو أقل قوة. بالإضافة إلى تطبيقات وصفها، هذا النموذج هو موضح هنا قد تكون أداة مفيدة للتحقيق في أجهزة الجسم الأخرى التي تتأثر الخداج، بما في ذلك التهاب الأمعاء الناخر (NEC) والقلب والرئة والكلى وضعف محور الغدة النخامية. ونظرا لتعقيدات LPS الصيدلة والاختلاف في الدوائية الأم والجنين، والحقن داخل الصفاق LPS في السدود أقل احتمالا لإنتاج نفس الاستجابة الالتهابية الجنين هو موضح هنا. وعلاوة على ذلك، LPS لا تعبر المشيمة موثوق 20،32. سابقا، حاولنا تطبيق عنق الرحم المباشر للLPS والحقن داخل الرحم على غرار ما تم وصفه في نماذج الفئران الأخرى 33. ومع ذلك، وجدنا أن وفيات والتناقض في إصابة الجهاز العصبي المركزي وزادت بشكل كبير بين الجراء في نفس القمامة. هنا، تم تحسين جرعة من 4 ميكروغرام / كيس باستخدام تجارب الجرعة والاستجابة. زيادة جرعات من LPS تدار على AMNنتائج حجرة iotic في زيادة وفيات الأجنة. LPS لديه ميزة على عدوى مباشرة مع البكتيريا سالبة الجرام داخل الرحم نموذجية من حيث أنه ينشط إشارات التهابات من خلال مثل عدد مستقبلات 4 دون أن تسبب عدوى بكتيرية نشطة ويصحب ذلك من مخاطر انتشار العوامل المسببة للأمراض. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا النموذج ليشمل مسببات الأمراض والكائنات المشتركة معزولة عن مشيمة الإنسان، بما في ذلك مجموعة B العقدية، والذي يسبب المشيمة وعصبية مرضية شذوذ، والسلوك مثل التوحد في الفئران (34). وبالمثل، يمكن أن البروتين الدهني الميورة النطاقات متعددة مستضد محاكاة عدوى الأنواع الميورة. منذ الميورة هي السبب الأكثر شيوعا لشريوأمنيونيتيس البشري 35، وهذا يمكن أيضا أن يكون وسيلة لتحقيق في المستقبل. كما أصبحت عوامل أكثر المعطل معد المتاحة، سيكون من المفيد لتحديد الكيفية التي تؤثر بشكل مختلف النمو العصبي وفعالية التدخلات العصبية الترميمي.
وتشمل القيود المفروضة على هذا النموذج فقدان السوائل الذي يحيط بالجنين من الحقن داخل الأمنيوسي. على الرغم من أن يلاحظ أي تأثير مع الحقن داخل الأمنيوسي من المياه المالحة عقيمة، ومقياس لالإبرة المستخدمة لأداء الحقن هو عنصر حاسم الفني. يجب الحرص على عدم استخدام الإبر أكبر من 31 G. المضاعفات الجراحية في الفئران الأم تتعلق البطن نادرة للغاية، بما في ذلك تفزر الجرح، انسداد الأمعاء، التهاب الصفاق وفقدان كامل للحمل، مع معدل وفيات الأمهات أقل من 5٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون لدان Firl، كريس كوربيت وجيسي Denson، دكتوراه. تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NINDS R01 NS060765 إلى ريال، وبرنامج P30 كوبر التجريبية لLJ وبرنامج التوقيع صحة الطفل إلى LJ في جامعة نيو مكسيكو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
- Blencowe, H., et al. Preterm birth associated neurodevelopmental impairment estimates at regional and global levels for 2010. Pediatr Res. 74, Suppl 1. 17-34 (2013).
- Mwaniki, M. K., Atieno, M., Lawn, J. E., Newton, C. R. Long term neurodevelopmental outcomes after intrauterine and neonatal insults a systematic review. Lancet. 379, 445-452 (2012).
- Dammann, O., Leviton, A. Intermittent or sustained systemic inflammation and the preterm brain. Pediatr Res. 75, 376-380 (2014).
- Leviton, A., et al. Microbiologic and histologic characteristics of the extremely preterm infant's placenta predict white matter damage and later cerebral palsy. the ELGAN study Pediatr Res. 67, 95-101 (2010).
- Redline, R. W. Inflammatory responses in the placenta and umbilical cord. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 296-301 (2006).
- Lee, J., et al. Chronic chorioamnionitis is the most common placental lesion in late preterm birth. Placenta. 34, 681-689 (2013).
- Lee, S. M., et al. Acute histologic chorioamnionitis is a risk factor for adverse neonatal outcome in late preterm birth after preterm premature rupture of membranes. PloS one. 8, e79941 (2013).
- Pappas, A., et al. Chorioamnionitis and early childhood outcomes among extremely low gestational age neonates. JAMA Peds. 168, 137-147 (2014).
- Gaillard, R., Arends, L. R., Steegers, E. A., Hofman, A., Jaddoe, V. W. Second and third trimester placental hemodynamics and the risks of pregnancy complications the Generation R Study. Am J Epidemiol. 177, 743-754 (2013).
- Trivedi, S., et al. Fetal placental inflammation but not adrenal activation is associated with extreme preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 206, 236 (2012).
- Yanowitz, T. D., et al. Hemodynamic disturbances in premature infants born after chorioamnionitis association with cord blood cytokine concentrations. Pediatr Res. 51, 310-316 (2002).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia Ischemia. Cereb Cortex. , (2014).
- Jantzie, L. L., et al. Erythropoietin attenuates loss of potassium chloride co transporters following prenatal brain injury. Mol Cell Neurosci. 61, 152-162 (2014).
- Jantzie, L. L., Miller, R. H., Robinson, S. Erythropoietin signaling promotes oligodendrocyte development following prenatal systemic hypoxic ischemic brain injury. Pediatric Res. 74, 658-667 (2013).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic ischemic injury. J Neurosurg Peds. 6, 206-221 (2010).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18, 568-581 (2005).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22, 1-16 (2012).
- Delcour, M., et al. Impact of prenatal ischemia on behavior cognitive abilities and neuroanatomy in adult rats with white matter damage. Behav Brain Res. 232, 233-244 (2012).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Intl J Devel Neurosci. 29, 593-607 (2011).
- Jantzie, L. L., et al. Complex pattern of interaction between in utero hypoxia ischemia and intra amniotic inflammation disrupts brain development and motor function. J Neuroinflam. 11, 131 (2014).
- Back, S., et al. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia ischemia. J Neurosci. 22, 455-463 (2002).
- Jantzie, L. L., et al. Developmental Expression of N Methyl d Aspartate (NMDA) Receptor Subunits in Human White and Gray Matter Potential Mechanism of Increased Vulnerability in the Immature Brain. Cereb Cortex. 25, 482-495 (2015).
- Jantzie, L. L., Robinson, S.
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Development of neurotransmitter systems during critical periods. Exper Neurol. 190, S8-S21 (2004).
- Kelsom, C., Lu, W. Development and specification of GABAergic cortical interneurons. Cell Biosci. 3, 19 (2013).
- Kinney, H., Back, S. Human oligodendroglial development Relationship to periventricualr leukomalacia. Semin Pediatr Neuro. 5, 180-189 (1998).
- Robinson, S., Li, Q., DeChant, A., Cohen, M. Neonatal loss of gamma amino butyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg Peds. 104, 396-408 (2006).
- Xu, G., et al. Late development of the GABAergic system in the human cerebral cortex and white matter. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 841-858 (2011).
- Segovia, K. N., et al. Arrested oligodendrocyte lineage maturation in chronic perinatal white matter injury. Ann Neurol. 63, 520-530 (2008).
- Robinson, S., Li, Q., Dechant, A., Cohen, M. L. Neonatal loss of gamma aminobutyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg. 104, 396-408 (2006).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24, 881-897 (2010).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis unraveling causes of adverse neurological outcomes. Repro Sci. 18, 900-907 (2011).
- Bergeron, J. D., et al. White matter injury and autistic like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation. Devel Neurosci. 35, 504-515 (2013).
- Uchida, K., et al. Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice. J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.
