Abstract
Prematüre Ensefalopati (EOP) en ileri öteleme hedefleri belirleyin. Erken doğum ile ilişkili anormallikleri merkezi sinir sistemini (MSS) kapsayan bir terimdir ve erken doğum ile ilişkili beyin hasarı için yeni tedavi stratejileri ortaya çıkarmak, ÇOP'un preklinik modelleri benzer mekanizmalar içermelidir Prenatal küresel yaralanma insanlarda görülen ve anne-plasental-fetal sistemin birden fazla bileşen içerir. İdeal olarak, modeller, olgun hayvan fonksiyonel açıklarının benzer spektrumunu üretmek ve patofizyoloji birden yönlerini özetlemek gerekir. Erken erken doğum patojen kaynaklı iltihap ile bağlantılı insan plasental perfüzyon sistemik bozuklukları, plasental underperfusion ve / veya koryoamniyonit taklit etmek için, içi amniyotik lipopolisakarit (LPS) ile bir araya prenatal geçici sistemik hipoksi, iskemi (TSHI) içindeki bir model geliştirmiştir. Hamile Sprague Dawley sıçanlarda, TSHI uterin arter tıkanıklığı o yoluylan embriyonik gün 18 (E18) fetusta MSS hasarı artan ilişkili bir kademeli plasental underperfusion kusur neden olur. Intra-amniyotik LPS enjeksiyonu ile kombine edildiğinde, plasental inflamasyon artar ve MSS hasar ilişkili beyaz cevher, yürüme ve manyetik rezonans görüntüleme bulguları ile karmaşıklaşır. Prenatal TSHI ve TSHI + LPS prenatal hakaret nöronlar, oligodendrositler ve akson, Plaka yapısı kaybı ve son derece doğan çocuklarda gözlenen taklit yetişkin hayvanlarda fonksiyonel açıklarının kaybına neden intrauterin hakaret recapitulating içeren bir ÇOP'un modeli kriterlerine çeşitli karşılamak erken. Ayrıca, bu model farklı yaralanma türlerine neden olduğu inflamasyonun diseksiyon sağlar.
Introduction
37 hafta tahmini gebelik yaşı 1 önce Amerika Birleşik Devletleri'nde doğan bebeklerin% 12'nin üzerinde olan, prematürite perinatal beyin hasarı (PBI) kalıcı sakatlık önemli bir nedenidir. PBI prematürite, prematüre olarak da adlandırılır ensefalopati (EOP), tüm merkezi sinir sistemi (CNS) etkilemektedir. MSS yaralanması genellikle in utero başlar ve koriyoamniyonit ve hipoksi ve sepsis gibi doğum sonrası komplikasyonlar da dahil olmak üzere doğum öncesi süreçler tarafından şiddetlenir. Sistemik hakaret gelen PBI nöro-gelişimsel sürecini değiştirir ve duygusal regülasyonu, bellek ve yürütücü işlev 1,2 etkileyen serebral palsi, epilepsi, bilişsel gecikme ve çok sayıda nöropsikiyatrik bozukluklara yol açar. Çok ilerleme kaydedilmiş olmasına rağmen, sınırlı bir anlayış erken doğumdan itibaren MSS yaralanma hücresel ve moleküler sonuçları preterm doğan çocuklarda nörolojik sekel çokluk çevirmek nasıl kalır. Bilgi hind bu eksikliğiGerçek zamanlı MSS yaralanma şiddetinin tanı ve gelişmekte olan müdahalelerin haberdar dozaj ers. Ayrıca, bu savunmasız hasta popülasyonu için yaşa uygun tedavi stratejileri zor kalır.
Rahim içi iltihabı, aşırı prematüre çok yaygın olan ve 3 karmaşık bir fetal-maternal-plasental inflamatuar dizisini içerir. Intrauterin enfeksiyon genellikle subklinik olduğunu. Akut inflamasyon veya histolojik koryoamniyonit ile uyumlu Belirli plasental bulgular, fetal enflamatuar yanıtın önemli belirleyicileri ve erken doğum 3-5 ile ilişkili beyin hasarı ile tesadüf. Nitekim, fetal inflamatuvar yanıt erken doğumdan itibaren uzun vadeli sonuçları için farklı klinik etkileri vardır. Gebelik yaşı (SGA) ya da kim enfeksiyon deneyim için küçük bebekler nörolojik defisit 3,4 ile son derece açıktır. Koryoamniyonit tipik patolojik tanı takip erken doğum olduğunu
Patojen kaynaklı inflamasyon ile ilişkili insan sistemik plasental perfüzyon defektleri ve koryoamniyonit taklit etmek, sıçanlarda içi amniyotik lipopolisakarit (LPS) ile kombine prenatal geçici sistemik hipoksi-iskemi (TSHI) bir model geliştirdi. Amacımız, intrauterin iltihabı dahil yalnız sıçanlarda 12-16 TSHI bizim modeli adapte olduerken doğum ile ilgili CNS yaralanma preklinik modelleme kolaylaştırmak için. TSHI başına oligodendroglial soyu hücreleri, kortikal nöronlar kalıcı zarar ortaya koymuştur, prenatal beyin hasarı 16 ile uyumlu bir yaralanma kademeli kalıp giden aşamalı iskemik aralıklı, hücre ölümü artışı ve pro-enflamatuar sitokin seviyelerinin yüksek. Onlar 17-19 yaş olarak bu modelin iskemik bileşenlerine değişiklikler de sıçanlarda hafıza kodlama, kısa ve uzun süreli hafıza ve hafif kas-iskelet değişiklikler eksiklikler göstermiştir. Gerçekten de, daha önce TSHI + LPS kombinasyonu oligodendrosit ve nöronal kaybın, aksonal yaralanma, enflamasyon ve fonksiyonel hücre anormallikleri dahil olmak üzere, 20 EOP patofizyolojik işaretlerinden, tekrarlar olduğunu göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kurumsal Bakım ve Kullanım Komiteleri hem Boston Çocuk Hastanesi'nde ve New Mexico Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi, tüm deneysel prosedürleri onayladı.
NOT: Ön işlem, mühür başlamadan, sterilize ve tüm cerrahi aletler ve cerrahi örtüler otoklav. Buna ek olarak,% 0.125 bipivucaine ve 0.1 mg / kg dahil olmak üzere, buprenorfin, steril şişeler içinde post-operatif ilaç hazırlanması. Ayrıca steril lipopolisakarit (LPS) bir çözelti hazırlamak: 0,04 mg / ml LPS (0111: B4) Evan mavisi seyreltik ihtiva eden steril tuzlu su içinde.
1. Anestezi
- % 3 izofluran dengeli bir% 70 azot ve% 30 oksijen karışımı ile embriyonik gün 18 (E18) hamile Sprague Dawley sıçan anestezi neden.
- Indüksiyon odasından sıçan çıkarın ve 37 ° C'de set dökümlü cerrahi dolaşan su battaniye sıçan sırtüstü yerleştirin. Burun konisi anestezi aktarın ve isoflura azaltmak% 2 ne düzeyde.
- Yavaşça kornea kurumasını önlemek için her gözün oftalmik merhem uygulayın. İşlem sırasında sürekli sıcaklık, solunum hızı ve hayvan kalp atışlarının izlenmesi. Anne fizyolojisi prosedür boyunca sabit kalması gerekir.
2. Cerrahi Hazırlık ve Scrub
- Kullanımı küçük hayvan kesme alt karın bölgesindeki bütün tüylerden. Meme nicklemek veya canlı doğmuş yavruların gelecekteki hemşirelik için rahatsız edici olabilir jilet döküntü üreten önlemek için dikkatli bir dikdörtgen desen Tıraş.
- Steril pamuklu çubukla povidon iyot ve% 70 etanol fırçalayın uygulama değiştirerek karın cildi hazırlayın. Povidon-iyot ve% 70 etanol her moda alternatif 3x uygulanan olacak şekilde fırçalayın tekrarlayın. Kurumaya bırakın.
- Ayak-tutam refleksinin yokluğu yoluyla anestezi derinliği onaylayın. Ağrı refleksi uyaranların yokluğunda,% 1 izofluran seviyesini azaltır.
- Steril cerrahi havlu kullanarak,hayvan asmak. Onlar rahim boynuzları kan akışını engellediği değil iken absorbe sulama sıvı miktarını maksimize şekilde uygun bir açıyla perdeler yerleştirmek için özen gösterin.
3. Abdominal Laparotomi
- Bir neşter kullanılarak hazırlanan karın derisinde 3 cm'lik orta hat kesi yapmak. Açık açık makas ile karın fasya deri tabakasını incelemek. Forseps ve cerrahi makas kullanarak, karın fasya tabakası yükseltmek ve periton boşluğuna erişmek için avasküler linea alba bir kesi yapmak.
- Kesi dış cerrahi gazlı bez yerleştirin ve steril tuzlu su ile nemlendirin. Karın künt forseps ve dış basınç kullanarak, yavaşça periton boşluğuna gelen rahim boynuzları kaldırmak ve nemlendirilmiş gazlı bez üzerine yerleştirin.
- Dikkatle dolanması önlemek ve bağırsak ile temasa geçin. Fetusun bireysel amnion kesesi arasındaki tek kas dokusu ile temasa geçerek forseps kullanarak düzenleyin.Açığa ve künt diseksiyon ile 4 uterin arterler izole.
NOT: Bakım rahim arterleri incelemek için alınmalıdır. Ortam doku ve damarları kendilerini son derece hassastır. Anne gemilere hasar kanamaya yol ve ciddi vakalarda, fetal ve maternal ölüm olabilir.
Anevrizma Klipleri 4. Yerleştirme
- Her uterin arter üzerinde bir sıçan 30 G anevrizma klibi yerleştirin. Bireysel plasenta rahim dahil gemilerin proksimal ve distal bakliyat ve koyulaşması dahil kan akışının durması emin olun. Maruz boynuzları ve gazlı bez ile tüm cerrahi alanı kapsayacak ve steril tuzlu su ile yıkayın. Sulama yaklaşık her 10 dk ile nemli alan tutmaya özen gösterin.
- 60 dakika sonra, gazlı bez kaldırmak ve alanını sulamak. Rahim boynuzları ve damarlar yeterince başarılı klip kaldırılması için ıslatılmış olduğundan emin olun. Yavaşça forseps kullanarak her anevrizma klibi kaldırın. Gemiye travma ve maint sebebiyet vermemek özen gösterinçıkarılması sırasında ain doku bütünlüğü.
- İyice amnion kesesi gelen gazlı bez herhangi bir sokak Konuları kaldırmak için özen, rahim boynuzları ve alanını sulamak.
Amniyon Sacs için Lipopolisakarit 5. Enjeksiyon
- Her amniyon kesesi dibinde, sadece plasental plaka ön amniyon sıvısına seyreltilmiş Evan mavi boya ile LPS (4 ug / kese) 100 ul enjekte edilir. Stabilize ve enjeksiyon için en uygun pozisyona her amniyotik kese döndürmek için künt forseps kullanın. Seyreltik Evan mavi boya uygun şırınga yerleştirme ve enjeksiyon teyit yararlı bir kontrast ajandır.
NOT: intra-amniyotik enjeksiyonlar için ekli 8 mm 31 G iğne ile Yalnızca bir ultra-ince 0.3 ml insülin şırınga. Daha büyük göstergesi iğneler kullanılarak kronik amniyotik sıvı kaybı, fetal ölüm ve gebelik reabzorpsiyonunda neden olacaktır. Şırınga çıkartılması üzerine amniyotik sıvı sızıntı küçük miktarlarda mitig olabiliramniyon kesesi doğrudan basınç ile bir-. Bazı sıçan fetus oligohidramnios bir ölçüde tolere edebilir. Ancak, büyük göstergesi iğne veya kronik sıvı sızıntısı ile sonuçlanan kazayla ponksiyonu, fetal kayıp ve ciddi vakalarda sonuçları, komşu gebelik kaybı ile delinerek akut amniyotik sıvı kaybı. - Boynuzları steril serum fizyolojik ile 3x uterus yıkayın.
6. laparotomi Kapanış
- Forseps kullanarak, dikkatli periton boşluğuna rahim boynuzları geri dönün. Amnion kesesi ve orta hat kesi arasında yeterli boşluk sağlanması, çalışan 3-0 ipek sütür kullanılarak muskulofasyal katman kenarlarını yeniden yaklaşmaktadır. Kas kesi kapatırken amnion kesesi yerleştirme farkında olun. Içine veya kese ile sütür için değil dikkatli olun.
- Cilt katmanı kapatarak, bir çalışan 3-0 ipek sütür kullanılarak, cilt tabakası yeniden yaklaşmaktadır.
NOT: laparotomi izin devamlı sütür iki kat kapalı olmalıdırCilt ve gebelik artan kas genişleme. Sürekli dikişler eşit olarak dağıtılmış yara gerginliği için izin verir. Birden knot rahatsız edici ve kolayca anestezi kurtarma üzerine sıçan tarafından çiğnenmiş edilebilir Kesilen sütür az arzu edilir. Cerrahi zımba arzu edilmez. Cerrahi knot kuyrukları çok kısa (<3 mm) kesilmelidir. - Bir 26 G iğne kullanılarak% 0.125 bupivakain deri altından yaklaşık yara kenarlarının 1 ml enjekte edilir. Ense de kg buprenorfin subkutan 0.1 mg tek doz / yönetmek.
- Izofluran ve havlu kuru sıçan gerekirse kapatın. Temiz ev kafeste yerleştirin ve anestezi ayilmanizi. Hipotermik hale gelmez sıçan olun.
7. Ameliyat Sonrası Kurtarma ve Bakım
- Yavrular (yaklaşık E22 veya E23) doğarlar kadar günlük sonra 72 saat boyunca siçana her 8-12 saat Monitör ve. Buprenorfın q8-12 saat / 72 saat ek doz yönetmek veya IACUC tarafından belirlenen prn.
- Ağrı, rahatsızlık, vajinal kanama ya da cerrahi sitesinden kanama belirtileri için sıçanları izleyin. Sütürler ve kesi kontrol edin ve sıçan çiğneme veya erken kendi sütür kaldırarak görmediğinden emin olmak için özen gösterin. Derece nadir olmasına rağmen, onların sütürler tehlikeye sıçanlar yara açılma riski altındadır.
NOT: Bazen sıçanlar yatak ya da gıda dışı maddelerin aşırı miktarda yemek olabilir, buprenorfın yönetiminin bir yan etkisi olarak, pika denir. Çok nadir olmakla birlikte, sıçanlar pika ve potansiyel sonraki barsak tıkanıklığı için izlenmesi gerekir.
8. Doku İşleme ve Cryosectioning
- , Hematoksilen (H & E) doğum sonrası beyin boyanması için hazırlık doğum sonrası gün 2 (P2) üzerine evlerine kafes yavrular kaldırmak için. Cerrahi makas hafifçe sıçan yavrular başını kesmek ve kullanma kafatası beyin kaldırmak.
- Fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehit 7 ml içeren 15 ml konik bir tüp içinde düzeltme beyin bırakın(PBS). 4 ° C 'de beyin yerleştirin ve 72 saat boyunca sabitlemek.
- 72 saat sonra,% 30 sukroz ihtiva eden bir steril PBS çözeltisi beyinleri transferi (w / v) ve 4 ° C 'geri dönün.
NOT: beyinleri sukroz çözeltisi damla kez onlar bir kriyostat üzerinde kesitli hazırdır. - Hızla beynini dondurma ve dondurulmuş koronal kesitlerin edinimi için kriyostat tokmak monte. 20 mikron dondurulmuş koronal bölümleri kesmek ve slaytlar monte. Emin olun bölümler seri toplanır.
- Slaytlar gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. -20 ° C'de de kayar.
9. Hematoksilen & Eosin Boyama
- Oda sıcaklığına slayt monte donmuş bölümleri ve sıcak atın.
NOT: Tüm çözümler taze hazırlayın. - 2 saat boyunca 50 ° C'ye kadar bir slayt sıcak grubu yerleştirin kayar.
- Transfer boyama raf kayar. Dip (GKD 2 O) çifte damıtılmış deiyonize su içinde 10x slaytlar.
- 5 dakika boyunca% 100 hematoksilin slaytlar inkübe edin. Tihematoksilin beni mor boyama derecesine bağlı olarak optimize edilebilir.
- Dip slaytlar musluk H 2 O 4x ve 1 dakika süreyle 2 O temiz musluk H bekletilir.
- Dip (250 mi,% 70 etanol + 1 mi konsantre hidroklorik asit) asidi alkol içinde 15x kayar.
- Dip slaytlar musluk H 2 O 4x ve 1 dakika süreyle 2 O temiz musluk H bekletilir.
- 2 dakika için% 1 lityum karbonat inkübe edin.
- Dip slaytlar musluk H 2 O 4x ve 1 dakika süreyle 2 O temiz musluk H bekletilir.
- 1 dakika boyunca% 95 etanol içinde inkübe edin.
- Dip slaytlar% 100 Eosin içinde 7x. Eosin batırma sayısı pembe boyama derecesine bağlı olarak modifiye edilebilir.
- Dip slaytlar% 95 etanol içinde 5 kata.
- % 95 etanol taze değişiklik Lamı 5x.
- 1 dakika boyunca% 100 etanol içinde slaytlar inkübe edin.
- 1 dakika boyunca% 100 etanol içinde taze değişiklik slaytlar inkübe edin.
- 15 dakika% 100 ksilen slaytlar inkübe edin.
NOT: Ksilen adımlar veBir çeker ocak içinde gerçekleşmelidir coverslipping. - 15 dakika boyunca ksilen taze değişiklikler slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
- Permount ile lamel ve davlumbaz kurumaya bırakın.
- Görüntü bir ışık mikroskobu ile kayar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E18 de TSHI + LPS'yi ardından, hematoksilen ve eozin boyama önemli histopatolojik plasenta hem anormallikler (Şekil 1) ve beyinde (Şekil 2) ortaya koymaktadır. E19 ve E21 üzerine incelenen plasenta desidua ve labirent boyunca mikro kanama ve nekroz ile fena halde ödemli bulunmaktadır. Önemli inflamatuar infiltrasyon ve artan damarlanma da görülmektedir. P2 incelenen beyinleri ventrikülomegali ortaya yanı sıra beyaz cevher ve Plaka yapısı nöron kaybı Shams göre. Daha önce, TSHI + LPS iltihabı neden olur ve kalıcı beyaz cevher ve genç erişkinlerde 20 önemli motor hasar ile birlikte aksonal anormallikler verir bildirmiştir. TSHI + LPS aynı zamanda önemli ölçüde potasyum klorür ko-transporter P15 korteksteki 2 (KCC2) protein ekspresyonu, γ-amino butirik asit gelişimi (GABA) kolinerjik inhibisyonu için merkezi bir klorür ko-transporter (Şekil 3 azalır 13 tek başına TSHI etkileri bizim önceden raporlar ile tutarlıdır.
Şekil 1:. TSHI + LPS plasentada önemli histolojik anormallikler uyarmaktadır embriyonik gün 18 (E18) üzerine utero hipoksi-iskemi ve intra-amniyotik LPS yönetiminde geçici takiben, E19 TSHI + LPS fetuslarda (B) plasenta kanama ile fena halde ödemli (oklar), nekroz ve artan inflamatuar sham ile karşılaştırıldığında infiltrasyon (A, ölçek çubuğu = 100 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. TSHI + LPS beyinde önemli histolojik anormallikler uyarmaktadır embriyonik gün 18 (E18), doğum sonrası ventrikülomegalili, Plaka yapısı nöron ve beyaz cevher kaybı utero hipoksi-iskemi ve intra-amniyotik LPS yönetiminde geçici takiben tabi yavrular görülmektedir akut P2 plasebo (A) ile karşılaştırıldığında, çift TSHI + LPS (B). (Ölçek çubuğu = 100 mikron; Sp = Plaka yapısı; WM = beyaz cevher; LV = lateral ventrikül) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: TSHI + LPS KCC2 ekspresyonunu azaltır mem gerçekleştirilebilir Western blotları.embriyonik gün 18 utero geçici sistemik hipoksi-iskemi ve intra-amniyotik LPS uygulamasından mikro-disseke kortikal doku, gösterinin bran preparatları (E18) anlamlı gelişimine merkezi KCC2, bir nöron spesifik potasyum klorür ko-transporter ifadesini azaltır doğum sonrası 15. günde entegre beyin devreleri ve önlenmesi, (n = 6-10, ± SEM, Student t-testi, * p <0.05 ortalama).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prematüre Ensefalopati nedeniyle yaralanma mekanizmaları örtüşen etiyolojiler, nörogelişimsel zamanla, insan beyin ağ oluşumu karışıklık, karmaşık etkileşim hayvanlarda modellenmesi zordur ve MSS farklı fenotipleri insan erken doğmuş bebeklerde tezahür hakaretler. EOP hücre tipine özel güvenlik ile ilişkilidir (örneğin, olgunlaşmamış oligodendrositler) 21, hem de çok çeşitli gelişimsel olarak düzenlenmiş yolları (örneğin, Plaka yapısı, membran taşıyıcıları ve reseptör alt birimleri) 12,13,22. Hayvan modelleri mümkün olduğunca yakın insan durumunu çoğaltmak Ancak, önemli gelişmeler yapılabilir. Burada, bir modeli gri ve beyaz madde hasarı ve geri hem daha sonra yapılan değerlendirmede sağlayan, erken bebek gözlemlenen MSS yaralanması mekanizmaları heterojen içeren bir doğum öncesi hakaret geliştirdi. İnsanlarda, artan bakteriyel enfeksiyonlar amniyon ve bir çökelti zayıflatmakzarların te rüptürü. Ayrıca, plasental perfüzyon defektleri plasental arayüzü stres ve plasental hemostazını bozabilir. Böylece, plasental underperfusion intrauterin enfeksiyon CNS yaralanması bileşikleri. Şüphesiz onlar bir dubleks rahim olduğu gibi kemirgenlerde koryoamniyonit önce bakteriyel enfeksiyonlar artan ortak klinik senaryo modellemek zordur. Her uterin boynuz kendi serviks vardır ve çoğul gebelikler seferde taşınmaktadır. Bu zorluklara rağmen, klinik öncesi modellerde anne-plasental-fetal birimin birden çok bileşeni içerir ve çeşitli derecelerde utero inflamasyon dahil adapte edilmiştir. Hiçbir bireysel klinik öncesi bir model, her belirli hipotezi test etmek için ideal olsa da, burada açıklanan model hücresel ve moleküler anormallikleri, davranışsal ve fonksiyonel bozukluk, anne-plasental-fetal sistemi ve intrauterin enfeksiyon ve benzeri ma ortak plasental inflamasyon bileşeni içeriyorny erken 20,23 doğuran.
Kullanılan türlerin seçimi türlerinin oluşturduğu doğal sınırlamalar çerçevesinde ÇOP tesir etmektedir deneysel verilerin yorumlanması model. En basit anlamda, doğum, tüm hayvanların 24 arasında MSS gelişiminin benzer noktalara denk değildir. Farelerde yavru sağkalım anlamlı tecrübesiz veya stresli baraj azalır, ancak burada tarif edilen bir model, farelerde ve sıçanlarda, hamile hem de gerçekleştirilebilir. Bizim önceden raporlar, doğum (P0) sıçanlarda fetal kayıp Tutarlı yalnız sahte, LPS ve TSHI göre TSHI + LPS hayvanlar (yaklaşık% 40) artmıştır, ancak kalan yavrular P28 20 ile önemli ağırlık farklılıklar sergilerler yok. Türler arasındaki farklılıklara benzer şekilde, gebelik sırasında yaralanma zamanlaması yavruların nörogelişimsel yörünge önemli bir role sahiptir. Çoğalma, göç ve sorumluluk yönün nöral hücre gelişim aşamaları uzaysal düzenlemerentiation çeşitli memeliler 24-26 arasında değişir. Bu hücreye spesifik gelişimsel programların yaralanma açığı etkiler. Örneğin, erken doğum zamanlaması ile oligodendrosit soy ve GABAerjik nöronal gelişimin zamanlaması örtüşme perinatal hakaret 27-29 özellikle yatkın bu hücreleri yapar. Böylece, bu model E18 sıçanlarda geliştirilen (ve başarılı bir C57BL / 6 arka planda E17 farelere tercüme) Bu zamanlama 23-25 gebelik haftasından 20'de öncesinde son derece erken doğum, insan bebeklerde meydana intrauterin küresel prenatal hakaret karşılık olarak . Biz daha önce O4-immunoreaktif olgunlaşmamış oligodendrositler en kalkınma 16 bu aşamada etkilendiği görüldü. Onların kaybı diğer araştırmacılar 30 ile O4 + ve önceki raporlarla tutarlı soyu 16 O1 + aşamalarında en önemli azalmalar ile, azalmış sağkalım ve olgunlaşma 14 ile ilişkilidir. DahasıBiz Plaka yapısı erken kaybı, azalmış KCC2 ifadesini, alt nöbet eşiğini ve düzensiz GABA'erjik erken doğan bebeklerde 31 sinyal ile tutarlı engelli yürüyüş 12,13,15 göstermiştir.
Burada açıklanan model erken doğum 23'ten perinatal beyin hasarı incelemek için kullanılan kemirgenlerde önceki modellere göre sayısız avantaj sunar. Bu tüm anne-plasental-fetal sistemini içeren ve beyin ve plasenta hasarı de yol açmaktadırlar. Biz daha önce sahte arasındaki karşılaştırmalar yayınlanmış, TSHI yalnız, tek başına LPS ve TSHI + LPS ve kademeli TSHI 16 fonksiyonel sonuçlar ve biyokimya 20, ve farklılıklar farklılıklar. Tek taraflı karotis ligasyonu ve neonatal sıçanlarda sistemik hipoksi önceki araştırmalar, doğrudan öteleme ve klinik releva (iskemi olgunlaşmamış oligodendrositlerin duyarlılık yani) çeşitli patofizyolojik süreçler mekanik anlayış döken ederkenBu tür modeller için nce az sağlamdır. Açıklanan uygulamalara ek olarak, burada açıklanan model, nekrotizan enterokolit (NEK), kalp, akciğer, böbrek ve hipotalamus-hipofiz eksen disfonksiyonu dahil Prematüre etkilenen diğer organ sistemlerinin incelenmesi için bilgilendirici bir araç olabilir. LPS farmakoloji karmaşıklığı ve maternal ve fetal farmakodinamik farklılıklara sayesinde barajlarda intraperitoneal LPS enjeksiyonu Burada gösterilen aynı fetal enflamatuar yanıtı üretmek için daha az olasıdır. Dahası, LPS güvenilir 20,32 plasentayı değildir. Daha önce, LPS'nin doğrudan servikal uygulama ve diğer fare modellerinde 33 tarif edilmiştir ne benzer rahim içi enjeksiyon çalıştı. Ancak, biz CNS yaralanma mortalite ve tutarsızlık ölçüde aynı çöp içinde yavrular arasında arttığını buldular. Burada, 4 ug / kese doz doz-yanıt deneyleri kullanılarak optimize edilmiştir. Amn tatbik LPS doz arttırılmasıartmış fetal mortaliteye iotic bölme sonuçları. LPS etkin bakteriyel enfeksiyon ve patojen yayılma ilişkili risk yaratmadan toll-benzeri reseptör 4 boyunca inflamatuar sinyal aktive olmasıyla, tipik intrauterin gram-negatif bakteriler ile doğrudan enfeksiyon üzerinde bir avantaja sahiptir. Ancak, bu modelin B grubu plasenta ve nöropatolojik anormallikler neden streptokok, ve sıçanlarda 34 otistik benzeri davranışları dahil olmak üzere insan plasenta, izole ortak patojenleri ve organizmaların içerecek şekilde modifiye edilebilir. Benzer şekilde, Ureaplasma lipoprotein çoklu-bantlı antijen Ureaplasma türleri enfeksiyonu taklit edebilirsiniz. Ureaplasma insan koryoamniyonit 35 en sık görülen nedeni olduğundan, bu aynı zamanda gelecekteki araştırmalar için bir yol olabilir. Daha inaktive-enfeksiyöz ajanlar kullanılabilir hale geldikçe, onlar farklı şekilde nöro-gelişimsel sürecini ve nöro-onarıcı müdahalelerin etkinliğini nasıl etkilediğini belirlemek için bilgilendirici olacaktır.
Bu modelin Sınırlamalar içi amniyotik enjeksiyondan amniyotik sıvı kaybıdır. Hiçbir etki steril serum fizyolojik intra-amniyotik enjeksiyonlarla kaydetti rağmen, enjeksiyon gerçekleştirmek için kullanılan iğnenin göstergesi önemli bir teknik elemandır. Bakım% 5 daha az anne ölüm ile yara açılması, bağırsak tıkanıklığı, peritonit ve gebelik tam kaybı da dahil olmak üzere, son derece nadirdir laparotomi ile ilgili anne sıçan iğneler daha büyük 31 G. Cerrahi komplikasyonlar kullanmak için değil alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dan Firl, Chris Corbett ve Jesse Denson, doktora müteşekkiriz. Harçlar SR NIH NINDS R01 NS060765 tarafından sağlandı, LJ için P30 COBRE Pilot Programı ve New Mexico Üniversitesi'nde LJ için Çocuk Sağlığı İmza Programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
- Blencowe, H., et al. Preterm birth associated neurodevelopmental impairment estimates at regional and global levels for 2010. Pediatr Res. 74, Suppl 1. 17-34 (2013).
- Mwaniki, M. K., Atieno, M., Lawn, J. E., Newton, C. R. Long term neurodevelopmental outcomes after intrauterine and neonatal insults a systematic review. Lancet. 379, 445-452 (2012).
- Dammann, O., Leviton, A. Intermittent or sustained systemic inflammation and the preterm brain. Pediatr Res. 75, 376-380 (2014).
- Leviton, A., et al. Microbiologic and histologic characteristics of the extremely preterm infant's placenta predict white matter damage and later cerebral palsy. the ELGAN study Pediatr Res. 67, 95-101 (2010).
- Redline, R. W. Inflammatory responses in the placenta and umbilical cord. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 296-301 (2006).
- Lee, J., et al. Chronic chorioamnionitis is the most common placental lesion in late preterm birth. Placenta. 34, 681-689 (2013).
- Lee, S. M., et al. Acute histologic chorioamnionitis is a risk factor for adverse neonatal outcome in late preterm birth after preterm premature rupture of membranes. PloS one. 8, e79941 (2013).
- Pappas, A., et al. Chorioamnionitis and early childhood outcomes among extremely low gestational age neonates. JAMA Peds. 168, 137-147 (2014).
- Gaillard, R., Arends, L. R., Steegers, E. A., Hofman, A., Jaddoe, V. W. Second and third trimester placental hemodynamics and the risks of pregnancy complications the Generation R Study. Am J Epidemiol. 177, 743-754 (2013).
- Trivedi, S., et al. Fetal placental inflammation but not adrenal activation is associated with extreme preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 206, 236 (2012).
- Yanowitz, T. D., et al. Hemodynamic disturbances in premature infants born after chorioamnionitis association with cord blood cytokine concentrations. Pediatr Res. 51, 310-316 (2002).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia Ischemia. Cereb Cortex. , (2014).
- Jantzie, L. L., et al. Erythropoietin attenuates loss of potassium chloride co transporters following prenatal brain injury. Mol Cell Neurosci. 61, 152-162 (2014).
- Jantzie, L. L., Miller, R. H., Robinson, S. Erythropoietin signaling promotes oligodendrocyte development following prenatal systemic hypoxic ischemic brain injury. Pediatric Res. 74, 658-667 (2013).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic ischemic injury. J Neurosurg Peds. 6, 206-221 (2010).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18, 568-581 (2005).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22, 1-16 (2012).
- Delcour, M., et al. Impact of prenatal ischemia on behavior cognitive abilities and neuroanatomy in adult rats with white matter damage. Behav Brain Res. 232, 233-244 (2012).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Intl J Devel Neurosci. 29, 593-607 (2011).
- Jantzie, L. L., et al. Complex pattern of interaction between in utero hypoxia ischemia and intra amniotic inflammation disrupts brain development and motor function. J Neuroinflam. 11, 131 (2014).
- Back, S., et al. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia ischemia. J Neurosci. 22, 455-463 (2002).
- Jantzie, L. L., et al. Developmental Expression of N Methyl d Aspartate (NMDA) Receptor Subunits in Human White and Gray Matter Potential Mechanism of Increased Vulnerability in the Immature Brain. Cereb Cortex. 25, 482-495 (2015).
- Jantzie, L. L., Robinson, S.
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Development of neurotransmitter systems during critical periods. Exper Neurol. 190, S8-S21 (2004).
- Kelsom, C., Lu, W. Development and specification of GABAergic cortical interneurons. Cell Biosci. 3, 19 (2013).
- Kinney, H., Back, S. Human oligodendroglial development Relationship to periventricualr leukomalacia. Semin Pediatr Neuro. 5, 180-189 (1998).
- Robinson, S., Li, Q., DeChant, A., Cohen, M. Neonatal loss of gamma amino butyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg Peds. 104, 396-408 (2006).
- Xu, G., et al. Late development of the GABAergic system in the human cerebral cortex and white matter. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 841-858 (2011).
- Segovia, K. N., et al. Arrested oligodendrocyte lineage maturation in chronic perinatal white matter injury. Ann Neurol. 63, 520-530 (2008).
- Robinson, S., Li, Q., Dechant, A., Cohen, M. L. Neonatal loss of gamma aminobutyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg. 104, 396-408 (2006).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24, 881-897 (2010).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis unraveling causes of adverse neurological outcomes. Repro Sci. 18, 900-907 (2011).
- Bergeron, J. D., et al. White matter injury and autistic like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation. Devel Neurosci. 35, 504-515 (2013).
- Uchida, K., et al. Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice. J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.
