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कुसमयता के मॉडलिंग Encephalopathy चूहे में इंट्रा-एमनियोटिक lipopolysaccharide साथ प्रसव पूर्व हाइपोक्सिया-ischemia का उपयोग

Published: November 20, 2015 doi: 10.3791/53196
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 3,4
1Department of Pediatrics, University of New Mexico, 2Department of Neurosciences, University of New Mexico, 3Department of Neurosurgery, Boston Children's Hospital, 4Department of Neurology, Harvard Medical School

Abstract

कुसमयता की Encephalopathy (eop) सबसे अच्छा अग्रिम अनुवादकीय उद्देश्यों के लिए। अपरिपक्व जन्म के साथ जुड़े असामान्यताएं केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) शामिल एक शब्द है और अपरिपक्व जन्म के साथ जुड़े मस्तिष्क की चोट के लिए नई चिकित्सकीय रणनीति को उजागर, eop की प्रीक्लीनिकल मॉडल इसी तरह के तंत्र को शामिल करना चाहिए जन्म के पूर्व वैश्विक चोट के मनुष्यों में मनाया जाता है और मातृ-अपरा-भ्रूण प्रणाली के कई घटकों को शामिल करना। आदर्श रूप में, मॉडल परिपक्व जानवर में कार्यात्मक घाटे की एक ऐसी ही स्पेक्ट्रम का उत्पादन और pathophysiology के कई पहलुओं पुनरावृत्ति चाहिए। जल्दी अपरिपक्व जन्म में रोगज़नक़ प्रेरित सूजन के साथ जुड़े मानव प्रणालीगत अपरा छिड़काव दोष, अपरा underperfusion और / या chorioamnionitis की नकल करने के लिए, हम इंट्रा-एमनियोटिक lipopolysaccharide (एलपीएस) के साथ संयुक्त प्रसव पूर्व क्षणिक प्रणालीगत हाइपोक्सिया-ischemia (TSHI) का एक मॉडल विकसित किया है। गर्भवती Sprague Dawley चूहों में, TSHI गर्भाशय धमनी रोड़ा ओ के माध्यम सेएन भ्रूण 18 दिन (E18) भ्रूण में सीएनएस नुकसान में वृद्धि के साथ जुड़े एक वर्गीकृत अपरा underperfusion दोष लाती है। इंट्रा-एमनियोटिक एलपीएस इंजेक्शन के साथ संयुक्त, अपरा सूजन बढ़ जाती है और सीएनएस क्षति संबद्ध सफेद पदार्थ, चाल और इमेजिंग असामान्यताओं के साथ बढ़ रहा है। प्रसव पूर्व TSHI और TSHI + एलपीएस जन्म के पूर्व का अपमान न्यूरॉन्स, oligodendrocytes और एक्सोन, subplate की हानि, और अत्यंत पैदा हुए बच्चों में मनाया उन लोगों की नकल है कि वयस्क जानवरों में कार्यात्मक घाटे का नुकसान हो रहा है, अंतर्गर्भाशयी अपमान recapitulating सहित एक eop मॉडल के मानदंडों के कई मिलना अपरिपक्व। इसके अलावा, इस मॉडल अलग-अलग प्रकार के चोट से प्रेरित सूजन के विच्छेदन के लिए अनुमति देता है।

Introduction

37 सप्ताह का अनुमान गर्भावधि उम्र 1 से पहले संयुक्त राज्य अमेरिका में जन्मे शिशुओं में से 12% से अधिक के साथ, कुसमयता से प्रसवकालीन मस्तिष्क की चोट (PBI) स्थायी विकलांगता का एक महत्वपूर्ण कारण है। PBI कुसमयता से, कुसमयता की भी करार दिया मस्तिष्क विकृति (eop), पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को प्रभावित करता है। सीएनएस चोट अक्सर utero में शुरू, और chorioamnionitis और ऐसे हाइपोक्सिया और पूति के रूप में प्रसव के बाद जटिलताओं सहित प्रसव पूर्व प्रक्रियाओं द्वारा exacerbated है। प्रणालीगत अपमान से PBI सक्षम के चिकित्सकों बदल और भावनात्मक विनियमन, स्मृति और कार्यकारी समारोह 1,2 को प्रभावित करने सेरेब्रल पाल्सी, मिर्गी, संज्ञानात्मक देरी और कई neuropsychiatric विकारों की ओर जाता है। बहुत प्रगति की गई है हालांकि, एक सीमित समझ अपरिपक्व जन्म से सीएनएस चोट के सेलुलर और आणविक परिणामों अपरिपक्व जन्म लेते हैं, जो बच्चों में मस्तिष्क संबंधी sequelae की भीड़ के लिए अनुवाद कैसे की बनी हुई है। ज्ञान हिंद की यह कमीवास्तविक समय सीएनएस चोट की गंभीरता का निदान और उभरते हस्तक्षेप के बारे में सूचित खुराक नेताओं। साथ ही, इस कमजोर रोगी आबादी के लिए आयु उपयुक्त चिकित्सकीय रणनीति मायावी रहते हैं।

अंतर्गर्भाशयी सूजन चरम कुसमयता में बहुत आम है और 3 एक जटिल भ्रूण-मातृ-अपरा भड़काऊ झरना शामिल है। अंतर्गर्भाशयी संक्रमण अक्सर लक्षणहीन है। तीव्र सूजन, या histologic chorioamnionitis के साथ संगत विशिष्ट अपरा निष्कर्षों, भ्रूण भड़काऊ प्रतिक्रिया की प्रमुख निर्धारक हैं और अपरिपक्व जन्म 3-5 से जुड़े मस्तिष्क की चोट के साथ संपाती हैं। दरअसल, भ्रूण भड़काऊ प्रतिक्रिया अपरिपक्व जन्म से लंबी अवधि के परिणामों के लिए विशिष्ट नैदानिक ​​निहितार्थ हैं। गर्भावधि उम्र (SGA) या जो संक्रमण के अनुभव के लिए छोटे हैं शिशुओं जो न्यूरोलॉजिकल घाटा 3,4 करने के लिए असाधारण चपेट में हैं। Chorioamnionitis एक ठेठ रोग निदान के बाद अपरिपक्व जन्म है 4 जन्मे शिशुओं से गर्भनालों के 70% में सूजन के लक्षण का पता चलता है। इसके अलावा, chorioamnionitis दो साल 8 में संज्ञानात्मक हानि के साथ जुड़ा हुआ है। अत्यंत अपरिपक्व जन्मे शिशुओं की नाल में मातृ संवहनी underperfusion के साक्ष्य भी बचपन 9 में मस्तिष्क पक्षाघात के साथ जुड़ा हुआ है। chorioamnionitis और अपरा छिड़काव दोषों के synergistic प्रभाव अच्छी तरह से उम्र 10,11 के दो साल में इस मरीज ​​की आबादी में असामान्य तंत्रिका संबंधी परिणामों की उल्लेखनीय उच्च जोखिम से यह साफ है।

रोगज़नक़ प्रेरित सूजन के साथ जुड़े मानव प्रणालीगत अपरा छिड़काव दोषों और chorioamnionitis की नकल करने के लिए, हम चूहों में इंट्रा-एमनियोटिक lipopolysaccharide (एलपीएस) के साथ संयुक्त प्रसव पूर्व क्षणिक प्रणालीगत हाइपोक्सिया-ischemia (TSHI) का एक मॉडल विकसित किया है। हमारा लक्ष्य है, अंतर्गर्भाशयी सूजन शामिल करने के लिए अकेले चूहों 12-16 में TSHI के हमारे मॉडल अनुकूल करने के लिए थाअपरिपक्व जन्म के साथ जुड़े सीएनएस चोट के प्रीक्लीनिकल मॉडलिंग की सुविधा के लिए। TSHI अकेले oligodendroglial वंश कोशिकाओं, cortical न्यूरॉन्स की लगातार नुकसान से पता चला है, जन्म के पूर्व मस्तिष्क की चोट के 16 के साथ लगातार चोट के एक वर्गीकृत पैटर्न के लिए अग्रणी प्रगतिशील इस्कीमिक अंतराल के साथ, कोशिका मृत्यु वृद्धि हुई है, और समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन का स्तर ऊपर उठाया। वे 17-19 उम्र के रूप में इस मॉडल की इस्कीमिक घटकों के लिए संशोधन भी चूहों में स्मृति एन्कोडिंग, लघु और दीर्घकालिक स्मृति और हल्के musculoskeletal परिवर्तन में घाटे का प्रदर्शन किया है। दरअसल, हम पहले से TSHI + एलपीएस के संयोजन oligodendrocyte और neuronal नुकसान, axonal चोट, सेलुलर सूजन और कार्यात्मक असामान्यताओं 20 सहित eop की pathophysiological पहचान, स्मरण दिलाता है कि प्रदर्शन किया है।

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Protocol

संस्थागत देखभाल और उपयोग समितियों दोनों बोस्टन बच्चों के अस्पताल में और न्यू मैक्सिको स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी।

नोट: प्रक्रिया से पहले, सील शुरू करने से, बाँझ और सभी शल्य चिकित्सा उपकरण और शल्य पर्दे आटोक्लेव। इसके अतिरिक्त, 0.125% bipivucaine और 0.1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine सहित बाँझ शीशियों में पोस्ट ऑपरेटिव दवाएं तैयार करते हैं। इसके अलावा sterilely lipopolysaccharide (एलपीएस) समाधान तैयार: 0.04 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस (0111: बी 4) इवान नीले रंग की डाई पतला युक्त बाँझ खारा में।

1. संज्ञाहरण

  1. 3% isoflurane संतुलित 70% नाइट्रोजन और 30% ऑक्सीजन का मिश्रण के साथ एक भ्रूण 18 दिन (E18) गर्भवती Sprague Dawley चूहे में संज्ञाहरण प्रेरित।
  2. प्रेरण कक्ष से चूहे निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट लिपटी शल्य घूम पानी कंबल पर चूहा लापरवाह जगह है। नाक शंकु के लिए संज्ञाहरण स्थानांतरण और isoflura को कम2% करने के लिए पूर्वोत्तर के स्तर।
  3. धीरे कार्निया सुखाने को रोकने के लिए प्रत्येक आंख के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं। प्रक्रिया के दौरान लगातार तापमान, श्वसन दर और जानवर के दिल की दर पर नजर रखने के। मातृ शरीर क्रिया विज्ञान प्रक्रिया के दौरान स्थिर रहना चाहिए।

2. शल्य चिकित्सा तैयारी और सफ़ाई

  1. का प्रयोग छोटे जानवर कतरनी पेट के निचले भाग के क्षेत्र में सभी बाल हटा दें। निपल्स nicking या जी का जन्म पिल्ले के भविष्य के नर्सिंग के लिए परेशान किया जा सकता है कि उस्तरा दाने पैदा करने से बचने के लिए देखभाल के साथ एक आयताकार पैटर्न में दाढ़ी।
  2. बाँझ कपास swabs के साथ povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल में हाथ धोने के आवेदन बारी से पेट की त्वचा तैयार करें। Povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल प्रत्येक फैशन बारी में 3x लागू कर रहे हैं कि इस तरह के हाथ धोने दोहराएँ। सूखाएं।
  3. पैर के अंगूठे चुटकी पलटा के अभाव के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि। दर्द को पलटा और उत्तेजनाओं के अभाव में, 1% isoflurane के स्तर को कम।
  4. बाँझ सर्जिकल तौलिए का उपयोग करना,पशु कपड़ा। वे गर्भाशय सींग के लिए रक्त के प्रवाह को रोकते नहीं whilst अवशोषित सिंचाई तरल पदार्थ की मात्रा को अधिकतम ऐसी है कि एक उचित कोण पर पर्दे के लिए जगह ख्याल रखना।

3. पेट Laparotomy

  1. एक छुरी का उपयोग कर तैयार पेट की त्वचा में एक 3 सेमी midline चीरा बनाते हैं। दो टूक कैंची से पेट प्रावरणी से त्वचा की परत काटना। संदंश और शल्य कैंची का प्रयोग, पेट प्रावरणीय परत तरक्की और पेरिटोनियल गुहा तक पहुंच हासिल करने avascular लिनिया अल्बा के एक चीरा बनाते हैं।
  2. चीरा के बाहरी पर शल्य धुंध की जगह और बाँझ खारा के साथ गीला। पेट पर कुंद संदंश और बाहरी दबाव का प्रयोग, धीरे पेरिटोनियल गुहा से गर्भाशय सींग हटाने और सिक्त धुंध पर व्यवस्था।
  3. ध्यान से उलझाव से बचने और आंतों के साथ संपर्क करें। भ्रूण व्यक्ति एमनियोटिक थैलियों के बीच में ही मांसपेशियों के ऊतकों से संपर्क करके संदंश का उपयोग की व्यवस्था।बेनकाब और कुंद विच्छेदन का उपयोग कर 4 गर्भाशय धमनियों को अलग।
    नोट: देखभाल गर्भाशय धमनियों काटना करने के लिए लिया जाना चाहिए। आसपास के ऊतकों और जहाजों खुद को बेहद नाजुक हैं। मातृ वाहिकाओं को नुकसान खून बह रहा हो, और गंभीर मामलों, भ्रूण और मातृ मृत्यु में कर सकते हैं।

एन्यूरिज्म क्लिप्स 4. प्लेसमेंट

  1. प्रत्येक गर्भाशय धमनी पर एक चूहा 30 जी धमनीविस्फार क्लिप रखें। व्यक्तिगत गर्भनालों सहित गर्भाशय वाहिकाओं के समीपस्थ और बाहर दालों, और काला सहित रक्त प्रवाह, की समाप्ति सुनिश्चित करें। उजागर सींग और धुंध के साथ पूरे शल्य चिकित्सा क्षेत्र को कवर किया और बाँझ खारा के साथ सिंचाई। सिंचाई लगभग हर 10 मिनट के साथ नम क्षेत्र रखने के लिए ध्यान रखना।
  2. 60 मिनट के बाद, धुंध हटाने और क्षेत्र की सिंचाई। गर्भाशय सींग और जहाजों को पर्याप्त रूप से सफल क्लिप हटाने के लिए सिक्त कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। धीरे संदंश का उपयोग कर प्रत्येक धमनीविस्फार क्लिप को हटा दें। पोत को आघात, और Maint पैदा करने के लिए नहीं ख्याल रखनाहटाने के दौरान ऐन ऊतक अखंडता।
  3. अच्छी तरह से एमनियोटिक थैलियों से धुंध के किसी भी आवारा धागे को दूर करने के ख्याल रख रही है, गर्भाशय सींग और क्षेत्र की सिंचाई।

एम्नियोटिक थैलियां करने में lipopolysaccharide 5. इंजेक्शन

  1. प्रत्येक व्यक्ति एमनियोटिक थैली के आधार पर, बस, अपरा प्लेट के लिए पूर्वकाल एमनियोटिक द्रव करने में पतला इवान नीले रंग के साथ एलपीएस (4 माइक्रोग्राम / एसएसी) के 100 μl इंजेक्षन। स्थिर और इंजेक्शन के लिए एक इष्टतम स्थिति के लिए प्रत्येक एमनियोटिक थैली को घुमाने के लिए कुंद संदंश का प्रयोग करें। पतला इवान नीले रंग की डाई उचित सिरिंज प्लेसमेंट और इंजेक्शन की पुष्टि करने में सहायक है कि एक विपरीत एजेंट है।
    नोट: इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शन के लिए संलग्न 8 मिमी 31 जी सुई के साथ उपयोग केवल एक अल्ट्रा ठीक 0.3 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज। बड़े गेज सुई का प्रयोग पुरानी एमनियोटिक द्रव नुकसान, भ्रूण मौत और गर्भावस्था के पुनरवशोषण में परिणाम होगा। सिरिंज के हटाने पर एमनियोटिक द्रव रिसाव की थोड़ी मात्रा mitig किया जा सकता हैएमनियोटिक थैली को सीधा दबाव से पैदा। कुछ चूहे के भ्रूण oligohydramnios की एक डिग्री बर्दाश्त कर सकता है। हालांकि, बड़े गेज सुई, या पुरानी द्रव रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप आकस्मिक पंचर, भ्रूण नुकसान में और गंभीर मामलों में परिणाम है, पड़ोसी गर्भधारण के नुकसान के साथ पंचर से तीव्र एमनियोटिक द्रव नुकसान।
  2. सींग बाँझ खारा के साथ 3x गर्भाशय की सिंचाई।

6. Laparotomy समापन

  1. संदंश का प्रयोग, ध्यान पेरिटोनियल गुहा को गर्भाशय सींग वापसी। एमनियोटिक थैलियों और midline चीरा के बीच पर्याप्त जगह सुनिश्चित करना, एक चल 3-0 रेशम सीवन का उपयोग musculofascial परत किनारों फिर से लगभग। पेशी चीरा बंद करते समय एमनियोटिक थैलियों के स्थान के बारे में पता हो। में या एक थैली के माध्यम से सीवन के लिए नहीं करने के लिए सावधान रहें।
  2. त्वचा की परत को बंद करने, एक चल 3-0 रेशम सीवन का उपयोग, त्वचा की परत को पुन: लगभग।
    नोट: laparotomy अनुमति देने के लिए निरंतर टांके की दो परतों में बंद किया जाना चाहिएत्वचा और गर्भ में वृद्धि के साथ पेशी के विस्तार के लिए। सतत टांके समान रूप से वितरित घाव तनाव के लिए अनुमति देते हैं। कई समुद्री मील परेशान कर रहे हैं और आसानी से संज्ञाहरण से उबरने पर चूहे ने चबाया जा सकता है के रूप में बाधित टांके कम वांछित हैं। सर्जिकल स्टेपल वांछित नहीं हैं। शल्य समुद्री मील की पूंछ बहुत ही कम (<3 मिमी) में कटौती की जानी चाहिए।
  3. एक 26 जी सुई का उपयोग 0.125% Bupivacaine subcutaneously आसपास घाव किनारों के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन। गर्दन के डब में किलो buprenorphine subcutaneously 0.1 मिलीग्राम की एक खुराक / प्रशासन।
  4. Isoflurane और तौलिया सूखी चूहे के रूप में आवश्यक बंद कर दें। स्वच्छ घर पिंजरे में रखें और संज्ञाहरण से वसूली की निगरानी। अल्पताप नहीं बन जाता है चूहे सुनिश्चित करें।

7. पश्चात की वसूली और देखभाल

  1. पिल्ले (लगभग E22 या E23) पैदा कर रहे हैं जब तक दैनिक तो 72 घंटे के लिए चूहे हर 8-12 घंटे की निगरानी करें और। Buprenorphine q8-12 मानव संसाधन / 72 घंटा की अतिरिक्त खुराक प्रशासन या IACUC द्वारा निर्देशित के रूप में PRN।
  2. दर्द, बेचैनी, योनि से खून बह या शल्य साइट से खून बह रहा है के संकेत के लिए चूहों की निगरानी करें। टांके और चीरा का निरीक्षण किया और चूहे चबाने या समय से पहले ही उनकी टांके को दूर नहीं किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना। असाधारण दुर्लभ हैं, उनके टांके समझौता है कि चूहों घाव स्फुटन के लिए खतरा हैं।
    नोट: कभी कभी चूहों बिस्तर या गैर खाद्य वस्तुओं की अत्यधिक मात्रा में ग्रहण कर सकते हैं, buprenorphine प्रशासन का एक पक्ष प्रभाव के रूप में, पिका करार दिया। बहुत ही असामान्य है, चूहों पिका और संभावित बाद में आंत्र रुकावट के लिए निगरानी की जानी चाहिए।

8. ऊतक प्रसंस्करण और Cryosectioning

  1. , Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) प्रसव के बाद मस्तिष्क की धुंधला के लिए तैयार प्रसव के बाद दिन 2 (p2) पर उनके घर के पिंजरे से पिल्ले को दूर करने के लिए। शल्य कैंची धीरे चूहा पिल्ले सिर काटना और का उपयोग कर खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें।
  2. फॉस्फेट बफर खारा में 4% paraformaldehyde के 7 मिलीग्राम से युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में तय मस्तिष्क गिरा(पीबीएस)। 4 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क की जगह और 72 घंटे के लिए तय कर लो।
  3. 72 घंटे के बाद, 30% सूक्रोज युक्त एक बाँझ पीबीएस समाधान करने के लिए दिमाग हस्तांतरण (डब्ल्यू / वी) और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए वापसी।
    नोट: दिमाग sucrose के समाधान में ड्रॉप करने के बाद वे एक cryostat पर sectioned होने के लिए तैयार कर रहे हैं।
  4. तेजी से दिमाग को फ्रीज और जमे हुए राज्याभिषेक वर्गों के अधिग्रहण के लिए cryostat मूसल पर माउंट। 20 माइक्रोन जमे हुए राज्याभिषेक वर्गों में कटौती और स्लाइड पर माउंट। सुनिश्चित करें वर्गों क्रमानुसार एकत्र कर रहे हैं।
  5. स्लाइड रात भर कमरे के तापमान पर सूखे की अनुमति दें। स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड।

9. Hematoxylin और Eosin धुंधला

  1. कमरे के तापमान को स्लाइड घुड़सवार जमे हुए वर्गों और गर्म लो।
    नोट: सभी समाधान ताजा तैयार करें।
  2. 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म स्लाइड सेट पर प्लेस स्लाइड।
  3. स्थानांतरण एक धुंधला रैक करने के लिए स्लाइड। डुबकी (DDH 2 ओ) डबल आसुत विआयनीकृत पानी में 10x स्लाइड।
  4. 5 मिनट के लिए 100% hematoxylin में स्लाइड्स सेते हैं। तिवारीhematoxylin में मुझे बैंगनी धुंधला की डिग्री के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता।
  5. डुबकी स्लाइड नल एच 2 ओ में 4x, और 1 मिनट के लिए 2 हे स्वच्छ नल एच में खड़े हो जाओ।
  6. डुबकी (250 मिलीलीटर 70% इथेनॉल + 1 मिलीलीटर केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड) एसिड शराब में 15x स्लाइड।
  7. डुबकी स्लाइड नल एच 2 ओ में 4x, और 1 मिनट के लिए 2 हे स्वच्छ नल एच में खड़े हो जाओ।
  8. 2 मिनट के लिए 1% लिथियम कार्बोनेट में सेते हैं।
  9. डुबकी स्लाइड नल एच 2 ओ में 4x, और 1 मिनट के लिए 2 हे स्वच्छ नल एच में खड़े हो जाओ।
  10. 1 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में सेते हैं।
  11. डुबकी स्लाइड 100% Eosin में 7x। Eosin में गिरावट की संख्या गुलाबी धुंधला की डिग्री के आधार पर संशोधित किया जा सकता है।
  12. डुबकी स्लाइड 95% इथेनॉल में 5x।
  13. 95% इथेनॉल के एक ताजा परिवर्तन में डुबकी स्लाइड 5x।
  14. 1 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड्स सेते हैं।
  15. 1 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के एक ताजा परिवर्तन में स्लाइड्स सेते हैं।
  16. 15 मिनट के लिए 100% xylene में स्लाइड सेते हैं।
    नोट: ज़ाइलीन कदम औरएक धूआं हुड में हो जाना चाहिए coverslipping।
  17. 15 मिनट के लिए xylene की ताजा परिवर्तन में स्लाइड्स सेते हैं।
  18. Permount साथ coverslip और धूआं हुड में सूखा।
  19. छवि एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड।

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Representative Results

E18 पर TSHI + एलपीएस के बाद, hematoxylin और eosin धुंधला महत्वपूर्ण histopathological नाल दोनों में असामान्यताएं (चित्रा 1) और मस्तिष्क में (चित्रा 2) का पता चलता है। E19 और E21 पर जांच की गर्भनालों पतनिका और भूलभुलैया भर सूक्ष्म नकसीर, और नेक्रोसिस साथ निहायत edematous हैं। उल्लेखनीय सूजन घुसपैठ और बढ़ vascularity भी मनाया जाता है। P2 पर जांच दिमाग ventriculomegaly प्रकट करते हैं, साथ ही सफेद पदार्थ और subplate न्यूरॉन हानि शम्स की तुलना में। इससे पहले, हम TSHI + एलपीएस सूजन लाती है और लगातार सफेद पदार्थ और युवा वयस्कों के 20 में महत्वपूर्ण मोटर हानि के साथ सहवर्ती axonal असामान्यताएं है कि पैदावार की सूचना दी है। TSHI + एलपीएस भी काफी पोटेशियम क्लोराइड सह ट्रांसपोर्टर P15 पर कोर्टेक्स में 2 (KCC2) प्रोटीन अभिव्यक्ति, γ aminobutyric एसिड का विकास (गाबा) ergic निषेध करने के लिए केंद्रीय एक क्लोराइड सह ट्रांसपोर्टर, (चित्रा 3 कम हो जाती है 13 में अकेले TSHI के प्रभाव से हमारे पूर्व रिपोर्ट के साथ संगत कर रहे हैं।

चित्र 1
चित्रा 1:। TSHI + एलपीएस नाल में महत्वपूर्ण ऊतकीय असामान्यताएं लाती भ्रूण 18 दिन (E18) पर गर्भाशय हाइपोक्सिया-ischemia और इंट्रा-एमनियोटिक एलपीएस प्रशासन में क्षणिक के बाद, E19 TSHI + एलपीएस भ्रूणों (बी) से गर्भनालों रक्तस्राव के साथ निहायत edematous हैं (तीर), गल जाना और बढ़ भड़काऊ दिखावा की तुलना में घुसपैठ (ए, पैमाने बार = 100 माइक्रोन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2:। TSHI + एलपीएस मस्तिष्क में महत्वपूर्ण ऊतकीय असामान्यताएं लाती भ्रूण 18 दिन (E18), प्रसव के बाद ventriculomegaly, subplate न्यूरॉन और सफेद पदार्थ नुकसान पर गर्भाशय हाइपोक्सिया-ischemia और इंट्रा-एमनियोटिक एलपीएस प्रशासन में क्षणिक निम्न के अधीन पिल्ले में मनाया जाता है तीव्रता से इस p2 पर दिखावा (ए) की तुलना में दोहरी TSHI + एलपीएस (बी)। (स्केल बार = 100 माइक्रोन; सपा = subplate; WM = सफेद पदार्थ, एल.वी. = पार्श्व वेंट्रिकल) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: TSHI + एलपीएस KCC2 अभिव्यक्ति को कम कर देता मेम से प्रदर्शन पश्चिमी blots।भ्रूण 18 दिन पर गर्भाशय क्षणिक प्रणालीगत हाइपोक्सिया-ischemia और इंट्रा-एमनियोटिक एलपीएस प्रशासन में सूक्ष्म विच्छेदित cortical ऊतक, शो के brane तैयारी (E18) काफी के विकास के लिए केंद्रीय KCC2, एक न्यूरॉन विशिष्ट पोटेशियम क्लोराइड सह ट्रांसपोर्टर की अभिव्यक्ति कम कर देता है प्रसव के बाद दिन 15. पर एकीकृत मस्तिष्क सर्किट और निषेध, (एन = 6-10, ± SEM, छात्र के टी-परीक्षण, * पी <0.05 मतलब है)।

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Discussion

कुसमयता की Encephalopathy क्योंकि चोट के तंत्र ओवरलैपिंग etiologies, neurodevelopmental समय बेशक, मानव मस्तिष्क नेटवर्क के गठन की जटिलता, की जटिल बातचीत के जानवरों में मॉडल के लिए मुश्किल है, और सीएनएस के विविध phenotypes मानव अपरिपक्व शिशुओं में प्रकट अपमान। Eop विशेष सेल प्रकार कमजोरियों के साथ जुड़ा हुआ है (यानी अपरिपक्व oligodendrocytes) 21, साथ ही विविध विकासात्मक विनियमित रास्ते (यानी subplate, झिल्ली ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर सब यूनिटों) 12,13,22। पशु मॉडल के रूप में संभव के रूप में बारीकी से मानव की स्थिति को दोहराने हालांकि, जब महत्वपूर्ण प्रगति की जा सकती है। यहाँ, हम एक मॉडल ग्रे और सफेद पदार्थ नुकसान और वसूली दोनों के बाद के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, अपरिपक्व शिशु में मनाया सीएनएस चोट के तंत्र की विविधता को शामिल किया गया है कि एक जन्म के पूर्व का अपमान विकसित की है। इंसानों में, आरोही जीवाणु संक्रमण भ्रूणावरण और precipita कमजोरझिल्ली के ते समय से पहले टूटना। इसके अतिरिक्त, अपरा छिड़काव दोष अपरा इंटरफेस तनाव और अपरा समस्थिति बाधित। इस प्रकार, अपरा underperfusion एक अंतर्गर्भाशयी संक्रमण से सीएनएस चोट यौगिकों। इसमें शक नहीं, यह है कि वे एक डुप्लेक्स गर्भाशय के रूप में कृन्तकों में chorioamnionitis पूर्व में होना है कि जीवाणु संक्रमण आरोही की आम नैदानिक ​​परिदृश्य मॉडल करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। प्रत्येक गर्भाशय सींग अपने स्वयं के गर्भाशय ग्रीवा है, और कई गर्भधारण में एक बार किया जाता है। इन चुनौतियों के बावजूद, प्रीक्लीनिकल मॉडल मातृ-अपरा-भ्रूण इकाई के कई घटकों को शामिल करना और विभिन्न डिग्री के लिए गर्भाशय सूजन में शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया है। कोई व्यक्ति प्रीक्लीनिकल मॉडल हर विशिष्ट परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए आदर्श है, यहाँ बताया मॉडल सेलुलर और आणविक असामान्यताओं, व्यवहार और कार्यात्मक हानि, मातृ-अपरा-भ्रूण प्रणाली है, और अंतर्गर्भाशयी संक्रमण और इतने एमए के लिए आम अपरा सूजन घटक को शामिल किया गयाएनवाई अपरिपक्व 20,23 जन्मों।

इस्तेमाल किया प्रजातियों के चुनाव प्रजातियों से उत्पन्न निहित सीमाओं के संदर्भ में eop प्रभावों प्रयोगात्मक डेटा की व्याख्या करने के लिए मॉडल। सरल शब्दों में, जन्म सभी जानवरों को 24 के पार सीएनएस विकास के समान अंक के लिए समानता नहीं है। चूहों में पिल्ला अस्तित्व में काफी अनुभवहीन या जोर दिया बांधों में कमी आई है, हालांकि यहां वर्णित मॉडल, गर्भवती चूहों और चूहों दोनों में प्रदर्शन किया जा सकता है। हमारे पूर्व रिपोर्टों, जन्म (P0) पर चूहों में भ्रूण हानि के साथ लगातार अकेले दिखावा, एलपीएस और TSHI की तुलना में TSHI + एलपीएस जानवरों (लगभग 40%) में वृद्धि हुई है, लेकिन जीवित पिल्ले P28 20 के माध्यम से महत्वपूर्ण वजन मतभेद प्रदर्शन नहीं करते। प्रजातियों के बीच अंतर करने के लिए भी इसी तरह, गर्भ के दौरान चोट के समय वंश की neurodevelopmental प्रक्षेपवक्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका है। प्रसार, प्रवास और diffe के तंत्रिका कोशिका विकास के चरणों के spatiotemporal विनियमनrentiation विभिन्न स्तनधारियों 24-26 के बीच अलग है। ये सेल विशिष्ट विकास कार्यक्रमों की चोट के जोखिम को प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, अपरिपक्व जन्म के समय के साथ oligodendrocyte वंश और GABAergic न्यूरोनल विकास के समय के ओवरलैप प्रसवकालीन अपमान 27-29 करने के लिए विशेष रूप से अतिसंवेदनशील इन कोशिकाओं में आता है। इस प्रकार, इस मॉडल E18 चूहों में विकसित किया गया था (और सफलतापूर्वक एक C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर E17 चूहों को अनुवाद) इस समय 23-25 ​​सप्ताह के गर्भ के 20 में से पहले की अत्यंत अपरिपक्व जन्म मानव शिशुओं में होता है कि अंतर्गर्भाशयी वैश्विक जन्म के पूर्व का अपमान करने के लिए संगत के रूप में । हम पहले O4-immunoreactive अपरिपक्व oligodendrocytes सबसे अधिक विकास 16 के इस स्तर पर प्रभावित कर रहे हैं दिखाया। उनके नुकसान अन्य जांचकर्ताओं द्वारा 30 O4 + और ​​पिछली रिपोर्टों के साथ संगत वंश, 16 की O1 + चरणों में सबसे उल्लेखनीय कटौती के साथ कमी आई है, अस्तित्व और परिपक्वता के साथ 14 संबद्ध। अतिरिक्त, हम subplate के समय से पहले हानि, कम KCC2 अभिव्यक्ति, कम जब्ती सीमा और dysregulated GABAergic अपरिपक्व शिशुओं 31 में संकेत के साथ संगत बिगड़ा चाल 12,13,15 प्रदर्शन किया है।

यहाँ वर्णित मॉडल अपरिपक्व जन्म 23 से प्रसवकालीन मस्तिष्क की चोट का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कृन्तकों में पिछले मॉडल पर कई लाभ प्रदान करता है। यह पूरे मातृ-अपरा-भ्रूण प्रणाली को शामिल किया और मस्तिष्क और अपरा चोट दोनों का कारण बनता है। हम पहले दिखावा के बीच तुलना को प्रकाशित किया है, TSHI अकेले हम अकेले हैं एलपी और TSHI + LPS और वर्गीकृत TSHI 16 के साथ कार्यात्मक परिणामों और जैव रसायन में 20, और मतभेदों में मतभेद। एकतरफा मन्या ligations और नवजात चूहों में प्रणालीगत हाइपोक्सिया की पूर्व जांच, प्रत्यक्ष translational और नैदानिक ​​releva (ischemia के अपरिपक्व oligodendrocytes की संवेदनशीलता यानी) कई pathophysiological प्रक्रियाओं में यंत्रवत अंतर्दृष्टि बहाया है, जबकिइस तरह के मॉडल के लिए nce कम मजबूत है। वर्णित अनुप्रयोगों के अलावा, यहां वर्णित मॉडल नेक्रोतिज़िंग आंत्रशोथ (एनईसी), हृदय, फेफड़े, गुर्दे और हाईपोथेलेमिक पिट्यूटरी अक्ष में शिथिलता सहित कुसमयता से प्रभावित अन्य अंग प्रणालियों की जांच के लिए एक जानकारीपूर्ण उपकरण हो सकता है। एलपीएस औषध विज्ञान की जटिलताओं और मातृ और भ्रूण फार्माकोडायनामिक्स में मतभेद के कारण, बांधों में intraperitoneal एलपीएस इंजेक्शन यहाँ दिखाया ही भ्रूण भड़काऊ प्रतिक्रिया का उत्पादन होने की संभावना है। इसके अलावा, एलपीएस मज़बूती से 20,32 नाल पार नहीं करता है। इससे पहले, हम एलपीएस के प्रत्यक्ष ग्रीवा आवेदन और अन्य माउस मॉडल 33 में वर्णित किया गया है क्या करने के लिए इसी तरह की अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन का प्रयास किया। हालांकि, हम सीएनएस चोट की मृत्यु दर और विसंगति काफी एक ही कूड़े के भीतर पिल्ले के बीच बढ़ जाता है। इधर, 4 माइक्रोग्राम / थैली की खुराक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था। AMN को दिलाई एलपीएस की खुराक में वृद्धिबढ़ी हुई भ्रूण मृत्यु दर में iotic डिब्बे का परिणाम है। एलपीएस यह सक्रिय जीवाणु संक्रमण और रोगज़नक़ प्रसार से जुड़े जोखिम के कारण के बिना टोल की तरह रिसेप्टर 4 के माध्यम से भड़काऊ सिगनल को सक्रिय करता है कि में ठेठ अंतर्गर्भाशयी ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के साथ प्रत्यक्ष संक्रमण अधिक लाभ है। हालांकि, इस मॉडल समूह बी अपरा और नयूरोपथोलोगिकल असामान्यताओं का कारण बनता है जो स्ट्रेप्टोकोकस, और चूहों 34 में ऑटिस्टिक की तरह व्यवहार सहित मानव गर्भनालों, से अलग आम रोगजनकों और जीवों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसी तरह, Ureaplasma लिपोप्रोटीन बहु-बंधी प्रतिजन Ureaplasma प्रजातियों संक्रमण अनुकरण कर सकते हैं। Ureaplasma मानव chorioamnionitis 35 का सबसे आम कारण है इसलिये भी भविष्य की जांच के लिए एक अवसर हो सकता है। अधिक निष्क्रिय-संक्रामक एजेंटों उपलब्ध हो जाते हैं, यह है कि वे विभिन्न सक्षम के चिकित्सकों और न्यूरो reparative हस्तक्षेप की प्रभावकारिता को प्रभावित कैसे निर्धारित करने के लिए जानकारीपूर्ण किया जाएगा।

इस मॉडल की सीमाएं इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शन से एमनियोटिक द्रव नुकसान शामिल है। कोई प्रभाव नहीं बाँझ खारा का इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शन के साथ उल्लेख किया जाता है, इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग की गई सुई का गेज एक महत्वपूर्ण तकनीकी तत्व है। देखभाल के 5% से भी कम मातृ मृत्यु दर के साथ घाव स्फुटन, आंत्र बाधा, पेरिटोनिटिस और गर्भावस्था का पूरा नुकसान, सहित, अत्यंत दुर्लभ हैं laparotomy से संबंधित मां चूहे में सुई से बड़ा 31 जी शल्य जटिलताओं का उपयोग करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों दान Firl, क्रिस कॉर्बेट और जेसी Denson, पीएचडी के लिए आभारी हैं। अनुदान एसआर एनआईएच NINDS R01 NS060765 द्वारा प्रदान की गई थी, एलजे के लिए P30 COBRE पायलट कार्यक्रम और न्यू मैक्सिको विश्वविद्यालय में एलजे के लिए बाल स्वास्थ्य हस्ताक्षर कार्यक्रम।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline Solution, 0.9% Sigma S8776
LPS 011B4 Sigma L2630
Evan's Blue Dye Sigma E2129
Surgical gloves Biogel 40870
OR Towels Cardinal Health 287000-008 Sterile
PDI Alcohol Prep Pads Fisherbrand 06-669-62
Mini Arco Rechargeable Clippers Kent Scientific Corp. CL8787
Betadine surgical scrub Purdue Products L.P. 67618-151-17
Eye Lubricant Refresh Lacri Lube 00023-0312
Blunt Forceps Roboz RS-8100
Scissors Roboz RS-6808
Surgical Scissors Roboz RS-5880
Surgical Scissors F.S.T. 14002-16
Syringe BD 309628 1 ml
Needle BD 305122 25G 5/8
Needle BD 305128 30G 1
Cotton-tipped Applicators Fisherbrand 23-400-114 Small, 6 inch sterile
Cotton Gauze Sponge Fisherbrand 22-362-178
Needle Holders Kent Scientific Corp. INS600109 12.5 CM STR
Vessel Clips Kent Scientific Corp. INS600120 30G Pressure
3-0 Perma Hand Silk Sutures Ethicon 1684G Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable,  PS-1 24 mm needle, 3/8 circle
Insulin Syringes BD 328438 0.3 cc 3 mm 31G
Pentobarbital
Buprenorphine
Bupivacaine
Isoflurane
Lithium Carbonate Acros Chemicals 554-13-2
Superfrost Plus Microscope Slides VWR 48311-703
Hematoxylin Leica 3801521 Surgipath Gill II Hematoxylin
Eosin Leica 3801601 Surgipath Eosin
Xylenes Fisherbrand X3S-4 Histological Grade
Permount Fisherbrand SP15-100
Coverglass Fisherbrand 12-548-5P Fisher Finest Premium Coverglass

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References

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चिकित्सा अंक 105 सूजन इंट्रा-एमनियोटिक, चूहे chorioamnionitis नाल अपरिपक्व अंतर्गर्भाशयी
कुसमयता के मॉडलिंग Encephalopathy चूहे में इंट्रा-एमनियोटिक lipopolysaccharide साथ प्रसव पूर्व हाइपोक्सिया-ischemia का उपयोग
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Jantzie, L. L., Winer, J. L.,… More

Jantzie, L. L., Winer, J. L., Maxwell, J. R., Chan, L. A. S., Robinson, S. Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats. J. Vis. Exp. (105), e53196, doi:10.3791/53196 (2015).

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