Abstract
Encefalopati hos premature (EoP) er et begrep som omfatter sentralnervesystemet (CNS) misdannelser assosiert med for tidlig fødsel. Til beste forhånd translasjonsforskning mål og avdekke nye terapeutiske strategier for hjerneskade i forbindelse med for tidlig fødsel, må prekliniske modeller for EoP inkludere lignende mekanismer av prenatal global skade observert hos mennesker og involvere flere komponenter i mors-placenta-føtal system. Ideelt sett bør modeller fremstille et tilsvarende spektrum av funksjonelle mangler i de modne dyr og rekapitulere flere aspekter av den patofysiologi. Å etterligne menneskelige systemiske placental blod defekter, morkake underperfusion og / eller korioamnionitt forbundet med patogen-indusert betennelser i tidlig tidlig fødsel, utviklet vi en modell av prenatal transient systemisk hypoksi-iskemi (TSHI) kombinert med intra-fostervann lipopolysakkarid (LPS). Hos drektige Sprague Dawley rotter, TSHI via livmor arterieokklusjon on embryonale dag 18 (E18) induserer en gradert morkake underperfusion feilen forbundet med økende CNS skader hos fosteret. Når det kombineres med intra-amniotiske LPS injeksjoner, er placenta betennelse økt og CNS skade er forsterket med tilhørende hvit substans, gangart og bilde unormalt. Prenatal TSHI og TSHI + LPS prenatal fornærmelser møte flere av kriteriene for en EoP modell inkludert rekapitulere intrauterine fornærmelse, forårsaker tap av nerveceller, oligodendrocytter og aksoner, tap av subplate og funksjonelle underskudd i voksne dyr som etterligner de som ble observert hos barn født ekstremt preterm. Videre tillater denne modellen for disseksjon av betennelse indusert av avvikende skadetyper.
Introduction
Med over 12% av barn født i USA før 37 uker estimert svangerskapslengde 1, er perinatal hjerneskade (PBI) fra prematuritet en vesentlig årsak til varig uførhet. PBI fra prematuritet, også kalt encefalopati hos premature (EoP), påvirker hele sentralnervesystemet (CNS). CNS skade ofte starter i utero, og blir forverret av svangerskaps prosesser, inkludert korioamnionitt og postnatal komplikasjoner som hypoksi og sepsis. PBI fra systemiske fornærmelser endrer neurodevelopment og fører til cerebral parese, epilepsi, kognitiv forsinkelse og mange nevropsykiatriske lidelser påvirker emosjonell regulering, hukommelse og utøvende funksjon 1,2. Selv om mye fremgang har blitt gjort, er fortsatt en begrenset forståelse av hvordan de cellulære og molekylære konsekvensene av CNS skade fra tidlig fødsel sette til mangfoldet av nevrologiske følgetilstander hos barn som er født for tidlig. Denne mangelen på kunnskap hinders sanntid diagnostisering av CNS skadegrads og informert dosering av nye intervensjoner. I tillegg alderstilpassede terapeutiske strategier for denne sårbare pasientgruppen forblir unnvikende.
Intrauterin betennelse er svært vanlig i ekstrem prematuritet og innebærer en kompleks fetal-maternal-morkake inflammatorisk kaskade tre. Intrauterin infeksjon er ofte subklinisk. Spesifikke placenta funn forenlig med akutt betennelse, eller histologisk korioamnionitt, er viktige faktorer som bestemmer fosterets inflammatorisk respons og er sammenfallende med hjerneskade i forbindelse med for tidlig fødsel 3-5. Faktisk har fosterets betennelsesreaksjon distinkte kliniske implikasjoner for langsiktige resultater fra tidlig fødsel. Spedbarn som er små i forhold til gestasjonsalder (SGA) eller som opplever infeksjon er svært sårbare for nevrologiske underskudd 3,4. Korioamnionitt er en typisk patologisk diagnose følgende tidlig fødsel
Å etterligne menneskelige systemiske placenta perfusjon feil og korioamnionitt forbundet med patogen-indusert betennelser, utviklet vi en modell av prenatal transient systemisk hypoksi-iskemi (TSHI) kombinert med intra-fostervann lipopolysakkarid (LPS) hos rotter. Vårt mål var å tilpasse vår modell av TSHI alene rotter 12-16 å inkludere intrauterin betennelse,å legge til rette preklinisk modellering av CNS skade i forbindelse med for tidlig fødsel. TSHI alene har avdekket vedvarende tap av oligodendroglial avstamning celler, kortikale nevroner, økt celledød, og forhøyet proinflammatoriske cytokin nivåer, med progressive iskemiske intervaller som fører til en gradert mønster for skader forenlig med prenatal hjerneskade 16. Endringer i iskemiske komponentene i denne modellen har også vist underskudd i minnet koding, på kort og lang sikt minne og milde muskel- endringer hos rotter som de alder 17-19. Faktisk har vi tidligere vist at kombinasjonen av TSHI + LPS rekapitulerer de patofysiologiske kjennetegnene til EoP, inkludert oligodendrocyte og neuronal tap, aksonal skade, mobilnettet betennelse og funksjonelle avvik 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institusjonelle Care og bruk komiteer både Boston Children Hospital og University of New Mexico Health Sciences senter godkjent alle eksperimentelle prosedyrer.
MERK: Før du starter prosedyren, sel, sterilisere og autoklav alle kirurgiske instrumenter og kirurgiske forheng. I tillegg forberede postoperative medisiner i sterile ampuller inkludert 0,125% bipivucaine og 0,1 mg / kg buprenorfin. Også forberede lipopolysakkarid (LPS) løsning sterilely: 0,04 mg / ml LPS (0111: B4) i sterilt saltvann som inneholder utvanne Evans blått fargestoff.
1. Anestesi
- Indusere anestesi i et embryodag 18 (E18) gravid Sprague Dawley rotter med en blanding av 3% isofluran balanserte 70% nitrogen og 30% oksygen.
- Fjern rotte fra induksjonskammeret og plasser rotte liggende på drapert kirurgisk sirkulerende vann teppe satt ved 37 ° C. Overfør anestesi til nesen membran og redusere isoflurane nivå til 2%.
- Gjelde forsiktig oftalmisk salve til hvert øye for å hindre hornhinnen tørking. Under prosedyren kontinuerlig overvåke temperaturen, pusterytme og puls av dyret. Maternal fysiologi bør forbli stabil gjennom hele prosedyren.
2. Kirurgisk Prep og Scrub
- Ved hjelp av små dyr clippers fjerne alt hår i nedre mageregionen. Barbere i et rektangulært mønster med forsiktighet for å unngå nicking brystvorter eller generere barberhøvel utslett som kan være irriterende for fremtidig pleie av levende fødte valper.
- Forbered abdominal hud ved alternerende bruk av povidon-jod og 70% etanol skrubb med sterile bomullspinner. Gjenta skrubb slik at povidon-jod og 70% etanol er hver søkt 3x i vekslende mote. La tørke.
- Bekreft anestesidybden via fravær av toe-pinch refleks. I fravær av refleks og stimuli til smerte, redusere isofluran nivå til 1%.
- Bruke sterile kirurgiske håndklær,drapere dyret. Vær nøye med å plassere gardiner på et passende vinkel slik at de maksimere mengden irrigasjonsfluidum de absorberer samtidig ikke hindrer blodtilførselen til livmor horn.
3. Abdominal Laparotomi
- Ved hjelp av en skalpell lage en 3 cm midtlinjesnitt i den utarbeidede abdominal hud. Omsvøp dissekere hudlaget fra abdominal fascia med saks. Bruk pinsett og kirurgiske sakser, heve abdominal fascial lag og gjør et snitt av avascular linea alba å få tilgang til bukhulen.
- Plasser kirurgisk kompress på utsiden av snittet og fuktes med sterilt saltvann. Med butte pinsett og ytre press på magen, livmor horn forsiktig fjerne fra bukhulen og ordne på fuktet gasbind.
- Unngå nøye forviklinger og ta kontakt med tarmene. Ordne fostre med tang ved å kontakte eneste muskelvevet i mellom enkeltfosterblærer.Avsløre og isolere de 4 livmor arterier ved hjelp av stump disseksjon.
MERK: Man må passe på å dissekere livmor arterier. Omkringliggende vev og fartøy selv er svært delikat. Skade på mors årene kan forårsake blødninger, og i alvorlige tilfeller, fosterets og mors død.
4. Plassering av aneurisme klipp
- Plasser en rotte 30 G aneurisme klipp på hver livmor arterie. Sikre opphør av blodstrøm, inkludert nære og fjerne pulser, og mørkere livmor skipene inkludert individuelle placentas. Dekke utsatte horn og hele kirurgiske feltet med gasbind og vanne med sterilt saltvann. Vær nøye med å holde feltet fuktig med vanning omtrent hver 10 min.
- Etter 60 min, ta av gasbind og vanne banen. Sørg for at livmor horn og fartøy er tilstrekkelig fuktet for vellykket klipp fjerning. Fjerne hver aneurisme klipp forsiktig ved bruk av tang. Pass på å ikke forårsake skade på fartøyet, og maintain vev integritet under fjerning.
- Grundig vanne livmor horn og felt, ta vare å fjerne noen streif tråder av gasbind fra fosterblærer.
5. Injeksjon av Lipopolysaccharide i å Amniotic Sacs
- I bunnen av hver enkelt fostervann sac, bare anteriore til placental plate, injisere 100 ul LPS (4 ug / sekk) med fortynnet Evans blått fargestoff i å fostervann. Bruk butt pinsett til å stabilisere og rotere hver fostervann sac i en optimal posisjon for injeksjon. Fortynnet Evans blått fargestoff er et kontrastmiddel som er nyttig i bekrefter riktig sprøyte plassering og injeksjon.
MERK: Bruk bare en ultra-fine 0,3 ml insulinsprøyte med vedlagt 8 mm 31 G nål for intra-foster injeksjoner. Bruke større sporvidde nåler vil resultere i kroniske fostervann tap, fosterdød og reabsorpsjon av svangerskapet. Små mengder av fostervann lekkasje ved fjerning av sprøyten kan være mitigrerte ved direkte press mot fostersekken. Noen rottefostre kan tolerere en grad av oligohydramnios. Men akutt fostervann tapet fra punktering med store måle nåler eller utilsiktet punktering som resulterer i kronisk væskelekkasje, resultater i foster tap og i alvorlige tilfeller, tap av nabo svangerskap. - Vanne livmor horn 3x med sterilt saltvann.
6. Lukke Laparotomi
- Ved hjelp av pinsett, forsiktig tilbake livmorhornene til bukhulen. Sikre tilstrekkelig plass mellom fosterblærer og midtlinjesnitt, re-tilnærme de musculofascial lags kantene med en løpende 3-0 silke sutur. Vær oppmerksom på plasseringen av fosterblærer under lukking muskelen snittet. Vær nøye med å ikke å sy inn i eller gjennom en sac.
- Re-tilnærmet hudlaget, ved hjelp av en løpende 3-0 silke sutur, lukke hudlaget.
MERK: laparotomi skal være stengt i to lag med kontinuerlige sting for å tillatefor hud og muskel utvidelse med økende svangerskapet. Kontinuerlige sting tillate jevnt fordelt såret spenning. Avbrutte sting er mindre ønsket som flere knop er irriterende og kan lett tygges av rotte på å komme seg etter anestesi. Kirurgiske stifter er ikke ønskelig. Haler av de kirurgiske knop bør kuttes svært kort (<3 mm). - Injisere 1 ml 0,125% bupivacain subkutant på sårkantene ved hjelp av en 26 G nål. Administrer én dose på 0,1 mg / kg buprenorfin subkutant i nakken.
- Slå av isofluran og håndkle tørt rotte som nødvendig. Plassere i rent hjem bur og overvåke utvinning fra anestesi. Sikre rotte blir ikke hypotermisk.
7. Postoperativ Recovery og omsorg
- Overvåke rotte hver 8-12 timer i 72 timer og deretter hver dag frem til valpene er født (ca. E22 eller E23). Administrere flere doser av buprenorfin q8-12 hr / 72 timer eller PRN som diktert av IACUC.
- Overvåke rotter for tegn på smerte, ubehag, vaginal blødning eller blødning fra operasjonsstedet. Inspiser sting og snitt og ta vare å sikre rotte er ikke tygge eller fjerne sine sting tidlig. Selv om svært sjeldne, rotter som kompromittere sine sting er i faresonen for sårruptur.
MERK: Av og til rotter kan innta store mengder av sengetøy eller ikke-matvarer, betegnes pica, som en bivirkning av buprenorfin administrasjon. Selv om svært uvanlig, må rotter overvåkes for pica og potensiell påfølgende tarmobstruksjon.
8. Tissue Processing og Cryosectioning
- For å forberede Hematoxylin & eosin (H & E) farging av postnatal hjernen, fjerne valper fra sine hjem bur på postnatal dag 2 (P2). Ved hjelp av kirurgisk saks halshogge rotteunger og forsiktig fjerne hjernen fra skallen.
- Slipp fix hjerne i en 15 ml konisk rør inneholdende 7 ml av 4% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann(PBS). Plassere hjernen ved 4 ° C og fikse for 72 timer.
- Etter 72 timer, overføre hjernen til en steril PBS-løsning inneholdende 30% sukrose (vekt / volum) og vende tilbake til 4 ° C.
MERK: Når hjernen slippe i sukroseløsning de er klare til å bli delt på en kryostat. - Raskt fryse hjerner og montere på kryostat stampe for erverv av frosne koronalsnitt. Skjær 20 mikrometer frosne koronalsnitt og montere på lysbilder. Sørg seksjoner er samlet i serie.
- Tillat lysbilder for å tørke ved romtemperatur over natten. Oppbevares lysbilder ved -20 ° C.
9. Hematoxylin & eosin Farging
- Ta sklie montert frosne snitt og varm til romtemperatur.
MERK: Klargjør alle løsninger frisk. - Plasser lysbilder på et lysbilde varmere satt til 50 ° C i 2 timer.
- Overføring lysbilder til en farging rack. Dip glir 10x i dobbel-destillert deionisert vann (DDH 2 O).
- Inkuber objektglass i 100% hematoxylin i 5 min. Timeg i hematoxylin kan optimaliseres avhengig av graden av lilla flekker.
- Dypp lysbilder 4x i springen H 2 O, og la stå i ren springen H 2 O for 1 min.
- Dip glir 15x i syre-alkohol (250 ml 70% etanol + 1 ml konsentrert saltsyre).
- Dypp lysbilder 4x i springen H 2 O, og la stå i ren springen H 2 O for 1 min.
- Inkuber i 1% litiumkarbonat i 2 min.
- Dypp lysbilder 4x i springen H 2 O, og la stå i ren springen H 2 O for 1 min.
- Inkuber i 95% etanol i 1 min.
- Dypp lysbilder 7x i 100% eosin. Antall fall i Eosin kan endres avhengig av graden av rosa flekker.
- Dypp lysbilder 5x i 95% etanol.
- Dip glide 5x i en ny endring av 95% etanol.
- Inkuber objektglass i 100% etanol i 1 min.
- Inkuber objektglass i en ny endring av 100% etanol i 1 min.
- Inkuber objektglass i 100% xylen i 15 min.
MERK: Xylen trinn ogcoverslip bør skje i en avtrekkshette. - Inkuber lysbilder i ferske endringer xylen for 15 min.
- Dekkglass med Permount og la tørke i avtrekkshette.
- Bildeobjektglass med et lysmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter TSHI + LPS på E18, hematoxylin og eosin farging avslører betydelige histopatologiske unormalt i både placenta (figur 1) og i hjernen (figur 2). Placentas undersøkt på E19 og E21 er grovt ødematøst med micro-blødning, og nekrose i hele decidua og labyrinten. Betydelig inflammatorisk infiltrat og økt vaskularitet er også observert. Hjerner undersøkt på P2 avsløre ventriculomegaly, samt hvit substans og subplate nevron tap i forhold til Shams. Tidligere har vi rapportert at TSHI + LPS induserer inflammasjon og gir vedvarende hvit substans og aksonale unormalt samtidige med sterk motor nyrefunksjon hos unge voksne 20. TSHI + LPS også en betydelig reduksjon av kaliumklorid ko-transportør 2 (KCC2) proteinekspresjon, et klorid ko-transportør sentral for utviklingen av γ-aminosmørsyre (GABA) erg inhibering, i cortex ved P15 (figur 3 13.
Figur 1:. TSHI + LPS induserer signifikante histologiske avvik i morkaken Etter forbi utero hypoksi-iskemi og intra-fostervann LPS administrasjon på embryonale dag 18 (E18), placentas fra E19 TSHI + LPS fostre (B) er grovt ødematøst med blødning (piler), nekrose og økt inflammatorisk infiltrat sammenlignet med sham (A, skala bar = 100 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. TSHI + LPS induserer signifikante histologiske avvik i hjernen Etter forbi utero hypoksi-iskemi og intra-fostervann LPS administrasjon på embryonale dag 18 (E18), postnatal ventriculomegaly, subplate nevron og hvit substans tap er observert i valper som utsettes for dual TSHI + LPS (B) sammenlignet med sham (A) akutt på P2. (Scale bar = 100 mikrometer; Sp = subplate; WM = hvit substans; LV = lateral ventrikkel) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: TSHI + LPS reduserer KCC2 uttrykk Western blot utføres fra mem.Brane preparater av mikro dissekert kortikalt vev, showet i utero transient systemisk hypoksi-iskemi og intra-fostervann LPS administrasjon på embryonale dag 18 (E18) reduserer uttrykk for KCC2, et nevron-spesifikk kaliumklorid co-transporter sentralt i utviklingen av integrerte cerebrale kretser og hemming, på postnatal dag 15. (n = 6-10, gjennomsnitt ± SEM, t-test, * p <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Encefalopati hos premature er vanskelig å modellere i dyr på grunn av et komplekst samspill mellom årsaker, neurodevelopmental tid selvfølgelig, intricacy av menneskets hjerne nettverksdannelse, overlappende skademekanismer, og de ulike fenotyper av CNS fornærmer manifest i menneskelige premature barn. EoP er assosiert med spesifikke celle-type sårbarheter (dvs. umodne oligodendrocytter) 21, samt diverse utviklingshemmede regulerte trasé (dvs. subplate, membran transportører og reseptorsubenheter) 12,13,22. Imidlertid kan betydelige fremskritt gjøres når dyremodeller gjenskape den menneskelige tilstand så tett som mulig. Her har vi utviklet en modell en prenatal fornærmelse som inkorporerer heterogenitet av mekanismer av CNS skade observert i tidlig fødte barn, noe som åpner for etterfølgende evaluering av både grå og hvit substans skade og utvinning. Hos mennesker stigende bakterielle infeksjoner svekke amnion og utfeltte for tidlig vannavgang. I tillegg placental perfusjon defekter reke placenta grensesnitt og forstyrre morkake homeostase. Dermed forbindelser morkake underperfusion CNS skade fra en intrauterin infeksjon. Unektelig, er det utfordrende å modellere vanlig klinisk scenario av stigende bakterielle infeksjoner som foran korioamnionitt hos gnagere som de har en tosidig livmor. Hver livmor horn har sin egen livmorhals, og flere svangerskap blir gjennomført på en gang. Til tross for disse utfordringene, har prekliniske modeller blitt tilpasset til å involvere flere komponenter i mors-placenta-føtal enhet og innlemme i utero betennelse til ulike grader. Selv om ingen individuell preklinisk modellen er ideell for å teste hver bestemt hypotese, modellen beskrevet her omfatter de cellulære og molekylære forstyrrelser, atferdsmessige og funksjonssvikt, maternal-placenta-føtal system, og intrauterin infeksjon og morkake betennelse komponent felles for så many tidlige fødsler 20,23.
Valget av art som brukes til å modellere EOP påvirker tolkning av eksperimentelle data i sammenheng med de iboende begrensninger utgjøres av arten. I de enkleste vilkårene, betyr fødsel ikke likestille til lignende interessante CNS utvikling på tvers av alle dyr 24. Modellen som er beskrevet her kan utføres i både gravide mus og rotter, selv om pup overlevelse hos mus er betydelig redusert i uerfarne eller stressede demninger. Forenlig med våre tidligere rapporter, fetal tap hos rotter ved fødselen (P0) er økt i TSHI + LPS dyr (ca 40%) sammenlignet med sham, LPS og TSHI alene, men overlevende unger ikke viser signifikante vektforskjeller gjennom P28 20. I likhet med forskjeller blant arter, er tidspunktet for skader under drektighetsperioden en avgjørende rolle i den nevrologiske banen til avkommet. Den spatiotemporal regulering av nevrale celleutviklingsstadier av spredning, migrasjon og differentiation skiller mellom ulike pattedyr 24-26. Disse cellespesifikke utviklingsprogrammene påvirke sårbarheten for skader. For eksempel overlapping av timingen av oligodendrocyte avstamning og GABAergic neuronal utvikling med tidspunktet for tidlig fødsel gjør disse cellene særlig utsatt for skader perinatale fornærmelser 27-29. Dermed ble denne modellen utviklet i E18 rotter (og vellykket oversatt til E17 mus på en C57BL / 6 bakgrunnen) som dette timing tilsvarer intrauterin global prenatal fornærmelse som oppstår i menneskelige spedbarn før ekstremt tidlig fødsel ved 23-25 ukers svangerskap 20 . Vi tidligere viste O4-immunoreactive umodne oligodendrocytter blir mest berørt på dette stadiet av utviklingen 16. Deres tap korrelerer med redusert overlevelse og modning 14, med de mest bemerkelsesverdige reduksjoner i O4 + og O1 + stadier av avstamning 16, i samsvar med tidligere rapporter fra andre etterforskere 30. DessHar vi demonstrert for tidlig tap av subplate, redusert KCC2 uttrykk, lavere krampeterskelen og nedsatt gangart 12,13,15 i samsvar med feilregulert GABAergic signalering i premature barn 31.
Modellen som er beskrevet her byr på mange fordeler sammenlignet med tidligere modeller i gnagere brukes til å studere perinatal hjerneskade fra tidlig fødsel 23. Den inneholder hele maternal-placenta-fostersystemet og forårsaker både hjernen og placenta skade. Vi har tidligere publisert sammenligninger mellom humbug, TSHI alene, LPS og TSHI + LPS og forskjeller i funksjonelle utfall og biokjemi 20, og forskjeller med gradert TSHI 16. Mens tidligere undersøkelser av ensidige carotis ligations og systemisk hypoksi i neonatale rotter har utøst mekanistisk innsikt i en rekke patofysiologiske prosesser (dvs. mottakelighet av umodne oligodendrocytter til iskemi), direkte translasjonsforskning og klinisk relevaNCE for slike modeller er mindre robust. I tillegg til de programmene som beskrives, kan modellen beskrevet her være en informativ verktøy for undersøkelse av andre organsystemer påvirket av prematuritet, inkludert nekrotiserende enterokolitt (NEC), hjerte, lunge, nyre og hypothalamus-hypofyse aksen dysfunksjon. På grunn av kompleksiteten i LPS farmakologi og forskjeller i mor og foster farmakodynamikk, intraperitonale LPS injeksjoner i dammer er mindre sannsynlig å produsere samme fosterbetennelsesreaksjon vist her. Videre betyr LPS ikke krysser placenta pålitelig 20,32. Tidligere forsøk vi direkte cervical anvendelse av LPS og intrauterine injeksjon i likhet med det som er beskrevet i andre musemodeller 33. Men vi fant at dødeligheten og inkonsekvens av CNS skade ble betydelig økt blant valper i samme kull. Her ble den dose på 4 ug / sac optimalisert ved hjelp av dose-respons-eksperimenter. Økende doser av LPS administreres til amniotic kupé gir økt føtal dødelighet. LPS har den fordel i direkte infeksjon med typiske intrauterine gram-negative bakterier i at det aktiverer betennelsessignale gjennom toll-lignende reseptor 4 uten å bevirke aktiv bakteriell infeksjon, og den tilhørende risiko for patogen spredning. Imidlertid kan denne modellen bli endret til å omfatte vanlige patogener og organismer isolert fra menneske placentas, inkludert gruppe B streptokokker, noe som fører til placenta og nevropatologiske unormalt, og autistisk-lignende oppførsel hos rotter 34. På samme måte kan Ureaplasma lipoprotein multiple-bundet antigen simulere Ureaplasma arter infeksjon. Siden Ureaplasma er den vanligste årsaken til menneskelig korioamnionitt 35, kan dette også være en vei for fremtidig etterforskning. Som flere inaktiv-smittestoffer blir tilgjengelige, vil det være lærerikt å finne ut hvordan de forskjellig innvirkning neurodevelopment og effekten av nevro-reparerende tiltak.
Begrensninger av denne modellen inkluderer fostervann tap fra intra-foster injeksjoner. Selv om ingen effekt observert med intra amniotiske injeksjoner av sterilt saltvann, sporvidden av nålen som brukes for å utføre injeksjoner er et viktig teknisk element. Hensyn må tas ikke til å bruke nåler større enn 31 G. Kirurgiske komplikasjoner hos mor rotte knyttet til laparotomi er ekstremt sjeldne, inkludert sårruptur, tarmobstruksjon, peritonitt og fullstendig tap av svangerskapet, med mødredødelighet mindre enn 5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige til Dan Firl, Chris Corbett og Jesse Denson, PhD. Finansieringen var ved NIH ninds R01 NS060765 til SR, P30 Cobre Pilot Program til LJ og Child Health Signatur Program til LJ ved University of New Mexico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
- Blencowe, H., et al. Preterm birth associated neurodevelopmental impairment estimates at regional and global levels for 2010. Pediatr Res. 74, Suppl 1. 17-34 (2013).
- Mwaniki, M. K., Atieno, M., Lawn, J. E., Newton, C. R. Long term neurodevelopmental outcomes after intrauterine and neonatal insults a systematic review. Lancet. 379, 445-452 (2012).
- Dammann, O., Leviton, A. Intermittent or sustained systemic inflammation and the preterm brain. Pediatr Res. 75, 376-380 (2014).
- Leviton, A., et al. Microbiologic and histologic characteristics of the extremely preterm infant's placenta predict white matter damage and later cerebral palsy. the ELGAN study Pediatr Res. 67, 95-101 (2010).
- Redline, R. W. Inflammatory responses in the placenta and umbilical cord. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 296-301 (2006).
- Lee, J., et al. Chronic chorioamnionitis is the most common placental lesion in late preterm birth. Placenta. 34, 681-689 (2013).
- Lee, S. M., et al. Acute histologic chorioamnionitis is a risk factor for adverse neonatal outcome in late preterm birth after preterm premature rupture of membranes. PloS one. 8, e79941 (2013).
- Pappas, A., et al. Chorioamnionitis and early childhood outcomes among extremely low gestational age neonates. JAMA Peds. 168, 137-147 (2014).
- Gaillard, R., Arends, L. R., Steegers, E. A., Hofman, A., Jaddoe, V. W. Second and third trimester placental hemodynamics and the risks of pregnancy complications the Generation R Study. Am J Epidemiol. 177, 743-754 (2013).
- Trivedi, S., et al. Fetal placental inflammation but not adrenal activation is associated with extreme preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 206, 236 (2012).
- Yanowitz, T. D., et al. Hemodynamic disturbances in premature infants born after chorioamnionitis association with cord blood cytokine concentrations. Pediatr Res. 51, 310-316 (2002).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia Ischemia. Cereb Cortex. , (2014).
- Jantzie, L. L., et al. Erythropoietin attenuates loss of potassium chloride co transporters following prenatal brain injury. Mol Cell Neurosci. 61, 152-162 (2014).
- Jantzie, L. L., Miller, R. H., Robinson, S. Erythropoietin signaling promotes oligodendrocyte development following prenatal systemic hypoxic ischemic brain injury. Pediatric Res. 74, 658-667 (2013).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic ischemic injury. J Neurosurg Peds. 6, 206-221 (2010).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18, 568-581 (2005).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22, 1-16 (2012).
- Delcour, M., et al. Impact of prenatal ischemia on behavior cognitive abilities and neuroanatomy in adult rats with white matter damage. Behav Brain Res. 232, 233-244 (2012).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Intl J Devel Neurosci. 29, 593-607 (2011).
- Jantzie, L. L., et al. Complex pattern of interaction between in utero hypoxia ischemia and intra amniotic inflammation disrupts brain development and motor function. J Neuroinflam. 11, 131 (2014).
- Back, S., et al. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia ischemia. J Neurosci. 22, 455-463 (2002).
- Jantzie, L. L., et al. Developmental Expression of N Methyl d Aspartate (NMDA) Receptor Subunits in Human White and Gray Matter Potential Mechanism of Increased Vulnerability in the Immature Brain. Cereb Cortex. 25, 482-495 (2015).
- Jantzie, L. L., Robinson, S. Preclinical Models of Encephalopathy of Prematurity. Devel Neurosci. , (2015).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Development of neurotransmitter systems during critical periods. Exper Neurol. 190, S8-S21 (2004).
- Kelsom, C., Lu, W. Development and specification of GABAergic cortical interneurons. Cell Biosci. 3, 19 (2013).
- Kinney, H., Back, S. Human oligodendroglial development Relationship to periventricualr leukomalacia. Semin Pediatr Neuro. 5, 180-189 (1998).
- Robinson, S., Li, Q., DeChant, A., Cohen, M. Neonatal loss of gamma amino butyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg Peds. 104, 396-408 (2006).
- Xu, G., et al. Late development of the GABAergic system in the human cerebral cortex and white matter. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 841-858 (2011).
- Segovia, K. N., et al. Arrested oligodendrocyte lineage maturation in chronic perinatal white matter injury. Ann Neurol. 63, 520-530 (2008).
- Robinson, S., Li, Q., Dechant, A., Cohen, M. L. Neonatal loss of gamma aminobutyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg. 104, 396-408 (2006).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24, 881-897 (2010).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis unraveling causes of adverse neurological outcomes. Repro Sci. 18, 900-907 (2011).
- Bergeron, J. D., et al. White matter injury and autistic like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation. Devel Neurosci. 35, 504-515 (2013).
- Uchida, K., et al. Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice. J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.
