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Immunology and Infection

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

Plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) sind starke Typ I Interferon (IFN-I) Herstellung von Zellen, die in Reaktion auf eine Infektion oder bei entzündlichen Reaktionen aktiviert werden. Leider wird Studium der PDC-Funktion durch ihre niedrigen Frequenz in lymphatischen Organen behindert, und die bestehenden Verfahren zur in-vitro-DC Generation überwiegend zugunsten der Produktion von cDCs über pDCs. Hier präsentieren wir einen einzigartigen Ansatz, um effizient zu erzeugen pDCs von gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) in vitro. Speziell beschriebene Protokolldetails, wie CLPs aus dem Knochenmark zu reinigen und zu erzeugen pDCs kokultiviert mit γ-bestrahlten AC-6-Feeder-Zellen in Gegenwart von Flt3-Liganden. Ein einzigartiges Merkmal dieses Kultursystems ist, dass die CLPs wandern unter den AC-6-Zellen und werden gepflasterten Fläche bildenden Zellen, ein kritischer Schritt zur Erweiterung pDCs. Morphologisch DCs, nämlich pDCs und cDCs wurden mit einer Zusammensetzung aus 7 erzeugte nach ca. 2 Wochen0-90% pDCs unter optimalen Bedingungen. Typischerweise ist die Anzahl der pDCs durch dieses Verfahren erzeugte etwa 100-fachen der Anzahl der CLPs ausgesät. Daher ist dies ein neuartiges System, das eine robuste erzeugen die eine große Zahl von pDCs erforderlich, weitere Untersuchungen über die Entwicklung und Funktion der Zellen zu erleichtern.

Introduction

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Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die bei der Kontrolle der Immunantwort 1 eine wichtige Rolle spielen. Während DCs sind heterogen, sie können grob in zwei Populationen klassifiziert werden, herkömmliche DCs (cDCs) und plasmazytoiden DCs (pDCs) 2,3. Zusätzlich zu lymphoiden Organen, sind cDCs und pDCs auch in Geweben, einschließlich Lunge, Darm, Haut und 2 gefunden. Die Morphologie cDCs und pDCs unterscheidet, mit cDCs aufweist Dendriten artigen Vorsprünge und die Form pDCs wobei mehrere Plasmazellenartigen. Darüber hinaus wird der gemeinsame Maus DC Marker, CD11c, stärker auf als auf pDCs cDCs ausgedrückt. CDCs und CD11b - - CD24 + cDCs, die beide exprimieren höhere Niveaus von MHC-Klasse II und kostimulatorische Moleküle als dies pDCs 2 kann darüber hinaus weiter in cDCs CD11b + CD24 teilen. Reife pDCs, andererseits hat sich gezeigt, selektiv auszudrücken Siglec-H und BST2 4. Functionally sind cDCs besser Antigen-präsentierenden Zellen sind als pDCs; jedoch können pDCs eine große Menge an Typ I Interferon bei der Virusinfektion oder entzündlichen Stimulation 5 zu produzieren.

Beide cDCs und pDCs sind kurzlebig und müssen deshalb ständig von Vorläufern im Knochenmark (BM) 6,7 nachgefüllt werden. Adoptiven Transfer von gemeinsamen myeloischer Stammzellen (CMPs) und gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP) in letal bestrahlten Mäusen zeigt, dass cDCs und pDCs kann von beiden Abstammungslinien 8-10 erzeugt werden. Jedoch gibt es eine Untergruppe von pDCs die RAG1 / 2 ausdrücken und besitzen umge DJ Abschnitte der IgH-Locus 11,12. Diese Zellen teilen auch molekulare Ähnlichkeit mit B-Lymphozyten, einschließlich Ausdruck der B220 Marker, Nukleinsäure-Sensing-Rezeptoren (TLR7 / TLR9) und Transkriptionsfaktoren (SPIB und BCL11A) 13, verfügt über alle geglaubt, um Unterschriften der lymphoiden Linie zu sein. Daher CLPs kann eine gute Wahl für in-vitro-Erzeugung von pDCs wegen der Abstammung Ähnlichkeit zu sein.

Während die Frequenz der beiden cDCs und pDCs bei Mäusen und Menschen ist sehr gering 6 DCs, insbesondere cDCs kann in vitro aus BM oder Vorläuferzellen in der Gegenwart von Cytokinen, wie GM-CSF 11,14 oder Flt3-Liganden erzeugt werden (FL ) unter Verwendung von Feederfreie Systeme 11,15,16. Leider ist es jedoch nicht möglich, eine große Anzahl von pDCs in vitro unter Verwendung von FL 11,15,16 herzustellen. Bisher haben wir gezeigt, dass pDCs effizient in vitro aus CLP mit der AC-6 Speisesystem 17 erzeugt werden. Der Vorteil der Verwendung der AC-6 Stromazelllinie im Kultursystem ist, dass er Zell-Zell-Kontakt und die Sekretion von Cytokinen, die die Erzeugung einer großen Zahl von pDCs von CLPs Unterstützung bietet. Obwohl die Produktion mit diesem System ist sehr robust, ist eine sorgfältige Replikation der Verfahren unten beschrieben erforderlich in, um eine effiziente Erzeugung von pDCs gewährleisten.

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Protocol

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C57BL / 6-Wildtyp-Mäuse wurden von der National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan gekauft. Alle Mäuse wurden gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Protokolle und Tiernutzung Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der National Taiwan University College of Medicine (Permit-Nummer: 20120075) zugelassen. Darüber hinaus machte die Forscher alles tun, um das Potenzial für die Schmerzen, Leiden oder Angst bei den Tieren zu reduzieren, während die Durchführung von Experimenten. Alle beschriebenen Verfahren wurden bei RT mit Handschuhen.

1. Herstellung von AC-6 Feeder-Zellen

Hinweis: Die AC-6.21 (AC-6 in kurzen) Stromazelllinie 18 (von I. Weissman, der Stanford University zur Verfügung gestellt) sollten in RPMI aufrechterhalten werden, ergänzt mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). Als Feeder-Zellen dienen, sind AC-6-Zellen γ-bestrahlt mit 3000 rad (30Gy) einen Tag vor der Co-Kultur, um ihre Verbreitung zu verhindern. Hinweis thbei AC-6 Zellen neigen dazu, ihre Differenzierung unterstützende Fähigkeit zu verlieren, wenn bei der Wartung überfüllten verlassen, oder wenn ihre Durchgang Nummer ist über 20.

  1. Wasch AC-6 Zellen einmal mit 1 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) gewaschen und durch Absaugen zu entfernen DPBS. Behandlung von AC-6-Zellen mit 0,8 ml Trypsinlösung (0,05% Trypsin und 0,5 mM EDTA in DPBS) für 3-5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2 und stoppt dann die Reaktion durch mit 10 Volumina Kulturmedium zu verdünnen machen Einzelzellsuspension.
  2. Samen AC-6-Zellen bei 5.9x10 4 Zellen / Well in 12-Well-Platten und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO & sub2; O / N.
    Anmerkung: Die Dichte des AC-6-Zellen ist sehr wichtig, da eine geringere Dichte wird cDC- Erzeugung begünstigen. Aussaat mit einer Dichte von 5.9x10 4 Zellen / Vertiefung ermöglicht AC-6 bis zur Konfluenz am nächsten Tag, die optimal für die Ableitung pDCs von CLPs ist zu erreichen.
  3. Bestrahlen AC-6-Zellen mit 3000 rad (30 Gy) unter Verwendung von γ-Bestrahlungsvorrichtung.
    Notiz: Das zur AC-6 bestrahlen Dosis ist optimiert, um die Zellen aus proliferierenden zu verhindern und dennoch tragfähig zu halten sie lange genug, um die für die Differenzierung der DCs von CLPs erforderlich Zytokine und Zell-Zell-Kontakt.
  4. Saugen Sie Medium und ersetzen mit 1 ml komplettem RPMI (RPMI mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 50 ug / ml Gentamycin und 50 uM β-Mercaptoethanol).

2. Isolieren BM Zellen von Mäusen

  1. Opfern Mäuse durch CO 2 Ersticken und Genickbruch. Platzieren Sie die Maus auf eine Dissektion Tablett und sterilisieren mit 70% Ethanol. Einen Einschnitt in der Mitte der Unterleib und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, die die unteren Extremitäten.
  2. Sezieren Mäuse in einem semi-sterile Haube. Um den Oberschenkel und Schienbein zu lösen, Clip den Oberschenkelknochen und Schienbeine oben unterhalb des Kniegelenks. Lösen Sie die Muskeln von den Knochen mit einer Schere und legen Sie die Knochen in einer 6 cm Petrischale mit 5 ml RPMI abzuschließen.
  3. Gehen Sie zu einem sterilen Kultur Kapuze. Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit einer 27G Nadel mit komplettem RPMI verbunden. Schneiden Sie die beiden Enden der Knochen mit einer Schere, und legen Sie die 27G Nadel, um das Mark aus den Knochen durch leichtes Einspritzen von komplettem RPMI einmal von jedem Ende zu spülen.
  4. Vorbereitung einer Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren die Zellen auf und ab 3-5 mal in der Kulturschale mit der Spritze ohne Nadel.
  5. Zentrifugieren die Zellen 5 min bei 500 xg und dekantiert den Überstand.
  6. Lyse der roten Blutzellen, die mit 1 ml ACK-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA) Inkubation für 1 min und Abstoppen der Reaktion durch Verdünnen mit 10 Volumina komplettem RPMI. Lassen Sie Zellen für 5 Minuten, um durch die Schwerkraft zu pelletieren tot Zellklumpen und Gewebereste stehen.
    Hinweis: Stellen Sie sich nicht mehr als 5 Minuten, da dies in der Zellverlust durch Absetzen der lebensfähigen Zellen führen.
  7. Langsam decant zellhaltige Überstand in ein neues Röhrchen verlassen Trümmerhinter der original tube.
  8. Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 500 xg, um die Zellen zu pelletieren, dann entfernen und den Überstand verwerfen.
  9. Resuspendieren Gesamt BM-Zellen in 100 & mgr; l FACS-Puffer (1 × PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA) (typischerweise 4-6 × 10 7 Zellen werden aus BM eine Maus erhalten wurde).

3. FACS Analyse und Sortierung der CLP

  1. Fügen Sie anti-CD16 / 32 (Hybridom-Überstand Clone 2.4G2, 50 ul / Reaktion oder 1-2 ug / Reaktion) in Zellen in FACS-Puffer (Schritt 2.9) für 1-2 min, um Fc-Rezeptoren zu blockieren.
    Hinweis: Anti-CD16 / 32 ist auch Fc-Block, der zugegeben wird, um nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an Zellen, die Fc-Rezeptoren, einschließlich Granulozyten, Monozyten und B-Lymphozyten zu verhindern bezeichnet.
  2. Gleichzeitig gefärbt werden Zellen mit den folgenden Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern (für 4x10 7 Zellen) für 15 Minuten auf Eis unter Vermeidung Umgebungslicht. Antikörper: PE-konjugierten Lineage Marker (jeweils 0,2 ug), das anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6.7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), Anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) und anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 & mgr; g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 & mgr; g anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 & mgr; g anti-M-CSFR-APC (AFS98) und 0,2 & mgr; g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. Wasche die Zellen mit 3 ml FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g.
  4. Die Zellen in 300 ul FACS Puffer und Filterzellen durch ein 40 & mgr; M Zellsieb.
  5. Waschen Sie die Röhrchen mit einem zusätzlichen 100 ul FACS-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zu gewinnen und die Filter in eine sterile FACS-Sortierung Rohr mit der gleichen Zellsieb.
  6. Führen Durchflusszytometrieanalyse unmittelbar nach der Färbung mit entsprechenden Filtern und Spannungen zur Signalerfassung. Verwenden 488 nm-Laser, um die FITC-PerCP-Cy5.5-markierten Antikörpern, 561 nm-Laser, um die PE- und PE-Cy7-labelded Antikörper und 633 nm erfassen laser, um die APC-markierten Antikörper zu erkennen.
  7. Sortieren Sie CLP nach folgenden Marker lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (wie in Schritt 3.2 gefärbt) mit einem Zellsortierer. Sammeln der sortierten Zellen in ein 15 ml Röhrchen, enthaltend 8 ml komplettem RPMI als Polster.
  8. Erfassen die absolute Anzahl der sortierten Zellen durch den Zellsortierer am Ende des Durchlaufs angezeigt. Typischerweise kann 5x10 4 CLP vom BM einer Maus gewonnen werden.

4. Cokultur CLP und AC-6

  1. Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen aus Schritt 3.7 für 10 Minuten bei 500 xg, entfernen Sie den Überstand und Zellpellet mit genügend komplettem RPMI um eine Zelldichte in der Umgebung von 5x10 4 Zellen / ml zu erhalten. Seed 500 Zellen / Well in 12-Well-Platte mit Feeder-Zellen in Schritt 1.4 vorbereitet.
  2. In 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig in-house mit einem Expressionssystem von M. Manz, Universi unsere Anbieterty Spital Zürich, Schweiz) und bei 37 ° C, 5% CO 2 mit periodischen visuelle Überwachung der DC Entwicklung unter dem Mikroskop.
    Anmerkung: Im Handel erhältliche rekombinante menschliche FL oder Maus FL kann als Ersatz für hu-Flt3L-Ig DC Entwicklung bereitgestellt werden können.
  3. Sammeln der Zellen im Überstand am Tag 12 und Waschen der Wells einmal mit 0,5 ml RPMI-Medium Kombinieren der resultierenden Überstände zu vervollständigen. 0,5 ml frisches Medium und Schrott, die haftenden Zellen mit einem Zellschaber.
  4. Verbinden die Zellen enthaltenden Mediums aus beiden Teilen und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g.
  5. Dekantieren und resuspendieren Zellen in 50 ul FACS-Puffer. In 50 ul anti-CD16 / 32 Hybridomüberstand und Inkubation für 1-2 Minuten an Fc-Rezeptoren zu blockieren.
  6. Aufzuzählen und färben alle Zellen mit den folgenden Antikörpern (jeweils 0,05 ug) Anti-CD11c-APC (N418), Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE.
  7. Waschen und Zentrifuge die Zellen wie beschriebend in Schritt 3.3.
  8. Die Zellen in 100 ul FACS-Puffer, Tor auf CD11c + und zu analysieren, für cDCs (CD11c + CD11b + B220 -) und pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.

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Representative Results

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Insgesamt 4-6x10 7 BM-Zellen werden typischerweise aus Oberschenkelknochen und Schienbein einer 6-8 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6-Maus isoliert. Zu sortieren, CLP, sind insgesamt BM-Zellen mit PE-konjugierten Antikörpern gegen Linie Marker (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 und MHC-II), anti gebeizt c-kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC und Anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analysiert und sortiert werden mit einem Zellsortierer. Die Sortierstrategie für CLP ist in Abbildung 1 dargestellt. Typischerweise werden 5x10 4 CLPs aus einer C57BL / 6-Mäusen erhalten. Um mehr CLP zu erhalten, kann BM-Zellen 3-4 Mäusen kombiniert werden und das Protokoll entsprechend vor dem Sortieren angepasst.

Nach der Co-Kultur von 500 CLP mit 5.9x10 6 AC-6-Feeder-Zellen, Kopfsteinpflasterbereich bildenden Zellen (CAFC) starten, um bei Tag 3-4 angezeigt. Bis zum Tag 8, erscheinen runde pDCs und Suspend auf der Oberseite des CAFC (2A). Die Anzahl der pDCs Gipfel rund um day 12-14 an welcher Stelle pDCs starten, um die Apoptose nach ihrer vollen Entfaltung zu unterziehen, und die Zahlen beginnen, allmählich ab. cDC- Kolonien erscheinen später als pDC Kolonien am Tag 6-8 sowie die Morphologie der cDCs größer sind, spindelförmige und haft (2B).

Typischerweise kann 5-6x10 4 Zellen von 500 CLPs nach 2 Wochen der Kokultur erzeugt werden. Nach Färbung der Zellen mit anti-CD11c-APC, Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE, Analyse durch Durchflusszytometrie zeigt, dass der Prozentsatz der pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) und cDCs (CD11c + CD11b + B220 - ) beträgt 91% und 6%, bzw. (3). Daher kann mit diesem Verfahren pDCs kann so viel wie 100-fache erweitert werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Gating Strategien für CLP. BM-Zellen isorechnet von einer Maus wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt und CLP, die als lin definiert wurden analysiert - c-Kit int Sca-1 int M-CSFR -. IL-7Rα + Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .

Figur 2
Abbildung 2. Morphologie der CDC und pDC Kolonien in CLP-AC-6 Cokulturen. 500 CLPs wurden mit γ-bestrahlten AC-6-Feeder-Zellen in Gegenwart von 100 ng / ml FL cokultiviert. (A) pDC Kolonien am Tag 8, 10 und 12, und (B) cDC- Kolonien an Tag 8, 12 und 16 wurden unter dem Lichtmikroskop bei 200 x (Maßstab 50 um) fotografiert. Bitte klicken Sie hier, um eine larg ansehenäh Version dieser Figur.

Figur 3
Abbildung 3. Die durchflusszytometrische Analyse der CLP-abgeleitete pDCs und cDCs. Fünfhundert CLPs und γ-bestrahlt AC-6-Feeder-Zellen (5.9x10 4 / ml) wurden in vitro für 12 Tage in Gegenwart von FL (100 cokultiviert ng / ml ). Die Zellen wurden mit anti-CD11c-APC, Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert. Die Zellen wurden zunächst auf CD11c + gated und dann für cDCs (CD11c + CD11b + B220 -) analysiert und pDCs (CD11c + CD11b - B220 +). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Hier beschreiben wir ein in-vitro-Kultursystem für die robuste Erzeugung von DCs und pDCs insbesondere aus einer kleinen Anzahl von CLPs. Die Einzigartigkeit dieses Kultursystem ist auf die Verwendung von AC-6-Zellen, eine Stromazelllinie, Speiser. Diese Vorgehensweise hat sich gezeigt, dass nicht nur die Cytokine, wie IL-7, SCF, M-CSF und FL 20 vorzusehen, sondern auch die Zell-Zell-Kontakt 21 notwendig DC Entwicklung zu unterstützen. AC-6 Zellen wurden zuvor verwendet, um die Untersuchung der in vitro DC Entwicklung von mehreren Vorläufern 8,16,22 erleichtern. Wir fanden, dass es von entscheidender Bedeutung, um eine optimale Dichte von AC-6 Feederzellen Saatgut, um die effiziente Differenzierung von pDCs von CLP zu unterstützen. Insbesondere Impfen 5.9x10 4 γ-bestrahlten AC-6-Zellen in 12-Well-Platten ergibt Konfluenz am nächsten Tag, die geeignet pDC Entwicklung. Eine niedrigere AC-6 Zelldichte (3.9x10 4 / Well in 12-Well-Platte) tendiert CDC developmen unterstützent 24. Daher ist es zum ersten Keim mehreren Konzentrationen von AC-6-Zellen zu empfehlen ist, um die Bedingungen zu optimieren, wenn die Aufstockung der Kultursystem 23. Darüber hinaus ist es auch wichtig, dass die AC-6-Zellen strikt einzuhalten, auch sorgfältig auf Passagezahl und niemals zum Erreichen der Konfluenz erlaubt. Wenn unbefüllt ist oder wenn ihre Passagenzahl größer als 20 ist, diese Zellen sind in der Regel die Möglichkeit, die Blutbildung in vitro zu unterstützen verlieren. Zusätzlich wird die Konzentration von FL wirkt sich auch auf DC Entwicklung. Insbesondere bei niedrigen Dosen (25-50 ng / ml) cDCs werden vorzugsweise entwickelt, während bei hohen Dosen (100-200 ng / ml) pDCs überwiegend 24 erzeugt. Zusätzlich zur AC-6 Zelldichte und FL Dosierung ist eine sorgfältige Auswahl einer Charge von FBS, die effizient unterstützt DC Entwicklung in diesem Kultursystem für den Erfolg des Verfahrens.

Während in vitro abgeleitete cDCs und pDCs kann dis seinund CD11c + CD11b - - durch ihre Oberflächenmarkern, nämlich CD11c + CD11b + B220 B220 + unterschieden sind jeweils auch deren Morphologien erkennbar durch Mikroskopie. cDCs größer sind, spindelförmigen und haftenden, während pDCs kleiner sind, rundgestalteten und wachsen in Suspension (Abbildung 2). Die Kinetik der DC Differenzierung unterscheidet sich auch, mit pDCs erscheinen früher und cDCs später. Zusätzlich kann das Verfahren der pDC Entwicklung signifikant durch AC-6 Zelldichte mit höheren AC-6 Dichte Beschleunigung des Entwicklungsprozesses beeinflusst. Es sollte beachtet werden, dass pDCs beginnen sterben nach vollständiger Entwicklung und damit das Verhältnis von cDCs gegen pDCs in diesem Kultursystem schrittweise zu späteren Zeitpunkten erhöht werden kann. Daher ist eine periodische Überwachung der DC Entwicklung durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie hoch um zu bestimmen, empfiehlt sich, wenn pDCs starten zur Apoptose.

Zu beachten ist, das described Verfahren kann auch auf andere Gleich Progenitoren wie CDPs angewendet werden; Jedoch sind die Haupt DC-Population aus diesen Zellen erzeugten cDCs 17 auch bei hohen AC-6 Dichten bzw. FL Dosen. Die geringe pDC Potenzial von CDP steht im Einklang mit Berichten aus verschiedenen Gruppen entweder mit CDP-Feeder 11 oder Feeder-freien 16-Systeme, zwei unterschiedlichen in vitro-Kultur-Systeme. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Feeder-System AC-6 kann wahrheitsgetreues Bild der Differenzierungspotential der verschiedenen Vorläuferzellen.

Die aus diesem Kultursystem erzeugt pDCs sind CD11c + CD11b - B220 +. Außerdem exprimieren sie relativ hohe Gehalte an Tcf4 (kodiert E2-2) und Rag1 zwei pDC-spezifische Gene, aber niedrigere Id2, eine CDC-spezifische Gen, als dies cDCs 17. Obwohl diese pDCs fehlt Siglec-H und BST2, Marker als charakteristisch für murine pDCs, sind sie noch in der Lage, höhere IFN-I produzieren alstun cDCs und hochregulieren CD86, wenn sie mit der vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) 24 infiziert. Dies legt nahe, dass diese pDCs, obgleich unvollständig differenzierten, noch funktionstüchtig sind. Darüber hinaus haben wir bereits erfolgreich diese Methode verwendet, um eine synergistische Rolle von IFN-I und FL in pDC Entwicklung von CLPs 17 abzugrenzen, was bestätigt, dass dieses Verfahren ist wertvoll für die Untersuchung der DC Entwicklung.

Zusammenfassend stellen wir hier eine einfache, aber effiziente Methode pDCs aus einer kleinen Anzahl von CLPs mit dem AC-6 feeder Kokultursystem, die Entwicklungs- oder funktionelle Untersuchungen pDCs erleichtern kann generieren.

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Acknowledgments

Wir danken Drs. Markus Manz und Irving Weissman für die Bereitstellung von Reagenzien. Der Service von der Analyse über Durchflusszytometrie und Zellsortierung Core Facility des ersten und zweiten Kern Laboratory an der National Taiwan University College of Medicine und NTU Krankenhaus zur Verfügung gestellt Wir erkennen auch auf. Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan unterstützt (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) und den Nationalen Gesundheitsforschungsinstitute, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI und NHRI-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>In-vitro-Erzeugung</em> von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System
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Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

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