In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine effiziente Methode zur Erzeugung von Plasma-Cy-dendritischen Zellen oder PDCs für die Untersuchung ihrer Entwicklung bereitzustellen. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Immunfette beantworten, wie z.B. Wie wird die PDC-Entwicklung reguliert? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verwendung einer kleinen Anzahl von Vorläuferzellen ermöglicht, um große Mengen an PDCs effizient zu erzeugen.

Die Auswirkungen dieser Technik beziehen sich auf die Therapie von PDC-assoziierten Autoimmunerkrankungen wie systemischem Lupus, Athetose und Psoriasis. Demonstrieren Sie das Verfahren heute von xang, einem großartigen Studenten aus dem Labor: Am Tag vor der Ernte der Knochenmarkzelle säen sechs stromale Zelllinienzellen bei 5,9 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Vertiefung in einzelne Vertiefungen von 12 Vertiefungen Platten und inkubieren die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid über Nacht. Am nächsten Morgen werden die sechs AC-Zellen bei 3000 rad gammabestrahlt und das Kulturmedium durch einen Milliliter des vollständigen Mediums ersetzt.

Als nächstes legen Sie die entsprechende Anzahl adulter Wildtyp-C 57 schwarzer sechs Mäuse in eine Präparierschale und sterilisieren Sie die Tiere mit 70%Ethanol. Bewegen Sie dann das Tablett zu einer halbsterilen Haube und machen Sie Schnitte in den Mittelbauch jedes Tieres, entfernen Sie die Haut von den distalen Teilen, einschließlich der unteren Extremitäten, um die Femure und Tibien zu lösen, schneiden Sie den Femur über und die Tibien unter den Kniegelenken ab und verwenden Sie eine Schere, um die Muskeln von den Knochen zu lösen, während sie entnommen werden. Legen Sie die Knochen in eine sechs Zentimeter große Petrischale, die fünf Milliliter vollständiges RPMI enthält, und geben Sie die Petrischale in eine sterile Kulturhaube.

Füllen Sie nun eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel mit vollständigem RPMI ausgestattet ist, und schneiden Sie mit einer Schere beide Enden jedes Knochens ab. Führen Sie die Nadel in jeden Knochen ein und spülen Sie das Mark mit einer sanften Injektion von vollständigem RPMI einmal an jedem Ende aus. Aspirieren und dispensieren Sie die Zellen dann ohne Nadel vorsichtig drei- bis fünfmal in der Kulturschale, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.

Nach dem Schleudern lyzieren die Zellen die roten Blutkörperchen mit einem Milliliter eines CK-Puffers und stoppen die Reaktion mit 10 Volumina vollständigem RPMI. Lassen Sie nach einer Minute die toten Zellklumpen und Ablagerungen fünf Minuten lang sedimentieren und deformieren Sie dann den Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen. Nachdem wir die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, suspendieren wir die gesamten Knochenmarkzellen in 100 Mikrolitern Faxpuffer, um die gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen oder CLPs mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.

Anschließend werden die Zellen für ein bis zwei Minuten mit Anti-CD 16 bis 32 blockiert, gefolgt von der gleichzeitigen Färbung der Zellen mit dem entsprechenden Antikörpercocktail. Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten auf Eis in drei Millilitern Faxpuffer und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern frischem Faxpuffer. Anschließend filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb und sortieren die Zellen sofort auf einem Durchflusszytometer mit den entsprechenden Filtern und Spannungen.

Sammeln der interessierenden Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das acht Milliliter vollständiges RPMI enthält. Um eine hochangereicherte PDCM-Population zu erzeugen, ist es entscheidend, die richtige Population von CLPs aus entnommenen Knochenmarkzellen für ihre In-vitro-Kultur mit einem Z-Six-Feeder-System zu sortieren. Am Ende der Sortierung werden die Zellen heruntergeschleudert und das CLP-Zellpellet mit genügend vollständigem RPMI resuspendiert, um eine Zelldichte von etwa fünfmal 10 der vierten Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Als nächstes säen Sie 500 Zellen pro Well in die 12-Well-Platte, die die AC-Dosierzellen enthält, und ergänzen Sie die Co-Kulturen mit 100 Nanogramm pro Milliliter FL drei Liganden, dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid mit regelmäßiger visueller Überwachung der dendritischen Zelle oder der DC-Entwicklung unter einem Mikroskop. Ernten Sie an Tag 12 die Zellen im Co-Kultur-Überstand und waschen Sie jede Vertiefung einmal mit einem halben Milliliter vollständigem RPMI-Medium, wobei Sie die resultierende Snat und Washes poolen. Geben Sie dann einen halben Milliliter frisches Medium in jede Vertiefung und verwenden Sie einen Zellschaber, um die anhaftenden Zellen zu lösen.

Kombinieren Sie die abgelösten Zellen mit den schwimmenden Zellen und zentrifugieren Sie die resultierende Zellsuspension. Reanimation des Pellets in 50 Mikrolitern Faxpuffer. Zählen Sie dann die Zellen und färben Sie sie für die Expression von CD 11 C, CD 11 b und B zwei 20 nach der FC-Blockierung.

Wie eben gezeigt, können die Co-Kulturzellen dann auf das Vorhandensein von konventionellen CD 11 C, positiven CD 11 B, positiven B zwei 20 negativen und plasmazytoiden CD 11 C positiven CD 11 B.Negativen B zwei 20 positiven DC Populationen insgesamt vier- bis sechsmal 10 bis zur siebten analysiert werden. Knochenmarkzellen werden typischerweise aus den Femuren und der Tibia einer sechs bis acht Wochen alten Wildtyp C 57 Black Six Maus isoliert, wobei fünf mal 10 bis vier CLPs üblicherweise von einer C 57 Black Six Maus gewonnen werden. Nach der Sortierung durch Durchflusszytometrie, wie gerade an den Tagen drei bis vier der Co-Kultur mit AC 6-Feeder-Zellen gezeigt wurde, beginnen kopfsteinpflasterbildende Zellen zu erscheinen, wobei rundförmige Plasmazytoide DC auf den kopfsteinpflasterbildenden Zellen zu schweben scheinen.

Am achten Tag erreicht die Anzahl der Plasma-Zyto-DC ihren Höhepunkt um den 12. bis 14. Tag, an diesem Punkt beginnen die Zellen nach ihrer vollständigen Entwicklung eine Apoptose zu durchlaufen und ihre Anzahl beginnt allmählich abzunehmen. Konventionelle DC-Kolonien erscheinen später am sechsten bis achten Tag und sind mit einer größeren spindelartigen Morphologie adhärent. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass die Co-Kulturen 91 % CD 11 C, positiv CD 11 B, negativ B zwei 20 positive plasmazytoide dc und 6 % CD 11 C, positiv CD 11 B, positiv B zwei 20 negative konventionelle DC sind, was eine 100-fache Ausdehnung der plasmazytoiden DC-Zahlen gegenüber der ursprünglichen CLP-Population durch diese Methode zeigt.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass die a c sechs Zellen in gutem Zustand sind und die C-Dichte korrekt ist, bevor das clp nach einer Entwicklung hinzugefügt wird. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher in der DC-Biologie, um die Einschränkung zu überwinden, eine kleine Anzahl von Projektoren zu verwenden, um die DC-Entwicklung von verschiedenen Projektoren zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie PCs in vitro aus CLP mit einem C six BEAT-System generieren können.