तरीके छोटे RNAs और की Ribosomal अधिभोग की नियामक भूमिका की जांच करने के लिए<em> प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</em
Summary
Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.
Abstract
सिकल सेल एलील के लिए जिम्मेदार आनुवंशिक परिवर्तन (एचबीएस) मलेरिया परजीवी पी द्वारा संक्रमण का विरोध करने के लिए सक्षम बनाता है एरिथ्रोसाइट्स फाल्सीपेरम। बहुघटकीय होने के लिए जाना जाता है जो इस प्रतिरोध, के आणविक आधार, न समझा जा रहा है। हाल के अध्ययनों से एक बार मलेरिया परजीवी में translocated एरिथ्रोसाइट microRNAs के अंतर अभिव्यक्ति, जीन विनियमन और परजीवी विकास दोनों को प्रभावित पाया। ये miRNAs बाद में परजीवी mRNAs का विचारशील सबसेट के साथ 5 'आरएनए संलयन के माध्यम से एक कैमेरिक शाही सेना प्रतिलेख के गठन से mRNA के अनुवाद को बाधित करने के लिए दिखाया गया। इधर, इस्तेमाल किया गया है कि तकनीक जीन विनियमन और पी के translational क्षमता पर कार्यात्मक भूमिका और ख्यात तंत्र अंतर्निहित एरिथ्रोसाइट microRNAs अध्ययन करने के लिए फाल्सीपेरम, मेजबान एरिथ्रोसाइट्स में संशोधित सिंथेटिक microRNAs की अभिकर्मक सहित विस्तृत किया जाएगा। अंत में, एक polysome ढाल विधि टीआरए की सीमा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता हैइन टेप के nslation। साथ में, इन तकनीकों हमें एरिथ्रोसाइट microRNAs की dysregulated स्तरों दरांती एरिथ्रोसाइट्स की सेल आंतरिक मलेरिया प्रतिरोध में योगदान को दिखाना है कि अनुमति दी।
Introduction
जीनस प्लाज्मोडियम की apicomplexan परजीवी की वजह से मलेरिया, विश्व स्तर पर हर साल लगभग 200 मिलियन लोगों को संक्रमित और लगभग 600,000 लोगों की मृत्यु 1, जिससे सबसे आम मानव परजीवी बीमारी है। मनुष्यों को संक्रमित है कि पांच प्लाज्मोडियम प्रजातियों में से, मानव रोग के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक पी रहे हैं फाल्सीपेरम और पी गंभीर मलेरिया जटिलताओं के लिए उनके बड़े पैमाने पर वितरण और क्षमता के कारण वैवाक्स। मलेरिया परजीवी का जीवन चक्र मच्छरों और मनुष्य दोनों के संक्रमण की आवश्यकता है। एक संक्रमित मच्छर एक मानव काटता है, परजीवी प्रतिकृति की एक शुरुआती दौर होता है, जहां जिगर, रक्त के माध्यम से यात्रा करते हैं। मेजबान hepatocyte से खंडजाणु टूटना के बाद, वे अलैंगिक या यौन या तो प्रतिकृति की शुरुआत, आस-पास के लाल रक्त कोशिकाओं को संक्रमित। पी में 48 घंटा रहता है जो प्रतिकृति के अलैंगिक मंच, यह सबसे मल का स्रोत दोनों है, क्योंकि फाल्सीपेरम, इस अध्ययन का ध्यान केंद्रित हैआरिया के लक्षण और आसानी से इन विट्रो में recapitulated है।
सुधार हुआ मलेरिया रोधी चिकित्सा सहित सार्वजनिक स्वास्थ्य की पहल के एक नंबर, कुछ हद तक विश्व स्तर पर मलेरिया के बोझ को कम कर दिया है, वहीं दवा प्रतिरोधी परजीवी के सतत उद्भव मलेरिया नियंत्रण के प्रयासों के लिए एक समस्या प्रस्तुत करता है। नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण की सलाह दे सकते, जो एक ऐसा क्षेत्र आनुवंशिक वेरिएंट मलेरिया के लिए प्रतिरोध प्रदान कैसे विभिन्न पर अध्ययन किया जाता है। मलेरिया-स्थानिक क्षेत्रों में, एरिथ्रोसाइटिक बहुरूपताओं की एक किस्म 2,3 बहुत आम हैं। सिकल सेल शायद सबसे प्रमुख होने के साथ ये परिवर्तन, अक्सर ही प्रतीक मलेरिया संक्रमण 4 की शुरुआत करने के लिए पर्याप्त प्रतिरोध के साथ जुड़े रहे हैं। वे मलेरिया संक्रमण का विरोध करने एरिथ्रोसाइट्स कारण है जिसके द्वारा अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से समझे जाते हैं। हीमोग्लोबिन परिवर्तन के साथ parasitized एरिथ्रोसाइट्स बढ़ाया सेलुलर कठोरता और निर्जलीकरण, के माध्यम से बढ़ाया phagocytosis के अधीन हैं, जोपी की कमी हुई आक्रमण के साथ जुड़ा हुआ है 5 फाल्सीपेरम। HbC एलील भी एरिथ्रोसाइट सतह पर और cytoskeleton के पुनर्गठन, आगे परजीवी विकास 6.7 बाधा के साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है। अंत में, पी फाल्सीपेरम समयुग्मक दरांती के भीतर खराब बढ़ता है (HBSS) मलेरिया प्रतिरोध के आंतरिक एरिथ्रोसाइटिक कारकों का सुझाव दे, इन विट्रो में 8,9 एरिथ्रोसाइट्स। इन तंत्रों के सभी एक भूमिका निभाने के लिए दिखाई देते हैं, जबकि हालांकि, वे पूरी तरह से मलेरिया के सिकल सेल प्रतिरोध के पीछे तंत्र की व्याख्या नहीं है।
खराब समझ रहते हैं जो एरिथ्रोसाइटिक कारकों में से एक संभावित सेट परिपक्व एरिथ्रोसाइट्स भीतर miRNA वर्तमान का बड़ा पूल है। MicroRNAs 3 'UTR भीतर आधार बाँधना द्वारा अनुवाद और / या लक्ष्य mRNAs की स्थिरता मध्यस्थता जो 19-25 NT आकार में छोटे गैर-कोडिंग RNAs, कर रहे हैं। वे दमन ओ सहित, स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नियंत्रण में फंसाया गया हैच वायरस प्रतिकृति 10, और पौधों में वायरस के लिए प्रतिरोध प्रदान करने के लिए दिखाया गया है वे भी एरिथ्रोपोएसिस 11,12 और लोहे के चयापचय 13 सहित कई एरिथ्रोसाइटिक प्रक्रियाओं, विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। पिछले अध्ययनों से जिनकी अभिव्यक्ति नाटकीय रूप से HBSS में बदल गया था 14,15 एरिथ्रोसाइट्स एरिथ्रोसाइटिक miRNAs, का एक प्रचुर मात्रा में और विविध आबादी की पहचान की। परिपक्व एरिथ्रोसाइट्स सक्रिय प्रतिलेखन और अनुवाद की कमी के बाद से, इन एरिथ्रोसाइट miRNAs की कार्यात्मक भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है। महत्वपूर्ण सामग्री विनिमय मेजबान सेल और पी के बीच होता है के रूप में intraerythrocytic विकास चक्र (आईडीसी) 16 के दौरान फाल्सीपेरम, यह एचबीएस एरिथ्रोसाइट्स भीतर बदल miRNA प्रोफ़ाइल सीधे सेल आंतरिक मलेरिया प्रतिरोध करने के लिए योगदान कर सकते हैं कि अनुमान लगाया गया था।
इन अध्ययनों अंत में, अलग-थलग पहचान करने और कार्यात्मक मीटर के दायरे में मानव miRNA की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक पाइप लाइन के विकास के लिए नेतृत्वalaria परजीवी, पी उन मेजबान / मानव miRNAs अंततः covalently फ्यूज और फिर translationally परजीवी mRNA टेप 17 को दबाने जो संकेत दिया कि फाल्सीपेरम,। इस पार splicing द्वारा गठित पहली पार प्रजातियों कैमेरिक टेप का एक उदाहरण प्रदान की है और इस miRNA mRNA के संलयन अन्य परजीवी सहित अन्य प्रजातियों में उत्पन्न हो सकता है कि implicates। सभी trypanosome mRNAs पार spliced एक ब्याह-नेता (एसएल) के साथ polycistronic टेप 18 की जुदाई को विनियमित करने के लिए कर रहे हैं। पी के बाद से फाल्सीपेरम Dicer / पहले 19,20 के लिए orthologs का अभाव है, यह एरिथ्रोसाइट miRNAs पी में समान एसएल मशीनरी का अपहरण संभव है कि फाल्सीपेरम लक्ष्य जीन में एकीकृत करने के लिए। पी में हाल के अध्ययनों से फाल्सीपेरम वास्तव में 5 'ब्याह नेता दृश्यों 21 की उपस्थिति का संकेत है। इस अध्ययन transcriptomic और transla सहित दोनों, मानव परजीवी miRNA mRNA के संलयन टेप की खोज हुई कि तरीकों का विवरणराष्ट्रीय विनियमन तकनीक। इन तरीकों के समग्र लक्ष्यों पी के जीन विनियमन, phenotypes और अनुवाद क्षमता में छोटे RNAs के प्रभाव की जांच करने के लिए कर रहे हैं फाल्सीपेरम टेप।
मानव परजीवी कैमेरिक टेप की प्रारंभिक पहचान ऐसे बल्कि केवल छोटे RNAs पृथक जो तकनीक का उपयोग कर से कुल और छोटे दोनों आरएनए, जिसमें शामिल वास्तविक समय पीसीआर, transcriptome अनुक्रमण और ईएसटी पुस्तकालय पर कब्जा, के रूप में शाही सेना के विश्लेषण तकनीक के उपयोग पर भरोसा किया। एक बड़ा पूल में एक साथ सभी आरएनए अलग-थलग, बल्कि अलग से, परजीवी में दोनों translocated मानव छोटे RNAs की पहचान के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक बड़ा अनुक्रम के हिस्से के रूप में इन छोटे आरएनए दृश्यों की उपस्थिति की अनुमति दी। यह तो इन Fusions की कार्यात्मक परिणाम निर्धारित करने के लिए इन संलयन mRNAs का अनुवाद राज्य के एक विश्लेषण की आवश्यकता है।
परजीवी के जीनोम एक के लक्षण वर्णन पर व्यापक प्रयासों जबकिडी transcriptome परजीवी के शरीर विज्ञान में 22-25 की समझ को जोड़ लिया है, अब तक कम पी के जीवन चक्र भर में mRNA transcriptome के translational विनियमन के बारे में जाना जाता है फाल्सीपेरम 26। परजीवी के proteome के इस सीमित समझ परजीवी के जीव विज्ञान की समझ और मलेरिया रोधी चिकित्सा विज्ञान की अगली पीढ़ी के लिए नए लक्ष्य की पहचान करने की क्षमता दोनों रुकावट है। परजीवी के सेलुलर जीव विज्ञान की समझ में यह अंतर पी में translational विनियमन जांच करने के लिए पर्याप्त तकनीक की कमी के कारण बड़े पैमाने पर कायम है फाल्सीपेरम। हाल ही में एक कागज पी के राइबोसोमल footprinting के प्रयोग का वर्णन फाल्सीपेरम वैश्विक अनुवाद स्थिति 21 निर्धारित करने के लिए। टेप के translational क्षमता में से एक अच्छी तरह से स्थापित माप polysome प्रोफाइलिंग द्वारा निर्धारित जुड़े राइबोसोम की संख्या है। हालांकि, जब इस तकनीक पी करने के लिए लागू किया जाता है फाल्सीपेरम </ Em>, यह सबसे polysomes ठीक करने में असमर्थ है और मुख्य रूप से monosomes कब्जा। हाल ही में, कई समूहों 27,28 पी अनुकूलित है polysomes के संरक्षण और मेजबान लाल कोशिकाओं 28 में उनकी अलैंगिक विकास के दौरान इन मलेरिया परजीवी के राइबोसोमल अधिभोग और translational क्षमता को चिह्नित करने के लिए एक साथ एरिथ्रोसाइट और परजीवी lysing द्वारा फाल्सीपेरम polysome तकनीक।
सामूहिक रूप से, इन तरीकों मानव miRNA और परजीवी mRNAs का मनाया संलयन पहले से सूचना दी तरीकों 27 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है, जो उन लोगों के संलयन mRNAs के परजीवी प्रोटीन अनुवाद modulates, और HbAS में मलेरिया प्रतिरोध का एक प्रमुख कारक है और HBSS 17 एरिथ्रोसाइट्स कि प्रदर्शित करता है। इन विधियों उन संलयन आरएनए पी भीतर कर रहे हैं, चाहे वह शाही सेना splicing घटनाओं की पहचान करने और कार्यात्मक रूप से पता लगाने के लिए की तलाश में किसी भी प्रणाली में उपयोगी होगा फाल्सीपेरम या अन्य यूकेरियोटिक सिस्टम।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचबीएस यह पी की वजह से गंभीर मलेरिया के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करता है, क्योंकि मोटे तौर मलेरिया प्रभावित क्षेत्रों में सबसे आम हीमोग्लोबिन वेरिएंट में से एक है फाल्सीपेरम। तकनीक पी के जीन वि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, Duke Chancellor’s pilot project fund, the Roche Foundation for Anemia Research and The Bill and Melinda Gates Foundation. G.L. is supported by Duke’s UPGG and the NIH (Grant # 5R01AI090141-03) and K.A.W. by the NSF Graduate Research Fellowship Program.
Materials
| REAGENTS-All reagents must be RNAse-free. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758) |
| DEPC-treated water (see REAGENT SETUP) |
| Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher) |
| Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad) |
| 0.2 cm Electroporation cuvettes |
| 4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700) |
| 2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527) |
| 1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545) |
| 1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000) |
| 100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626) |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021) |
| 10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750) |
| Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698) |
| Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04) |
| RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840) |
| RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV) |
| 10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039) |
| Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060)) |
| HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030) |
| 45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769) |
| 1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080) |
| 1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV) |
| Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769) |
| Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702) |
| Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01) |
| mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific). |
| 5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon) |
| Biotin powder (Sigma-Aldrich) |
| 1M Potassium Chloride |
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare) |
| Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP) |
| Lysis buffer (see REAGENT SETUP) |
| 15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP) |
| 50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP) |
| 0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP) |
| 60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP) |
| Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP) |
| RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP) |
| RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP) |
| REAGENT SETUP |
| Solutions |
| Plasmodium cell culture media |
| 500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine |
| 0.5 ml gentamicin |
| 5 ml HT supplement |
| 2.5 ml 45% glucose |
| 25 ml 10% AlbuMAX I |
| 12.5 ml 1 M HEPES |
| Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask. |
| Plasmodium cell culture media containing 10x CHX |
| Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of: |
| 2 mM cycloheximide |
| Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter. |
| 1x PBS containing cycloheximide |
| Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use. |
| Ribosome resuspension buffer |
| 400 mM potassium acetate |
| 25 mM potassium HEPES, pH 7.2 |
| 15 mM magnesium acetate |
| 200 mM cycloheximide (add fresh) |
| 1 mM DTT (add fresh) |
| 1 mM PMSF (add fresh) |
| 40 U/ml RNaseOUT (add fresh) |
| Lysis buffer |
| Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of: |
| 1% (v/v) Igepal CA-630 |
| 0.5% (w/v) DOC |
| Sucrose solutions |
| Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose: |
| 15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution |
| 50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution |
| 0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion |
| As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh. |
| The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components |
| 60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution |
| RNA Capture Wash Buffer |
| 20mM KCl |
| 5unit/ml Rnase Out (Invitrogen) |
| RNA Capture Elution Buffer |
| Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of: |
| 2mM Biotin |
| EQUIPMENT |
| SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194) |
| SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362) |
| Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057) |
| Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372) |
| L8-80M ultracentrifuge (Beckman) |
| Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378) |
| 1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623) |
| 5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646) |
| Parafilm |
| Tube rotator, end-over-end |
| Microcentrifuge, refrigerated |
| Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179) |
| TracerDAQ (Measurement Computing) |
| Eppendorf 5810R centrifuge |
| Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807) |
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