Metoder for å undersøke om forskrifter rolle Små RNA og Ribosomalt Kapasitet av<em> Plasmodium falciparum</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

Den genetiske variasjon som er ansvarlig for sigdcelle allel (HbS) gjør det mulig å motstå erytrocytter infeksjon av malariaparasitten, P. falciparum. Den molekylære basis for denne motstand, som er kjent for å være faktorer, forblir ufullstendig forstått. Nyere studier har funnet at differensial uttrykk for erytrocytt microRNAs, gang translokerte inn malariaparasitter, påvirker både genregulering og parasitt vekst. Disse mirnas ble senere vist seg å hemme mRNA oversettelse ved å danne en kimær RNA transkripsjon via 5 'RNA fusjon med diskrete undergrupper av parasitt mRNA. Her, til teknikker som ble brukt for å studere den funksjonelle rolle og antatte mekanismen bak erytrocytt microRNAs på genregulering og translasjonelle potensialet P. falciparum, herunder transfeksjon av modifiserte syntetiske microRNAs i verts erytrocytter, skal beskrives nærmere. Endelig er en polysome gradient metode som brukes for å fastslå omfanget av translation av disse transkripsjoner. Sammen utgjør disse teknikkene tillater oss å vise at feilregulert nivåene av erytrocytt microRNAs bidra til celle-malaria indre motstand av sigd erytrocytter.

Introduction

Malaria, forårsaket av apicomplexan parasitter av slekten Plasmodium, er den mest vanlige humane parasittsykdom, globalt infiserer omtrent 200 millioner mennesker og forårsaker hvert år rundt 600.000 dødsfall ^1. Av de fem Plasmodium arter som infiserer mennesker, den mest relevante for sykdom hos mennesker er P. falciparum og P. vivax, på grunn av deres utstrakte distribusjoner og potensialet for alvorlige malaria komplikasjoner. Livssyklusen til malariaparasitten krever infeksjon av både mygg og mennesker. Når en infisert mygg biter et menneske, parasitter reise gjennom blodet til leveren, hvor en første runde av replikasjon finner sted. Etter merozoitter brudd fra verts hepatocytter, de infisere nærliggende røde blodceller, initiere enten aseksuell eller seksuell replikering. Aseksuell fasen av replikasjon, som varer i 48 timer i P. falciparum, er fokus for denne studien, siden det er både kilden til mest malaria symptomer og enkelt rekapitulert in vitro.

Mens en rekke offentlige helsetiltak, inkludert forbedret anti-malaria behandling, noe har redusert byrden av malaria globalt, presenterer den fortsatte fremveksten av resistente parasitter et problem for malaria kontroll innsats. Et område som kan foreslå nye terapeutiske tilnærminger er studiet av hvordan ulike genetiske varianter gir resistens mot malaria. I malaria-endemiske regioner, en rekke erythrocytisk polymorfismer er ganske vanlig ^2,3. Disse mutasjonene, med sigdcelle er kanskje den mest fremtredende, er ofte forbundet med betydelig motstand mot symptomatisk malaria infeksjon ^fire. De underliggende mekanismer som forårsaker de erytrocytter å motstå malaria er ufullstendig forstått. Parasitized erytrocytter med hemoglobin mutasjoner er gjenstand for økt fagocytose gjennom økt cellulær stivhet og dehydrering, somer forbundet med redusert invasjon av P. falciparum ^5. HBC allelet påvirker også protein uttrykk ved erythrocyte overflaten og med ombygging av cytoskjelettet, videre hemme parasitt utvikling ^6,7. Til slutt, P. falciparum vokser dårlig innen homozygot sigd (HBSS) erytrocytter ^8,9 in vitro, tyder iboende erythrocytisk faktorer av malaria motstand. Imidlertid, mens alle disse mekanismene synes å spille en rolle, er de ikke fullt ut forklare mekanismene bak sigdcelle motstand mot malaria.

En mulig sett erythrocytisk faktorer som fortsatt dårlig forstått er det stor pool av miRNA stede i modne erytrocytter. MicroRNAs er små RNA ikke-kodende, 19-25 nt i størrelse, som medierer oversettelse og / eller stabiliteten av mål mRNA ved baseparing i det 3'-UTR. De har vært innblandet i kontrollen av pattedyrimmunresponser, inkludert undertrykkelse of virusreplikasjon ^10, og ble vist å gi resistens mot virus i anlegg De har også vist seg å regulere flere erythrocytisk prosesser, herunder erytropoese ^11,12 og jernmetabolismen ^13. Tidligere studier identifisert et rikt og mangfoldig befolkning på erythrocytisk mirnas, hvis uttrykket ble dramatisk endret i HBSS erytrocytter ^14,15. Siden modne erytrocytter mangler aktiv transkripsjon og oversettelse, den funksjonelle rollen til disse erytrocyttransfusjoner mirnas fortsatt uklart. Som betydelige materielle utveksling oppstår mellom vertscellen og P. falciparum under intraerythrocytic utviklingssyklus (IDC) ^16, ble det spekulert i at endret miRNA profil innenfor HBS erytrocytter kan direkte bidra til celle-egenverdi malaria motstand.

Disse studiene til slutt førte til utviklingen av en rørledning for å isolere, identifisere og funksjonelt studere rollen til human miRNA i malaria parasitt, P. falciparum, som indikerte at de vert / menneskelige mirnas slutt kovalent sikringen og deretter translasjonsmessig undertrykke parasitt mRNA transkripter ^17. Dette ga et eksempel på det første kryss-arter kimære transkripter som dannes ved trans-spleising, og impliserer at det miRNA-mRNA-fusjons ha oppstått i andre arter, inkludert andre parasitter. Alle trypanosom mRNA er trans-spleiset med en skjøt-leder (SL) for å regulere separeringen av polycistronisk transkripsjoner ^18. Siden P. falciparum mangler ortologer for dicer / Ago ^19,20, er det mulig at erythrocyte mirnas kapre lignende SL maskiner i P. falciparum å integrere i mål gener. Nyere studier i P. falciparum har nemlig indikerte tilstedeværelse av 5 'spleise-ledersekvenser ^21. Denne studien detaljer metodene som førte til oppdagelsen av menneske parasitt miRNA-mRNA fusion transkripsjoner, inkludert både transcriptomic og omregningelle reguleringsteknikk. De overordnede målene for disse metodene er å undersøke effektene av små RNA i genregulering, fenotyper og oversettelse potensialet P. falciparum transkripsjoner.

Den innledende identifisering av menneske parasitt kimere transkripsjoner stoles på bruk av RNA-analyseteknikker, slik som real-time PCR, transkriptomet sekvensering og EST bibliotek fangst, som omfattet både totalt og små RNA, i stedet for å bruke teknikker som bare isolerte små RNA. Isolere alle RNA sammen i en stort basseng, i stedet for separat, tillot identifisering av begge translokerte humane små RNA i parasitten, i tillegg til tilstedeværelsen av disse små RNA-sekvenser som del av en større sekvens. Det kreves da en analyse av tilstanden oversettelsen av disse fusjons mRNA for å bestemme de funksjonelle konsekvenser av disse fusjoner.

Mens omfattende innsats på karakterisering av parasitten genom end transkriptomet har lagt til forståelsen av parasittens biologi ^22-25, er langt mindre kjent om translasjonsforskning regulering av mRNA transkriptomet over livssyklusen til P. falciparum ^26. Dette begrenset forståelse av parasittens proteom- har hindret både forståelse av parasittens biologi og evnen til å identifisere nye mål for neste generasjon av anti-malaria therapeutics. Dette gapet i forståelsen av parasittens cellebiologi har vedvart i stor grad på grunn av mangel på tilstrekkelige teknikker for å undersøke translasjonsforskning regulering i P. falciparum. En nyere artikkel beskrev bruk av ribosomalt footprinting av P. falciparum for å bestemme den globale oversettelsen status ^21. En godt etablert måling av translatorisk potensialet transkripter er antall tilknyttede ribosomer bestemt ved polysome profilering. Når denne teknikken anvendes til P. falciparum </ em>, er det i stand til å gjenopprette de fleste polysomes og fanger hovedsakelig monosomes. Nylig har flere grupper ^27,28 optimalisert P. falciparum polysome teknikker ved lyse erytrocytt og parasitten samtidig å bevare polysomes og karakterisere ribosomal belegg og translasjonell potensialet i disse malariaparasitter under aseksuell utvikling i verts røde celler ^28.

Kollektivt, disse metodene viser at den observerte fusjon av menneskelige miRNA og parasitt mRNA modulerer parasitt protein oversettelse av disse fusjons mRNA, som ble demonstrert ved hjelp av tidligere rapporterte metoder ^27, og er en viktig faktor for malaria motstand i HBA og HBSS erytrocytter ^17. Disse metodene vil være nyttig i ethvert system som ønsker å identifisere og funksjonelt utforske RNA spleising hendelser, enten disse fusjons RNA er innenfor P. falciparum eller andre eukaryote systemer.

Protocol

1: Isolering av små dimensjoner RNA fra P. falciparum Under IDC Skaff malariaparasitter i aseksuell kultur 29. MERK: Den nødvendige kulturen Størrelsen vil variere basert på ønsket program; imidlertid en 10 ml kultur på 3-5% parasittemi og 5% hematokritt gir god RNA for sanntids-PCR (RT-PCR). Teknikken ble opprinnelig optimalisert for asynkrone kulturer, men når bestemte tidspunkter i løpet av infeksjonssyklusen er ønskelig, kan ring-trinns parasitter synkroniseres av sorbi…

Representative Results

Global profilering av menneskelig mikroRNA i P. falciparum Teknikkene er presentert her ble anvendt for å ekstrahere microRNAs fra parasitter i en rekke forhold. En ting å merke seg er at RNA ekstraksjon for uinfiserte RBC ble utført som angitt i 32, som ofte fungerte som et referansepunkt for de mikroRNA data presentert i både denne artikkelen og den opprinnelige studien 29. De tidligere studier også vist at HBSS erytrocytter besatt langt høyere nivåer …

Discussion

HbS er en av de mest vanlige hemoglobinvarianter i malaria endemiske områder, i stor grad fordi den gir beskyttelse mot alvorlig malaria forårsaket av P. falciparum. Teknikkene som er nødvendig for å karakterisere rollen til human mikroRNA i genregulering av P. falciparum er detaljert gjennom dette manuskriptet. Ved å ekstrahere total-RNA på en slik måte at det omfatter alle små RNA, og ved å utføre en relativt grei parasitt lyse prosedyre disse fusjons RNA var i stand til å bli identifisert…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)