Metoder til undersøgelse af Regulatory rolle små RNA og Ribosomal Belægning af<em> Plasmodium falciparum</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

Den genetiske variation er ansvarlig for seglcelle-allelen (HB) giver erythrocytter til at modstå infektion med malariaparasitten, P. falciparum. Den molekylære basis for denne modstand, som er kendt for at være multifaktoriel, forbliver ufuldstændigt forstået. Nylige undersøgelser fandt, at forskellen udtryk for erythrocyt microRNA'er, når omplantede i malariaparasitter, påvirker både genregulering og parasit vækst. Disse miRNA blev senere vist sig at hæmme mRNA translation ved at danne en kimære RNA udskrift via 5'-RNA fusion med diskrete undergrupper af parasit mRNA. Her til de teknikker, der blev brugt studere den funktionelle rolle og formodede mekanisme bag erythrocyt microRNA på genregulering og translationel potentiale P. falciparum, herunder transfektion af modificerede syntetiske microRNA ind i værtsceller erytrocytter, vil blive nærmere beskrevet. Endelig er en polysom ​​gradient anvendt til at bestemme omfanget af translation af disse transkripter. Sammen disse teknikker tilladt os at vise, at de dysregulerede niveauer af erythrocyt microRNA'er bidrager til celle-iboende malaria modstand segl erytrocytter.

Introduction

Malaria forårsaget af Apicomplexan parasitter af slægten Plasmodium, er den mest almindelige humane parasitsygdom, globalt inficerer ca. 200 millioner mennesker hvert år og forårsager omkring 600.000 dødsfald ^1. Af de fem Plasmodium arter, der inficerer mennesker, den mest relevante for human sygdom er P. falciparum og P. vivax, på grund af deres udbredte distributioner og potentiale for alvorlige malaria komplikationer. Livscyklus malariaparasitten kræver infektion af både myg og mennesker. Når en inficeret myggestik et menneske, parasitterne rejse gennem blodbanen til leveren, hvor en første runde af replikation finder sted. Efter merozoiter brud fra værten hepatocyt, de inficerer nærliggende røde blodlegemer, indledning enten ukønnede eller seksuel replikation. Ukønnet replikationsstadium, som varer 48 timer i P. falciparum, er fokus for denne undersøgelse, da det er både kilden til de fleste malaria symptomer og let sammenfattet in vitro.

Mens en række offentlige sundhedstiltag, herunder forbedrede anti-malaria behandlinger, noget har reduceret byrden af ​​malaria globalt, den fortsatte fremkomst af lægemiddelresistente parasitter udgør et problem for malaria kontrolindsats. Et område, der kan foreslå nye terapeutiske fremgangsmåder er undersøgelse af, hvordan forskellige genetiske varianter giver resistens over for malaria. I malaria-endemiske områder, en række erythrocytiske polymorfier er helt almindelige ^2,3. Disse mutationer, med seglcelle er måske den mest fremtrædende, er ofte forbundet med en betydelig modstand mod symptomatisk malariainfektion ^4. De underliggende mekanismer, som de forårsager erythrocytter at modstå malariainfektion er ufuldstændigt forstået. Parasitized erytrocytter med hæmoglobin mutationer er underlagt forstærket fagocytose gennem øget cellulær stivhed og dehydrering, somer forbundet med nedsat invasion af P. falciparum ^5. HBc allelen påvirker også proteinekspression på erythrocyt overflade og med ombygningen af cytoskelettet, yderligere inhibering parasit udvikling ^6,7. Endelig P. falciparum vokser dårligt inden homozygot seglcelle (HBSS) erythrocytter ^8,9 in vitro, hvilket tyder på iboende erythrocytiske faktorer af malaria modstand. Men mens alle disse mekanismer synes at spille en rolle, at de ikke fuldt ud forklare mekanismerne bag seglcelle resistens over for malaria.

Et potentielt sæt erythrocytiske faktorer, der forbliver dårligt forstået er den store pulje af miRNA stede i modne erythrocytter. MikroRNA'er er små ikke-kodende RNA'er, 19-25 nt i størrelse, der medierer oversættelse og / eller stabiliteten af ​​mål-mRNA'er ved baseparring i 3'UTR. De er blevet impliceret i kontrollen af ​​mammale immunreaktioner, herunder suppression of virusreplikation ^10, og viste sig at give resistens over for virus i planter De har også vist sig at regulere flere erythrocytiske processer, herunder erythropoiese ^11,12 og jern metabolisme ^13. Tidligere undersøgelser identificeret en rigelig og varieret bestand af erythrocytiske miRNA, hvis ekspression blev dramatisk ændret i HBSS erythrocytter ^14,15. Da modne erythrocytter mangler aktive transskription og translation, den funktionelle rolle af disse erythrocyt miRNA fortsat uklart. Som betydelig materiel udveksling forekommer mellem værtscellen og P. falciparum under intraerythrocytic udviklingsmæssige cyklus (IDC) ^16, blev det spekuleret på, at ændret miRNA profilen HBs erythrocytter kan bidrage direkte til celle-intrinsisk malaria modstand.

Disse undersøgelser førte i sidste ende til udviklingen af ​​en rørledning til isolation, identifikation og funktionelt undersøge den rolle af humant miRNA inden for malaria parasit, P. falciparum, hvoraf det fremgik, at de pågældende vært / menneskelige miRNA i sidste ende kovalent sikringen og derefter translatorisk undertrykke parasit mRNA-transkripter ^17. Dette gav et eksempel på de første cross-arter kimære udskrifter dannet af trans-splejsning, og implicerer, at denne miRNA-mRNA fusion være opstået i andre arter, herunder andre parasitter. Alle trypanosominfektion mRNA er trans-splejset med en splejsning-leder (SL) til at regulere adskillelsen af polycistroniske udskrifter ^18. Da P. falciparum mangler orthologer for Dicer / Ago ^19,20, er det muligt, at erythrocyt miRNA kapre lignende SL maskiner i P. falciparum at integrere i målgener. Nylige undersøgelser i P. falciparum har rent faktisk indikerede tilstedeværelsen af 5 'splejsnings ledersekvenser ^21. Denne undersøgelse beskriver de metoder, der førte til opdagelsen af ​​menneskelige-parasit miRNA-mRNA fusion udskrifter, herunder både transkriptom og oversætnale regulering teknikker. De overordnede mål for disse metoder er at undersøge virkningerne af små RNA i genregulering, fænotyper og oversættelse potentiale P. falciparum udskrifter.

Den oprindelige identifikation af humane-parasit kimære udskrifter påberåbes brugen af ​​RNA-analyse teknikker, såsom real-time PCR, transkriptom sekventering og EST bibliotek opsamling, som omfattede både totale og små RNA, snarere end at bruge teknikker, som kun isolerede små RNA. Isolering alle RNA sammen i en stor pulje, snarere end separat, tillod identificering af begge translokeres humane små RNA'er i parasitten samt tilstedeværelsen af ​​disse små RNA-sekvenser som del af en større sekvens. Dette krævede derefter en analyse af oversættelsen tilstand disse fusion mRNA'er vurderes de funktionelle konsekvenser af disse fusioner.

Mens omfattende indsats på karakterisering af parasitten genom end transkriptom har føjet til forståelsen af parasittens biologi ^22-25, er langt mindre kendt om translationel regulering af mRNA transkriptomet tværs livscyklus P. falciparum ^26. Denne begrænsede forståelse af parasittens proteom har hindret både forståelse af parasittens biologi og evnen til at identificere nye mål for den næste generation af anti-malaria terapi. Dette hul i forståelsen af parasittens cellebiologi har varet i høj grad skyldes manglen på passende teknikker til at undersøge translationel regulering i P. falciparum. En nylig undersøgelse beskrev anvendelsen af ribosomale fodaftryk af P. falciparum at bestemme den globale oversættelse status ^21. En veletableret måling af translationel potentiale transkripter er antallet af associerede ribosomer bestemmes af polysom ​​profilering. Men når denne teknik anvendes til P. falciparum </ em>, ikke er i stand til at inddrive de fleste polysomer og indfanger overvejende monosomer. For nylig har flere grupper ^27,28 optimeret P. falciparum polysom ​​teknikker ved at lysere erythrocyt og parasitten samtidig at bevare polysomerne og karakterisere det ribosomale belægning og translationel potentiale i disse malaria parasitter under deres aseksuelle udvikling i værtens røde blodlegemer ^28.

Kollektivt, disse metoder viser, at den observerede fusion af humane miRNA og parasit mRNA modulerer parasit proteintranslation af disse fusion mRNA, som blev demonstreret ved hjælp af tidligere rapporterede metoder ^27, og er en vigtig faktor for malaria modstand i HBA'er og HBSS erythrocytter ^17. Disse metoder ville være nyttig i ethvert system søger at identificere og funktionelt udforske RNA splejsningsbegivenheder, om disse Fusion RNA'er er inden P. falciparum eller andre eukaryote systemer.

Protocol

1: Isolering af små RNA fra P. falciparum Under IDC Opnå malariaparasitter i ukønnet kultur 29. BEMÆRK: Den nødvendige kultur størrelse vil variere baseret på den ønskede anvendelse; imidlertid en 10 ml kultur på 3-5% parasitæmi og 5% hæmatokrit giver rigelig RNA til realtids-PCR (RT-PCR). Teknikken blev oprindeligt optimeret til asynkrone kulturer, men når specifikke tidspunkter under infektionen cyklus ønsket kan ring-stadie parasitter synkroniseres af sorbitol synkro…

Representative Results

Global profilering af human microRNA i P. falciparum Teknikkerne, der præsenteres her blev anvendt til at ekstrahere microRNA fra parasitter i en række tilstande. Én ting at bemærke er, at RNA-ekstraktioner for inficerede røde blodlegemer blev udført som angivet i 32, som ofte serveres som et referencepunkt for microRNA data præsenteret i både denne artikel og den oprindelige undersøgelse 29. Disse tidligere undersøgelser viste også, at HBSS…

Discussion

HbS er en af de mest almindelige hæmoglobinvarianter i malaria endemiske områder, hovedsagelig fordi det giver beskyttelse mod alvorlig malaria forårsaget af P. falciparum. Teknikkerne er nødvendig for at karakterisere rollen af human microRNA i genregulering af P. falciparum er beskrevet i hele dette håndskrift. Ved ekstraktion total RNA på en sådan måde, at det omfatter alle små RNA'er, og ved at udføre en forholdsvis enkel parasit lyseringsprocedure disse Fusion RNA&#…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)