Abstract
Son zamanlarda, iPSCs rejeneratif tedaviler için hücrelerin yeni kaynağı olarak dikkat çekmiştir. Üreten iPSCs için ilk yöntem invaziv biyopsi ve transgenlerin retroviral genomik yerleştirilmesi ile elde edilen dermal fibroblastlar dayanıyordu olsa da, bu dezavantajları önlemek için birçok çaba olmuştur. İnsan periferal T-hücreleri iPSCs üretilmesi için benzersiz bir hücre kaynağıdır. T hücrelerinden türetilen iPSCs T hücre reseptörü (TCR) genlerinin yeniden düzenlemeleri içerir ve antijen-spesifik T hücrelerinin bir kaynağıdır. Buna ek olarak, genom içinde T hücresi reseptörü yeniden düzenleme Bireysel hücre serilerinin etiket ve nakledilen ve donör hücreleri ayırt etmek için bir potansiyele sahiptir. IPSCs güvenli klinik uygulama için, zararlı ajanlara yeni oluşturulan iPSCs ortaya çıkma riskini en aza indirmek için önemlidir. Fetal büyükbaş hayvan serumu ve besleme hücreleri pluripotent kök hücre kültürü için gerekli olmasına rağmen, bu riskini azaltmak için kültür sistemi kaldırmak için tercih ediliröngörülemeyen patojenli. Bu gidermek için, tanımsız patojenlere iPSCs ortaya çıkma riskini azaltmak için Sendai virüsü kullanılarak insan periferik T hücrelerinden iPSCs üretilmesi için bir protokol kurduk. Sendai virüsü taşıma, uygun biyogüvenlik düzeyi ile ekipman gerektirir rağmen, Sendai virüsü bozar genom ekleme olmadan T hücrelerinin aktive henüz yüksek verimlilik ile. Bu protokol, aktive edilmiş T hücre kültürü ve Sendai virüsü bir kombinasyonu kullanılarak besleyici içermeyen koşullar, insan periferik T hücrelerinden iPSCs üretilmesini göstermektedir.
Introduction
iPSCs rejeneratif tıp 1-3 için hücre çığır kaynağı olarak büyük ilgi çekmiştir. Bugüne kadar, iPSCs üretilmesi için çeşitli yöntemler 4,5 bildirilmiştir. Bunlar arasında, insan T hücrelerinden üretilen iPSCs çünkü cep örnekleme 6-8, daha az invazif yöntemin özel ilgi olmuştur. Buna ek olarak, T hücrelerinden türetilen iPSCs T hücre reseptörü (TCR) geninin yeniden düzenlenmesi içerir ve dolayısıyla antijen-spesifik T hücrelerinin 9,10 kaynağıdır. Bu nedenle, T-hücresi türevli iPSCs üreten güvenli rejeneratif tıp devam edebilmek için yararlıdır.
Bu yöntem, öngörülemeyen patojenite riskini azaltma kavramına dayanmaktadır. IPSCs güvenli klinik uygulama için bu patojenlere 11 maruz kalma riskini azaltmak için çok önemlidir. Daha önce pluripotent kök hücrelerin bir çok kültür sistemlerinde, fetal sığır serumu ve besleme hücreleri esas reaktif olarak kullanılmaktadır12 s. IPSC üretimi öngörülemeyen patojenik riskini azaltmak için Ancak, kültür sistemi, bu reaktiflerin iki çıkarılması tercih edilir.
Buna ek olarak, bu yöntem, hasta ve besleyici hücreler zahmetli preparatından invaziv hücre örnekleme önüne geçme avantajına sahiptir. T hücresi türevli iPSCs önce hastalığı araştırma 13,14 başarıyla kullanılmıştır, bu yöntem, aynı zamanda hastaların hastalığa özgü iPSCs üretilmesi için kullanılabilir ve yararlıdır.
Bir gen taşıyıcı olarak Sendai virüsü (SeV) vektörü kullanılarak T hücre yeniden programlama yöntemleri arasında, yüksek verimlilik, 7,16 ile iPSCs üreten bir yöntemdir. SeV tek iplikli bir RNA virüsüdür ve replikasyon için bir DNA faz gerek yoktur, çünkü ek olarak, iPSC üretimindeki kullanımı konakçı genomu 17-19 kırılma önler. Bu nedenle, serum-fr insan periferik T hücrelerinden iPSCs üretilmesi için protokoller kurdukee ve matrigel, mTeSR ortamı bir kombinasyonu kullanılarak besleyici içermeyen koşulları ve SeV vektörler.
Protocol
1. aktiflediği insan T hücrelerindeki hazırlayın
- Damarından bir donörden tam kan heparinize 10 ml toplayın.
- Venipunktür önceden donörlerin aydınlatılmış onam. Venipunktür kalifiye ve eğitimli personel tarafından yapılmalıdır.
- Steril ekipman ve aşağıdaki uygun biyogüvenlik kurallarına elde edilen kan örnekleri taşıyınız.
- 10 ml D-PBS ile bütün kan heparinize 10 ml seyreltik (-).
- Yeni 50-ml konik tüp içine 15 ml Ficoll solüsyonu (Ficoll Paque PREMIUM) koyun.
- Adım 1.3 Ficoll çözeltisi üzerine Adım 1.2 hazırlanan 20 ml kan çözümü Katman. Elektrikli bir pipet kullanılarak, kan solüsyonu tüpün iç duvarı boyunca yavaş yavaş Aşama 1,2 çalıştırmak hazırlandı sağlar. Kan çözümü ve Ficoll çözüm karıştırmak için dikkatli olun.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. "Yavaş" santrifüj yavaşlama hızını ayarlayın.
Not: Santrifüj işleminden sonra, beyaz bir incetabaka bir üst sütlü plazma tabakası ve alt net bir Ficoll katmanı arasında ortaya çıkar. Bu beyaz ince tabaka mononükleer hücreleri içerir. - Bir 1 ml pipet ile yeni bir 50-ml'lik konik tüpe tek çekirdekli hücre katmanı aktarın. Ficoll çözüm dahil vermemek için dikkatli olun.
- D-PBS (-) ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de, toplam 10 ml'lik bir hacme ve santrifüj mononükleer hücrelerine temin etmektedir.
- Süpernatantı atın. Tek-çekirdekli hücreleri, ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj (-) D-PBS, 10 ml ekleyin.
- Süpernatantı atın toplanan mononükleer hücrelere KBM502 orta 1 ml ekleyin ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. X 10 6 5 üzerinde tek çekirdekli hücreler, uygun bir ayırma Ficoll kullanılarak, tam kanın heparinize 10 ml elde edilebilir.
- D-PBS içinde 10 ug / ml'lik bir konsantrasyonda, bir anti-insan CD3 antikoru solüsyonu hazırlayın (-). Sörf emmek 6-çukurlu plaka anti-insan CD3 antikoru solüsyonu ilaveHer bir ası de ve en az 30 dakika boyunca% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe çanak.
- Her bir anti-insan CD3 antikor çözüm çıkarın ve D-PBS ile bir kez yıkanır (-) tohum hücreleri hemen önce.
- KBM502 ortam içinde anti-insan CD3 antikoru ile kaplanmış 6-yuvalı plakalar üzerinde 2.5 x 10 5 hücre / cm2 yoğunluğunda Aşama 1,9 hazırlandı Tohum mononükleer hücreleri. T hücreleri konfluansa ulaşana kadar bir ortam değişikliği olmadan 3-7 gün boyunca% 5 -CO 2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edilir. Bu dönemde, T-hücreleri, hem süspansiyon haline getirilmiş ve yapışan hücreler bulunmaktadır.
SeV Vektörler 2. Infect İnsan T hücrelerinin
- 3-7 gün kültürden sonra, pipetleme orta mevcut aktive edilmiş T hücreleri toplamak. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g 'de 15 ml konik tüp ve santrifüj aktarın.
- Süpernatantı ve 1 ml taze KBM502 orta ekleyin. Hücreleri saymak ve 1 plaka.5 x 10 6 hücre, bir anti-CD3 antikoru ile kaplanmış 6-çukurlu plakanın her oyuğuna (2 ml taze KBM502 ortamı içerisinde).
- Buz üzerinde Zeiss OCT3 / 4-SeV / TSΔF, Sox2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF ve c-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF arasında SeV çözüm çözülme.
- Zeiss OCT3 / 4-SeV / TSΔF, Sox2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF ve c-myc (HNL) ihtiva eden SeV çözümler ekleyin -SeV / TS15ΔF ayrı ayrı gözlere, enfeksiyon çokluğunda her (MOI) Bir başka 24 saat süreyle% 5 -CO 2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe 10. bölgesinin.
3. İnsan T Hücreleri SeV Vektörler kaldır
- 24 saat enfeksiyondan sonra, bir pipetle enfekte hücreleri toplamak. Yapışan hücreler varsa, onlar kolayca defalarca yukarı ve aşağı onları pipetleme ayrılabilir. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g 'de 15 ml konik tüp, ve santrifüj aktarın.
- SeV vektörleri içeren süpernatant kaldırmak ve 2 ml taze KBM502 orta ekleyin. EAC içinde Replate hücrelerkuyuların h. Ek bir 24 saat boyunca bir% 5 -CO 2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edilir.
Bir Matrigel Katman 4. reseed Hücreler
- 4 ° C 'de (Bu çalışmada kullanılan özel markasıyla Malzeme Listesi bakınız) ve DMEM / F12 ortamı içinde 10 ml 0.2 ml eritilmesi çözülme matris jel bazal membran matrisi çözeltisi hazırlayın.
Not: The Matrix jeli (bu çalışmada kullanılan belirli bir marka için malzemeler listesi bakınız) 4 ° C'de tamamen çözülmüş olması O / N çözülme gerekiyor. Kullanmadan önce kadar buz üzerinde tutun. - 100 mm'lik tabaklara tabak başına Levha 5 mi bazal membran matrisi çözeltisi ve tohum hücreleri önce en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. En az iki adet 100 mm çanağı bir deney için ihtiyaç vardır.
- , Pipetleme SeV enfekte olmuş hücreleri toplamak, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml konik tüp, ve santrifüj aktarın.
- Süpernatantı ve 1 ml taze KBM502 orta ekleyin. Ce sayısınıHemasitometre kullanarak lls Adım 4.2 ve plaka hazırlanan 100 mm yemeklerinden bazal membran matris çözümü kaldırmak 1 × 10 5 ve 1 × 10 6 hücre 100 mm bazal membran matris kaplı üzerinde (10 ml taze mTeSR orta olarak) yemekler. Son olarak, koloniler kolayca çekilen hangi plakayı kullanın.
- % 5 CO 2 inkübatör O / N 37 ° C 'de çanak inkübe edin.
- 10 orta değiştirmek mi her gün mTeSR orta eti.
Not: enfeksiyondan sonra yaklaşık 20-30 gün, yakından embriyonik kök hücreler (EKH) benzer koloniler görünecektir.
5. T-hücresinden alınan iPSCs aç
- 4 ° C 'de (Bu çalışmada kullanılan özel markasıyla Malzeme Listesi bakınız) ve DMEM / F12 ortamı içinde 10 ml 0.2 ml eritilmesi çözülme matris jel bazal membran matrisi çözeltisi hazırlayın.
- Levha 1, 6-çukurlu plaka içinde çukur başına bazal membran matrisi çözeltisi ve en oda sıcaklığında bırakınkoloniler almadan önce en az 30 dakika.
- MTeSR ortamının 20 ul, 96 oyuklu bir plaka Dolgu ile sabitleştirilir.
- 20 ul pipet kullanarak stereomicroscope altında EKH benzer koloniler seçin.
Not: Şekil 1B gösterildiği gibi EKH ve iPSCs kolonileri yuvarlak ve düzdür. - Aşama 5.3 mTeSR ortamı ile doldurulmuş 96 oyuklu bir plakaya transfer seçilmiş kolonileri.
- 200 ul pipet kullanarak stereomicroscope altında küçük öbekler halinde koloni kırmak için aşağı yukarı pipet ve dikkatle her kuyuya mTeSR orta 200 ul ekleyin ve. 5.2 de hazırlanan gelen bazal membran matrisi çözeltisi çıkarın ve mTeSR orta 2 ml bazal membran matris ile kaplanmış 6-çukurlu plakanın bir oyuğuna, her bir koloni koyun ile sabitleştirilir.
- 2 orta değiştirmek mi her gün mTeSR orta eti.
6. T hücre-türevi iPSCs korumak
T hücresi kaynaklı iPSCs korunabilirve insan ve insan iPSCs EKH aynı teknikler kullanılarak muhafaza edilmiştir. IPSC kolonileri büyümek kez aynı prosedürü tekrar ederek büyük yemeklerin içine genişletin.
- Her 1-2 gün mTeSR orta değiştirin.
- Koloniler Konfluent hale geldiğinde her 5-7 gün, insan iPSCs ve üreticinin talimatlarına göre insan EKH için ayrılma çözümü kullanarak geçiş hücreleri.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak, kullanıcı kararlı bir şekilde insan periferik T hücrelerinden iPSCs elde edebiliyoruz. . Birkaç geçiş sonrası tespit olmayan birden çok verici olgu ve sev arasında bir hücrenin yeniden programlanması verimliliği% 0.005 16 Şekil 1A T üretilmesi için prosedürün şematik hücre türevli gösterir - SeV ve Matrigel ile T hücrelerinden iPSC üretimi yaklaşık% 0.002 gösterdi Matrigel ve mTeSR ortamı kullanılarak besleyici içermeyen koşullarda iPSCs. Çevresi 20-30 gün sev ile enfeksiyondan sonra, iPSC koloniler ESC koloni gibi morfolojisi (Şekil 1B) tarafından kabul edilmektedir. Immünofloresan boyama tipik pluripotent hücre belirteçleri ekspresyonunu gösterdi (Nanog, Zeiss OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 ve TRA-1-81), T hücresi kaynaklı iPSCs besleyici içermeyen koşullar (Şekil 1C) altında elde edilen.
"Width =" 700 "/>
Şekil 1. (A): Bu çalışmada, besleyici içermeyen koşullar altında yeniden programlama T hücreleri için protokol şematik. (B): besleyici içermeyen koşullar altında kan örneği gün sonra 27 bulunan tipik bir ESC benzeri iPSC koloni. (C)., T hücresi kaynaklı iPSCs ALP boyanması ve pluripotense ve yüzey markörleri için immünofloresan boyama (Nanog, Zeiss OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 ve TRA-1-81) besleyici içermeyen koşullar altında elde edin Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip ya da ifşa etmek çıkarları çatışan var.
Acknowledgments
Biz teknik yardım için Tıp Keio Üniversitesi School Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi ve Rei Ohno teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen sağlığı araştırma sonuçlarının pratik kullanımını hızlandırmak için bir Ar-Ge Sistemleri destek programı ve Rejeneratif Tıp Gerçekleşmesi için Karayolları Programı tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
