Abstract
في الآونة الأخيرة، جذبت iPSCs الاهتمام باعتبارها مصدرا جديدا من الخلايا للعلاجات التجدد. على الرغم من أن طريقة الأولي لiPSCs توليد تعتمد على الخلايا الليفية الجلدية التي حصلت عليها خزعة الغازية والإدراج الجيني فيروسات من الجينات المحورة، كان هناك الكثير من الجهود لتجنب هذه العيوب. خلايا T الطرفية البشرية هي مصدر الخلايا فريدة من نوعها لتوليد iPSCs. iPSCs المستمدة من الخلايا T تحتوي على إعادة ترتيب للمستقبلات الخلايا T (TCR) الجينات وتشكل مصدرا للخلايا T مستضد معين. بالإضافة إلى ذلك، T مستقبلات الخلية إعادة ترتيب في الجينوم لديه القدرة على تسمية خطوط الخلايا الفردية والتمييز بين الخلايا المزروعة والجهات المانحة. لالتطبيق السريري الآمن للiPSCs، فمن المهم للحد من خطر تعريض iPSCs ولدت حديثا لعوامل ضارة. على الرغم من خلايا الدم وتغذية الأبقار الجنين كانت ضرورية لزراعة الخلايا الجذعية المحفزة، فمن الأفضل لإخراجها من النظام الثقافة للحد من مخاطرالمرضية لا يمكن التنبؤ بها. ولمعالجة ذلك، أنشأنا بروتوكول لتوليد iPSCs من خلايا T الطرفية البشرية باستخدام فيروس سينداي للحد من خطر تعريض iPSCs لمسببات الأمراض غير محددة. على الرغم من أن التعامل مع فيروس سينداي تتطلب معدات مع المستوى المناسب للسلامة الأحيائية، سينداي يصيب فيروس تنشيط خلايا T دون الجينوم الإدراج، ولكن مع كفاءة عالية. في هذا البروتوكول، علينا أن نظهر توليد iPSCs من خلايا T الطرفية الإنسان في ظروف خالية من وحدة التغذية باستخدام مزيج من تنشيط زراعة الخلايا T وفيروس سينداي.
Introduction
جذبت iPSCs اهتماما كبيرا كمصدر رائد الخلايا الطب التجديدي 1-3. حتى الآن، تم الإبلاغ عن وسائل متنوعة لتوليد iPSCs 4،5. ومن بين هؤلاء، كان iPSCs المتولدة من خلايا T الإنسان أهمية خاصة نظرا للطريقة أقل الغازية من الخلايا أخذ العينات 6-8. بالإضافة إلى ذلك، iPSCs المستمدة من الخلايا T تحتوي على إعادة ترتيب للمستقبلات الخلايا T (TCR) الجين وبالتالي فهي مصدر للخلايا T مستضد معين 9،10. لذلك، وتوليد خلايا T المستمدة iPSCs مفيد للتقدم الطب التجديدي بأمان.
ويستند هذا الأسلوب على مفهوم الحد من مخاطر المرضية لا يمكن التنبؤ بها. لالتطبيق السريري الآمن للiPSCs من المهم للحد من مخاطر التعرض لمسببات الأمراض (11). سابقا في العديد من النظم الثقافة من الخلايا الجذعية المحفزة، وقد استخدمت خلايا الدم وتغذية الأبقار الجنينية، وكاشف أساسيق 12. ومع ذلك، وإزالة كل من هذه الكواشف من النظام الثقافة هي المفضلة لتوليد التوجيهية للحد من خطر الإصابة المرضية لا يمكن التنبؤ بها.
بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الأسلوب له ميزة تجنب أخذ عينات الخلايا الغازية من المرضى وإعداد شاقة من الخلايا المغذية. لأنه قد تم بالفعل استخدام الخلايا التائية iPSCs المستمدة بنجاح في بحوث الأمراض 13،14، وهذا الأسلوب هو المعمول بها ومفيدة لتوليد iPSCs بأمراض محددة من المرضى أيضا.
بين T أساليب إعادة برمجة الخلايا، وذلك باستخدام فيروس سينداي (SEV) ناقلات كوسيلة الجينات هي الطريقة التي يمكن أن تولد iPSCs بكفاءة عالية 7،16. بالإضافة إلى ذلك، لأن SEV هو فيروس RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ولا يحتاج إلى مرحلة DNA للنسخ المتماثل، واستخدامه في توليد التوجيهية يتجنب كسر الجينوم المضيف 17-19. لذلك، أنشأنا بروتوكولات لتوليد iPSCs من خلايا T الطرفية الإنسان في المصل الابه ه وظروف خالية من وحدة التغذية باستخدام مزيج من matrigel، mTeSR المتوسطة، وSEV ناقلات.
Protocol
1. إعداد المنشط خلايا T الإنسان
- جمع 10 مل heparinized الدم الكامل من الجهات المانحة عن طريق بزل الوريد.
- الحصول على الموافقة المسبقة من الجهات المانحة في وقت مبكر من بزل الوريد. ويجب أن يتم بزل الوريد من قبل موظفين مؤهلين ومدربين.
- التعامل مع عينات الدم التي تم الحصول عليها مع معدات معقمة والمبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية المناسبة التالية.
- تمييع 10 مل heparinized الدم الكامل مع 10 مل D-PBS (-).
- وضع 15 مل Ficoll الحل (PREMIUM Ficoll-Paque) في أنبوب مخروطي 50 مل الجديد.
- طبقة الحل الدم 20 مل أعدت في الخطوة 1.2 على حل Ficoll في الخطوة 1.3. باستخدام ماصة الكهربائية، والسماح حل الدم أعدت في الخطوة 1.2 تشغيل ببطء على طول الجدار الداخلي للأنبوب. يجب الحرص على عدم خلط الحل الدم وحل Ficoll.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 30 دقيقة في RT. ضبط سرعة التباطؤ الطرد المركزي ل"بطيء".
ملاحظة: بعد الطرد المركزي، بيضاء رقيقةطبقة تبرز بين طبقة البلازما حليبي العلوية وطبقة Ficoll أقل واضحة. هذه الطبقة رقيقة بيضاء يحتوي على خلايا وحيدات النوى. - نقل طبقة الخلايا وحيدة النواة إلى أنبوب مخروطي 50 مل جديد مع ماصة 1-مل. يجب الحرص على عدم تضمين حل Ficoll.
- إضافة D-PBS (-) إلى الخلايا وحيدة النواة إلى إجمالي حجم 10 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق على RT.
- تجاهل طاف. إضافة 10 مل من D-PBS (-) إلى الخلايا وحيدة النواة، وأجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق على RT.
- تجاهل طاف، إضافة 1 مل من KBM502 متوسطة إلى الخلايا وحيدة النواة التي تم جمعها، وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. ويمكن الحصول على أكثر من 5 × 10 6 خلايا وحيدة النواة من 10 مل heparinized الدم كله مع فصل ملائم باستخدام Ficoll.
- يعد حل الأجسام المضادة CD3 مكافحة الإنسان في تركيز 10 ميكروغرام / مل في D-PBS (-). إضافة محلول CD3 الأجسام المضادة البشرية لوحة 6 جيدا، نقع الأمواجالآس كل بئر، واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- إزالة الحل CD3 الأجسام المضادة البشرية من كل بئر ويغسل مرة واحدة مع D-PBS (-) فقط قبل البذر الخلايا.
- الخلايا وحيدة النواة البذور التي تم إعدادها في الخطوة 1.9 في كثافة 2.5 × 10 5 خلية / سم 2 على CD3 مكافحة الإنسان المغلفة الأضداد 6 لوحات جيدة في KBM502 المتوسطة. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ -co 2 الحاضنة لمدة 3-7 أيام بدون تغيير المتوسطة حتى الخلايا T تصل confluency. خلايا T في هذه الفترة كل من الخلايا مع وقف التنفيذ والالتزام.
2. تصيب الإنسان خلايا T مع SEV المتجهات
- بعد ثقافة 3-7 أيام، وجمع الخلايا T تفعيلها مع المتوسطة القائمة من قبل pipetting. نقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق على RT.
- إزالة طاف وإضافة 1 مل المتوسطة KBM502 الطازجة. عد الخلايا وصفيحة 1.5 × 10 6 خلايا (في 2 مل المتوسطة KBM502 الطازج) في كل بئر لمكافحة CD3 المغلفة الأجسام المضادة لوحة 6 جيدا.
- ذوبان الجليد الحلول SEV من OCT3 / 4-SEV / TSΔF، SOX2-SEV / TSΔF، KLF4-SEV / TSΔF، وج-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF على الجليد.
- إضافة حلول SEV تحتوي على OCT3 / 4-SEV / TSΔF، SOX2-SEV / TSΔF، KLF4-SEV / TSΔF، وج-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF بشكل فردي إلى الآبار، كل في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 10. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ -co 2 الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى.
3. إزالة المتجهات SEV من T الإنسان خلايا
- 24 ساعة بعد الإصابة، وجمع الخلايا المصابة مع ماصة. إذا كان هناك خلايا الالتزام، فإنها يمكن بسهولة فصل pipetting للهم مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا. نقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق على RT.
- إزالة طاف التي تحتوي على ناقلات SEV، وإضافة 2 مل المتوسطة KBM502 الطازجة. خلايا Replate في مجموعة شرق افريقياح من الآبار. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ -co 2 حاضنة ل24 ساعة إضافية.
4. خلايا RESEED على طبقة Matrigel
- إعداد الغشاء القاعدي حل المصفوفة هلام ذوبان مصفوفة (يرجى الاطلاع على قائمة المواد للعلامة التجارية المحددة المستخدمة في هذه الدراسة) في 4 درجات مئوية وإذابة 0.2 مل في 10 مل من DMEM / F12 المتوسط.
ملاحظة: هلام مصفوفة (يرجى الاطلاع على قائمة المواد للعلامة التجارية المحددة المستخدمة في هذه الدراسة) يحتاج إلى ذوبان الجليد O / N عند 4 درجات مئوية إلى أن إذابة تماما. يبقيه على الجليد حتى قبل الاستخدام. - لوحة 5 مل من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي لكل طبق في أطباق 100 ملم وترك في RT لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل البذر الخلايا. وهناك حاجة إلى ما لا يقل عن اثنين من الأطباق 100 ملم لتجربة واحدة.
- جمع الخلايا SEV المصابة من قبل pipetting، نقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق على RT.
- إزالة طاف وإضافة 1 مل المتوسطة KBM502 الطازجة. حساب عدد مLLS باستخدام عدادة الكريات، وإزالة الحل الطابق السفلي مصفوفة غشاء من الأطباق 100 ملم أعدت في الخطوة 4.2 ولوحة 1 × 10 5 و 1 × 10 6 خلايا (في 10 مل المتوسطة mTeSR الطازج) على 100 ملم الغشاء القاعدي مصفوفة المغلفة أطباق. وأخيرا، استخدام لوحة في التي التقطت المستعمرات بسهولة.
- احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية في 5٪ -co 2 حاضنة O / N.
- تغيير المتوسط إلى 10 مل لحم mTeSR المتوسط كل يوم.
ملاحظة: حوالي 20-30 يوما بعد العدوى، والمستعمرات التي تشبه الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) سوف تظهر.
5. توسيع T-المستمدة خلية iPSCs
- إعداد الغشاء القاعدي حل المصفوفة هلام ذوبان مصفوفة (يرجى الاطلاع على قائمة المواد للعلامة التجارية المحددة المستخدمة في هذه الدراسة) في 4 درجات مئوية وإذابة 0.2 مل في 10 مل من DMEM / F12 المتوسط.
- لوحة 1 مل من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر في لوحة 6 جيدا ويترك على RT لفيأقل 30 دقيقة قبل اختيار المستعمرات.
- ملء لوحة 96-جيدا مع 20 ميكرولتر من mTeSR المتوسطة لكل بئر.
- حدد المستعمرات التي تشبه المجالس الاقتصادية والاجتماعية تحت stereomicroscope باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.
ملاحظة: مستعمرات المجالس الاقتصادية والاجتماعية وiPSCs هي المستديرة والمسطحة كما هو مبين في الشكل 1B. - نقل المستعمرات المحددة في لوحة 96-جيدا مليئة mTeSR المتوسطة في الخطوة 5.3.
- إضافة 200 ميكرولتر من mTeSR المتوسطة إلى كل بئر وبعناية ماصة صعودا وهبوطا لكسر مستعمرة إلى كتل صغيرة تحت stereomicroscope باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. إزالة حل مصفوفة الغشاء القاعدي من إعدادا جيدا في 5.2 ووضع كل مستعمرة في بئر واحدة من الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة 6 جيدا مع 2 مل من mTeSR المتوسطة لكل بئر.
- تغيير المتوسطة إلى 2 مل لحم mTeSR المتوسط كل يوم.
6. الحفاظ على T-المستمدة خلية iPSCs
يمكن الحفاظ على iPSCs المشتقة من الخلايا Tوتخزينها باستخدام نفس الأساليب المتبعة في iPSCs الإنسان والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان. مرة واحدة المستعمرات التوجيهية يكبر، توسيعها في أطباق أكبر بتكرار نفس الإجراء.
- تغيير المتوسطة mTeSR كل 1-2 أيام.
- عندما تصبح المستعمرات متموجة كل 5-7 أيام، مرور الخلايا باستخدام حل التفكك لiPSCs الإنسان والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمستخدمين لتوليد iPSCs من خلايا T الطرفية الإنسان ثابت. أظهر الجيل التوجيهية من خلايا T مع SEV وmatrigel ما يقرب من 0.002٪ - 0.005٪ من كفاءة إعادة برمجة الخلايا في بين عدة حالات المانحة وSEV لم تكتشف بعد العديد من المقاطع 16 ويبين الشكل 1A التخطيطي لبروتوكول لتوليد الخلايا التائية المشتقة iPSCs في ظروف خالية من وحدة التغذية باستخدام matrigel وmTeSR المتوسطة. بعد حوالي 20-30 أيام من العدوى مع SEV، يتم التعرف على المستعمرات التوجيهية بحكم ESC تشبه مستعمرة التشكل (الشكل 1B). وكشف المناعي تلطيخ التعبير عن علامات الخلايا المحفزة نموذجية (NANOG، OCT3 / 4، SSEA4، TRA-1-60، وTRA-1-81) في T iPSCs المشتقة من خلية ولدت في ظل ظروف خالية من وحدة التغذية (الشكل 1C).
"العرض =" 700 "/>
الشكل 1. (A): A التخطيطي للبروتوكول للخلايا T برمجة ظل ظروف خالية من وحدة التغذية في هذه الدراسة. (B): A ESC تشبه مستعمرة التوجيهية النموذجية في يوم 27 بعد اخذ عينات من الدم تحت ظروف خالية من وحدة التغذية. (C): تلطيخ ALP وتلطيخ المناعي لتعدد القدرات والسطح علامات (NANOG، OCT3 / 4، SSEA4، TRA-1-60، وTRA-1-81) في T iPSCs المشتقة من خلية ولدت في ظل ظروف خالية من وحدة التغذية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم المتنافسة أو المصالح الكشف عن متضاربة.
Acknowledgments
نشكر يوشيكو مياكي، ساياكا Kanaami، شيهانا فوجيتا، ميهو ياماغوتشي، ناتسوكو Henmi، وري اونو من كلية الطب بجامعة كيو للحصول على المساعدة الفنية. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال برنامج R & D أنظمة الدعم لتسريع استخدام العملي لنتائج البحوث الصحية، وبرنامج الطريق السريع للتحقيق للطب التجديدي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
