Abstract
Nylig iPSCs har tiltrukket seg oppmerksomhet som en ny kilde til celler for regenerativ behandling. Selv om den første metoden for å generere iPSCs stolt på dermale fibroblaster innhentet av invasiv biopsi og retroviral genomisk innsetting av transgener, har det vært mange forsøk på å unngå disse ulempene. Humane perifere T-celler er en unik cellekilde for å generere iPSCs. iPSCs avledet fra T-celler inneholder rearrangementer av T-cellereseptoren (TCR) gener og er en kilde for antigen-spesifikke T-celler. I tillegg, har T-celle-reseptor-omleiring i genomet potensiale til å merke de enkelte cellelinjer og skille mellom transplanterte og donorceller. For sikker klinisk anvendelse av iPSCs, er det viktig å minimalisere risikoen for å utsette nylig genererte iPSCs for skadelige stoffer. Selv om føtalt bovint serum og mateceller har vært avgjørende for pluripotent stamcelle kultur, er det foretrukket å fjerne dem fra kultursystem for å redusere risikoenuforutsigbar patogenitet. For å løse dette, har vi etablert en protokoll for å generere iPSCs fra humane perifere T-celler ved hjelp av Sendai virus for å redusere risikoen for å utsette iPSCs til udefinerte patogener. Selv om håndtering Sendai virus krever utstyr med riktig biosikkerhetsnivå, Sendai virus infiserer aktiverte T-celler uten genom innsetting, men med høy effektivitet. I denne protokollen demonstrerer vi generering av iPSCs fra humane perifere T-celler i matefrie betingelser ved hjelp av en kombinasjon av aktiverte T-cellekultur og Sendai-virus.
Introduction
iPSCs har vakt betydelig oppmerksomhet som en banebrytende kilde til celler for regenerativ medisin 1-3. Hittil har ulike metoder for å generere iPSCs blitt rapportert 4,5. Blant disse, iPSCs generert fra humane T-celler har vært av spesiell interesse på grunn av de mindre-invasiv metode for celleprøver 6-8. I tillegg iPSCs avledet fra T-celler inneholder rearrangementer av T-cellereseptoren (TCR) genet, og er således en kilde for antigen-spesifikke T-celler 9,10. Derfor generere T-celle avledet iPSCs trygt er nyttig for framdrift regenerativ medisin.
Denne metoden er basert på konseptet av å redusere risikoen for uforutsigbar patogenitet. For sikker klinisk anvendelse av iPSCs er det viktig for å redusere risikoen for eksponering for patogener 11. Tidligere i mange kultursystemer av pluripotente stamceller, har føtalt bovint serum og mateceller vært brukt som vesentlig reagenss 12. Imidlertid er fjernelse av begge disse reagenser fra dyrkningssystem som foretrekkes for IPSC generering for å redusere risikoen for uforutsigbar patogenitet.
I tillegg har denne fremgangsmåte den fordel at man unngår invasiv celleprøver fra pasienter og arbeidskrevende fremstilling av feeder-celler. Fordi T-celle-avledet iPSCs allerede har vært brukt med hell i sykdoms forskning 13,14, er denne metoden også anvendelig og nyttig for å generere sykdomsspesifikke iPSCs fra pasienter.
Blant T-celle reprogrammerings-metoder, ved hjelp av Sendai-virus (SeV) vektor som et gen kjøretøy er en metode som kan generere iPSCs med høy virkningsgrad 7,16. I tillegg, fordi SeV er et enkelt-trådet RNA-virus, og ikke trenger en DNA-fase for replikasjon, dens anvendelse i IPSC generasjon unngår å bryte vertsgenomet 17-19. Derfor har vi etablert protokoller for å generere iPSCs fra humane perifere T-celler i serum-free og mater frie forhold ved hjelp av en kombinasjon av matrigel, mTeSR medium, og Sev vektorer.
Protocol
1. Forbered Aktivert humane T-celler
- Samle 10 ml hepariniserte helblod fra en giver ved venepunksjon.
- Innhente informert samtykke fra donorer i forkant av venepunksjon. Venepunksjon skal utføres av kvalifisert og opplært personell.
- Håndtak innhentet blodprøver med sterilt utstyr og følgende hensiktsmessige retningslinjer biosikkerhet.
- Fortynn 10 ml hepariniserte helblod med 10 ml D-PBS (-).
- Satt 15 ml Ficoll-løsning (Ficoll-Paque PREMIUM) inn i en ny 50-ml konisk rør.
- Lag av 20 ml blod-oppløsning fremstilt i trinn 1.2 på Ficoll løsningen i trinn 1,3. Ved hjelp av en elektrisk pipette, enn blod oppløsning fremstilt i trinn 1.2 løpe langsomt langs innerveggen av røret. Vær forsiktig med å blande blodet løsning og Ficoll løsning.
- Sentrifuger ved 400 x g i 30 min ved RT. Sett sentrifugal retardasjon hastighet til "treg".
Merk: Etter sentrifugering, en hvit tynnsjikt fremkommer mellom en øvre melaktig plasmalaget og et nedre klar Ficoll lag. Denne hvite tynne laget inneholder mononukleære celler. - Overfør det mononukleære cellelaget til en ny 50-ml konisk rør med en 1 ml-pipette. Vær forsiktig med å inkludere Ficoll løsning.
- Legg D-PBS (-) til de mononukleære celler til et totalt volum på 10 ml, og sentrifuger ved 200 x g i 5 min ved RT.
- Kast supernatanten. Tilsett 10 ml D-PBS (-) til de mononukleære celler og sentrifuger ved 200 x g i 5 min ved RT.
- Kast supernatanten, tilsett 1 ml KBM502 medium til de innsamlede mononukleære celler, og telle cellene ved hjelp av en hemocytometer. Over 5 x 10 6 mononukleære celler kan fås fra 10 ml heparinisert fullblod med passende separasjon ved hjelp av Ficoll.
- Fremstille en anti-humant CD3-antistoff-oppløsning ved en konsentrasjon på 10 ug / ml i D-PBS (-). Tilsett anti-human CD3-antistoff-løsning til en 6-brønns plate, suge bølgeneess fra hver brønn og inkuber fatet ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i minst 30 min.
- Fjern anti-human CD3-antistoff-løsning fra hver brønn og vask en gang med D-PBS (-) like før utsåing av cellene.
- Seed mononukleære celler som ble fremstilt i trinn 1,9 i en tetthet på 2,5 x 10 5 celler / cm2 på de anti-human CD3-antistoff-belagte 6-brønns plater i KBM502 medium. Inkuber ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator i 3-7 dager uten forandring medium til T-cellene når konfluens. T-celler i denne perioden er begge suspendert og man følger celler.
2. infisere humane T-celler med SEV vektorer
- Etter 3-7 dager kultur, samle de aktiverte T-celler med eksisterende medium ved pipettering. Overføre dem til et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 200 x g i 5 min ved RT.
- Fjern supernatanten og tilsett 1 ml frisk KBM502 medium. Telle celler og plate 1.5 x 10 6-celler (i 2 ml frisk KBM502 mellom) inn i hver brønn av en anti-CD3-antistoff-belagte 6-brønns plate.
- Tine SEV løsninger av OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF, og c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF på is.
- Legg SEV løsninger innehold OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF, og c-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF individuelt til brønnene, som hver ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) 10. Inkuber ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator i ytterligere 24 timer.
3. Fjern Sev vektorer fra humane T-celler
- 24 timer etter infeksjon, samle de infiserte celler med en pipette. Hvis det er man følger celler, kan de lett løsnes pipettering dem gjentatte ganger opp og ned. Overføre dem til et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 200 x g i 5 min ved RT.
- Fjern supernatanten inneholder Sev vektorer, og tilsett 2 ml frisk KBM502 medium. Replate celler i each av brønnene. Inkuber ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator i ytterligere 24 timer.
4. reseed Cells om en Matrigel Layer
- Forbered basalmembran matrix løsning ved tining matrise gel (se materialliste for bestemt merke brukt i denne studien) ved 4 ° C og oppløsning 0,2 ml i 10 ml DMEM / F12 medium.
Merk: Matrix gel (se materialliste for bestemt merke brukt i denne studien) må tine O / N ved 4 ° C for å være helt tint. Hold det på is inntil like før bruk. - Plate 5 ml basalmembran matriseoppløsning pr fatet i 100-mm skåler og gitt ved romtemperatur i minst 30 min før såing av cellene. I det minste to 100-mm skåler er nødvendig for en eksperiment.
- Samle Sev-infiserte celler ved pipettering, overføre dem til et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 200 x g i 5 min ved RT.
- Fjern supernatanten og tilsett 1 ml frisk KBM502 medium. Tell antall cells bruke en hemocytometer, fjern basalmembran matrix løsning fra 100 mm-retter tilberedt i trinn 4,2 og plate 1 x 10 5 og 1 x 10 6 celler (i 10 ml frisk mTeSR middels) på en 100-mm basalmembran matrix-belagt retter. Til slutt bruker platen der kolonier lett plukket.
- Inkuber fatet ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator O / N.
- Endre medium til 10 ml kjøtt mTeSR medium annenhver dag.
Merk: Omtrent 20-30 dager etter smitte, kolonier som tett ligner embryonale stamceller (ESCs) vil vises.
5. Utvid T Cell-avledet iPSCs
- Forbered basalmembran matrix løsning ved tining matrise gel (se materialliste for bestemt merke brukt i denne studien) ved 4 ° C og oppløsning 0,2 ml i 10 ml DMEM / F12 medium.
- Plate 1 ml av basalmembranen matriseoppløsning per brønn i en 6-brønns plate og la ved RT iminst 30 min før plukke kolonier.
- Fyll en 96-brønners plate med 20 pl mTeSR medium per brønn.
- Velg kolonier som ligner ESCs under stereomikroskop ved hjelp av en 20 mL pipette.
Merk: kolonier av ESCs og iPSCs er runde og flate som vist i figur 1B. - Overføre utvalgte kolonier inn i 96-brønns plate fylt med mTeSR medium i trinn 5.3.
- Tilsett 200 ul av mTeSR medium til hver brønn og nøye pipettere opp og ned for å bryte opp i små klumper kolonien under stereomikroskop ved hjelp av en 200 ul pipette. Fjern basalmembranen matriseoppløsningen fra brønnen forberedt på 5,2 og satt inn i hver koloni en brønn av basalmembran-matriks belagt 6-brønns plate med 2 ml mTeSR medium per brønn.
- Endre medium til 2 ml kjøtt mTeSR medium annenhver dag.
6. Opprettholde T Cell-avledet iPSCs
De T-celle-avledede iPSCs kan opprettholdesog lagres ved hjelp av de samme teknikkene som for menneske iPSCs og menneskelige ESCs. Når IPSC kolonier vokser opp, utvide dem til større retter ved å gjenta samme prosedyre.
- Endre mTeSR medium hver 1-2 dager.
- Når koloniene blir sammenflytende hver 5-7 dager, passasje cellene ved hjelp av dissosiasjon løsning for menneske iPSCs og menneskelige ESCs i henhold til produsentens instruksjoner.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen, brukerne er i stand til å generere iPSCs fra humane perifere T-celler som stabilt. IPSC generasjon fra T-celler med SeV og matrigel viste omtrent 0,002% -. 0,005% av effektiviteten av celle omprogrammering mellom flere donor tilfeller og SeV ble ikke detektert etter flere passasjer 16 Figur 1A viser et skjematisk av protokollen for å generere T-celle-avledet iPSCs i mater frie forhold ved hjelp matrigel og mTeSR medium. Rundt 20-30 dager etter infeksjon med SeV er IPSC kolonier gjenkjent av sin ESC koloni-lignende morfologi (Figur 1B). Immunfluorescens farging avslørte uttrykk for typiske pluripotente cellemarkører (Nanog, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, og TRA-1-81) i T-celle-stammer iPSCs generert etter mater-frie forhold (figur 1C).
"Width =" 700 "/>
Figur 1. (A): En skjematisk av protokollen for reprogrammerings-T-celler i henhold til matefrie betingelser i denne studien. (B): En typisk ESC-lignende IPSC koloni på dag 27 etter blodprøvetaking etter mater frie forhold. (C): ALP farging og immunfluorescens farging for pluripotency og overflatemarkører (Nanog, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, og TRA-1-81) i T-celle-stammer iPSCs oppnådd under matefrie betingelser. Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende eller motstridende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, og Rei Ohno fra Keio University School of Medicine for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble delvis finansiert av en R & D Systems støtteprogram for å akselerere den praktiske bruken av helseforskningsresultater, og Highway Program for realisering av Regenerative Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
