Abstract
Nyligen iPSCs har uppmärksammats som en ny källa till celler för regenerativa terapier. Även om den initiala metoden för att generera iPSCs förlitat sig på hudfibroblaster erhållits genom invasiv biopsi och retroviral genomisk insättning av transgener, har det funnits många ansträngningar för att undvika dessa nackdelar. Humana perifera T-celler är en unik cellkälla för alstring iPSCs. iPSCs härledda från T-celler innehåller omlagringar av T-cellreceptorn (TCR) -gener och är en källa av antigenspecifika T-celler. Dessutom, T-cellsreceptor ombildning i genomet har potential att märka enskilda cellinjer och skilja mellan transplanterade och givarceller. För säker klinisk tillämpning av iPSCs, är det viktigt att minimera risken för exponering av nyligen genererade iPSCs för skadliga ämnen. Även fetalt bovint serum och matarceller har varit väsentligt för pluripotenta stamcellkultur, är det föredraget att avlägsna dem från odlingssystemet för att minska riskenoförutsägbara patogenicitet. För att lösa detta har vi etablerat ett protokoll för att generera iPSCs från humana perifera T-celler med hjälp av Sendai-virus för att minska risken att utsätta iPSCs till odefinierade patogener. Även hantering Sendai-virus kräver utrustning med lämplig skyddsnivå, Sendai virus infekterar aktiverade T-celler utan genomet inser, men med hög effektivitet. I detta protokoll visar vi alstringen av iPSCs från humana perifera T-celler i matarfria betingelser med användning av en kombination av aktiverade T-cellkultur och Sendai-virus.
Introduction
iPSCs har rönt stor uppmärksamhet som en banbrytande källa av celler för regenerativ medicin 1-3. Hittills har olika metoder för att generera iPSCs rapporterats 4,5. Bland dessa, har iPSCs alstras från humana T-celler varit av särskilt intresse på grund av den mindre invasiv metod för cellprovtagnings 6-8. Dessutom iPSCs härlett från T-celler innehåller omlagringar av T-cellreceptorn (TCR) -genen och är sålunda en källa för antigenspecifika T-celler 9,10. Därför genererar T-cells härrör iPSCs är säkert användbar för att utvecklas regenerativ medicin.
Denna metod är baserad på konceptet att minska risken för oförutsägbara patogenicitet. För säker klinisk tillämpning av iPSCs är det viktigt att minska risken för exponering för patogener 11. Tidigare i många odlingssystem av pluripotenta stamceller, har fetalt bovint serum och matarceller använts som väsentliga reagenss 12. Dock är avlägsnandet av båda dessa reagenser från odlingssystemet föredra för iPSC generationen för att minska risken för oförutsägbara patogenicitet.
Dessutom har denna metod fördelen att undvika invasiv cell provtagning från patienter och mödosam framställning av matarceller. Eftersom T-cell härledda iPSCs har redan använts med framgång i sjukdomsforskning 13,14, är metoden också tillämplig och användbar för att generera sjukdomsspecifika iPSCs från patienter.
Bland T-cell omprogrammering metoder, med hjälp av Sendai-virus (SeV) vektorn som en gen fordon är en metod som kan generera iPSCs med hög effektivitet 7,16. Dessutom, eftersom SeV är ett enkelsträngat RNA-virus och inte behöver en DNA fas för replikation, dess användning i iPSC generationen undviker bryta värdgenomet 17-19. Därför har vi etablerat protokoll för alstring iPSCs från humana perifera T-celler i serum FREE och matarfria förhållanden med hjälp av en kombination av matrigel, mTeSR medium och SEV vektorer.
Protocol
1. Förbered Aktiverade humana T-celler
- Samla 10 ml hepariniserade helblod från en givare genom venpunktion.
- Erhålla informerat samtycke av donatorer före venpunktion. Venpunktion måste göras av kvalificerad och utbildad personal.
- Handtag erhållna blodprov med steril utrustning och efter lämpliga riktlinjer biosäkerhet.
- Späd 10 ml hepariniserade helblod med 10 ml D-PBS (-).
- Sätt 15 ml Ficoll-lösning (Ficoll-Paque PREMIUM) i en ny 50-ml koniskt rör.
- Varva 20 ml blod lösning som framställts i steg 1.2 på Ficoll lösningen i steg 1.3. Med användning av en elektrisk pipett, låt blodlösning framställd i steg 1,2 kör långsamt längs innerväggen hos röret. Var noga med att inte blanda blodlösningen och Ficoll lösning.
- Centrifugera vid 400 x g under 30 min vid RT. Ställ in centrifugal retardation hastigheten till "långsam".
Obs: Efter centrifugering, en vit tunnskikt framträder mellan en övre mjölkplasmaskiktet och en undre tydlig Ficoll skikt. Denna vita tunt skikt innehåller mononukleära celler. - Överför det mononukleära cellskiktet till en ny 50 ml koniska rör med en 1-ml pipett. Var noga med att inte inkluderar Ficoll lösningen.
- Lägg D-PBS (-) till de mononukleära cellerna till en total volym av 10 ml, och centrifugera vid 200 x g under 5 min vid RT.
- Kasta bort supernatanten. Tillsätt 10 ml D-PBS (-) till de mononukleära cellerna, och centrifugera vid 200 x g under 5 min vid RT.
- Kasta bort supernatanten, tillsätt 1 ml KBM502 medium till de uppsamlade mononukleära celler, och räkna cellerna med en hemocytometer. Över 5 × 10 6 mononukleära celler kan erhållas från 10 ml hepariniserade helblod med lämplig separation med användning av Ficoll.
- Bered en anti-human CD3-antikropp-lösning vid en koncentration av 10 ug / ml i D-PBS (-). Tillsätt lösningen antihuman CD3-antikropp till en 6-brunnsplatta, blöt vågornaess för varje brunn och inkubera skålen vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator under minst 30 minuter.
- Avlägsna CD3 antikroppslösningen anti-human från varje brunn och tvätta en gång med D-PBS (-) precis före ympning av cellerna.
- Seed mononukleära celler som framställdes i steg 1,9 vid en densitet av 2,5 x 10 5 celler / cm 2 på de anti-human-CD3-antikropp-belagda 6-brunnsplattor i KBM502 medium. Inkubera vid 37 ° C i en 5% -CO 2 inkubator under 3-7 dagar utan byte av medium tills T-cellema når konfluens. T-celler under denna period är både suspenderade och vidhäftande cellerna.
2. Infect humana T-celler med SEV vektorer
- Efter 3-7 dagars odling, samla de aktiverade T-celler med befintliga medel genom pipettering. Överföra dem till en 15-ml koniska rör och centrifugera vid 200 x g under 5 min vid RT.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml färskt KBM502 medium. Räkna celler och plattan 1.5 × 10 6 celler (i 2 ml färsk KBM502 medium) till varje brunn i en anti-CD3-antikropp-belagda 6-brunnsplatta.
- Tina SEV lösningar OCT3 / 4-SeV / TSΔF, Sox2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF och c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF på is.
- Lägg SEV lösningar innehållande OCT3 / 4-SeV / TSΔF, Sox2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF, och c-myc (HNL) -SeV / TS15ΔF individuellt till brunnarna, var och en vid en infektionsmultiplicitet (MOI) av 10. Inkubera vid 37 ° C i en 5% -CO 2 inkubator under ytterligare 24 timmar.
3. Ta bort Sev vektorer från humana T-celler
- 24 timmar efter infektion, samla de infekterade cellerna med en pipett. Om det finns vidhäftande cellerna, kan de lätt tas loss pipettera dem upprepade gånger upp och ner. Överföra dem till en 15-ml koniska rör och centrifugera vid 200 x g under 5 min vid RT.
- Avlägsna supernatanten innehållande SEV vektorerna, och tillsätt 2 ml färskt KBM502 medium. Förnyad utbredning celler i each av brunnarna. Inkubera vid 37 ° C i en 5% -CO 2 inkubator under ytterligare 24 timmar.
4. reseed celler på en Matrigel Layer
- Förbered basalmembranmatris lösning genom upptining matrisgel (se materiallista för visst märke som används i denna studie) vid 4 ° C och upplösning 0,2 ml i 10 ml DMEM / F12-medium.
Obs: matrisgel (vänligen se Materiallista för den specifika varumärke som används i denna studie) behöver tina O / N vid 4 ° C för att vara helt upptinad. Håll det på is tills strax före användning. - Plansch 5 ml basalmembranmatrislösningen per skål i 100 mm skålar och låt stå i rumstemperatur under minst 30 min före sådd celler. Minst två 100-mm skålar behövs för ett experiment.
- Samla SeV-infekterade celler genom pipettering, överföra dem till en 15-ml koniska rör och centrifugera vid 200 x g under 5 minuter vid RT.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml färskt KBM502 medium. Räkna antalet cells med hjälp av en hemocytometer, ta bort basalmembranet matrislösningen från 100-mm rätter som tillagas i steg 4.2 och plattan 1 x 10 5 och 1 × 10 6 celler (i 10 ml färsk mTeSR medel) på en 100-mm basalmembranmatris belagd disk. Slutligen använder plattan där kolonier lätt plockas.
- Inkubera skålen vid 37 ° C i en 5% -CO 2 inkubator O / N.
- Ändra på medellång till 10 ml kött mTeSR-medium varannan dag.
Obs: Cirka 20-30 dagar efter infektion, kolonier som nära liknar embryonala stamceller (ESC) visas.
5. Expandera T Cell härledda iPSCs
- Förbered basalmembranmatris lösning genom upptining matrisgel (se materiallista för visst märke som används i denna studie) vid 4 ° C och upplösning 0,2 ml i 10 ml DMEM / F12-medium.
- Plansch 1 ml av basalmembranmatrislösningen per brunn i en 6-brunnsplatta och lämna vid RT i vidminst 30 minuter innan plocka kolonier.
- Fyll en 96-brunnsplatta med 20 | il mTeSR-medium per brunn.
- Välj kolonier som liknar ekonomiska och sociala råd i stereomikroskop med hjälp av en 20 l pipett.
Obs: Kolonierna av ekonomiska och sociala råden och iPSCs är runda och platta, såsom visas i figur 1B. - Överför utvalda kolonier i 96-brunnar fyllda med mTeSR medium i steg 5.3.
- Tillsätt 200 pl av mTeSR medium till varje brunn och försiktigt pipettera upp och ner för att bryta kolonin i små klumpar under stereomikroskop under användning av en 200 | j, l pipett. Avlägsna basalmembranet matrislösningen från väl förberedda i 5,2 och sätta varje koloni i en brunn av basalmembranmatrisen belagda 6-brunnsplatta med 2 ml mTeSR-medium per brunn.
- Ändra på medellång till 2 ml kött mTeSR-medium varannan dag.
6. upprätthålla T-härledda iPSCs
Cellhärledda iPSCs T kan bibehållasoch lagras med samma teknik som för mänskliga iPSCs och mänskliga ekonomiska och sociala råd. När IPSC kolonier växa upp, expandera dem till större rätter genom att upprepa samma procedur.
- Ändra mTeSR medium var 1-2 dagar.
- När kolonierna blir sammanflytande var 5-7 dagar, passage cellerna med hjälp dissociationslösning för mänskliga iPSCs och mänskliga ekonomiska och sociala råd i enlighet med tillverkarens instruktioner.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll, användare har möjlighet att generera iPSCs från humana perifera T-celler stabilt. iPSC generation från T-celler med SeV och matrigel visade ungefär 0,002% -. 0,005% effektivitet av cell omprogrammering i mellan flera givar fall och SeV upptäcktes inte efter flera passager 16 Figur 1A visar en schematisk bild av protokollet för att generera T-cellerna iPSCs i matarfria betingelser med användning matrigel och mTeSR medium. Omkring 20-30 dagar efter infektion med SeV är IPSC kolonier identifieras genom ESC koloni-liknande morfologi (Figur 1B). Immunofluorescensfärgning avslöjade expression av typiska pluripotenta cellmarkörer (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, och TRA-1-81) i T-cell-härledda iPSCs genereras enligt feeder fria förhållanden (Figur 1C).
"Width =" 700 "/>
Figur 1. (A): En schematisk av protokollet för omprogrammering T-celler enligt feeder fria betingelser i denna studie. (B): En typisk ESC-liknande iPSC koloni på dag 27 efter provtagningen blod under feeder-fria betingelser. (C): ALP färgning och immunofluorescensfärgning för pluripotens och ytmarkörer (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, och TRA-1-81) i T-cell-härledda iPSCs genereras enligt feeder fria förhållanden. Vänligen Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande eller motstridiga intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi och Rei Ohno från Keio University School of Medicine för tekniskt stöd. Detta arbete har delvis finansierats av en R & D Systems stödprogram för att påskynda den praktiska användningen av hälsoforskningsresultaten, och Highway Program för förverkligandet av regenerativ medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
