Abstract
For nylig har tiltrukket sig opmærksomhed iPSCs som en ny kilde af celler til regenerative terapier. Selv om den oprindelige fremgangsmåde til generering iPSCs påberåbte dermale fibroblaster opnået ved invasiv biopsi og retroviral genomisk indsættelse af transgener, har der været mange forsøg på at undgå disse ulemper. Humane perifere T-celler er en unik cellekilde til generering iPSCs. iPSCs afledt af T-celler indeholder omlejringer af T-cellereceptoren (TCR) gener og er en kilde til antigen-specifikke T-celler. Derudover T-cellereceptor omlejring i genomet har potentiale til at mærke individuelle cellelinier og skelne mellem transplanterede og donorceller. For sikker klinisk anvendelse af iPSCs, er det vigtigt at minimere risikoen for at udsætte nyligt genererede iPSCs for skadelige stoffer. Selv kalvefosterserum og fødeceller har været af afgørende betydning for pluripotente stamcelle kultur, foretrækkes det at fjerne dem fra dyrkningssystemet at mindske risikoenaf uforudsigelige patogenicitet. For at løse dette, har vi etableret en protokol til generering iPSCs fra humane perifere T-celler under anvendelse af Sendai-virus for at reducere risikoen for at udsætte iPSCs udefinerede patogener. Selvom håndtering Sendai-virus kræver udstyr med passende level-Sendai virus inficerer aktiverede T-celler uden indføring genom, men med høj effektivitet. I denne protokol, viser vi dannelsen af iPSCs fra humane perifere T-celler i fødefri betingelser under anvendelse af en kombination af aktiveret T-celle-kultur og Sendai-virus.
Introduction
iPSCs har tiltrukket stor opmærksomhed som en banebrydende kilde til celler til regenerativ medicin 1-3. Til dato er der rapporteret diverse metoder til at generere iPSCs 4,5. Blandt disse har iPSCs genereret fra humane T-celler været af særlig interesse på grund af de mindre invasiv metode til celleprøveudtagningsproceduren 6-8. Derudover iPSCs afledt af T-celler indeholder omlejringer af T-cellereceptoren (TCR) genet og er således en kilde til antigen-specifikke T-celler 9,10. Derfor generere T-celle afledt iPSCs sikkert er nyttig til forløber regenerativ medicin.
Denne metode er baseret på princippet om at reducere risikoen for uforudsigelige patogenicitet. For sikker klinisk anvendelse af iPSCs er det vigtigt at reducere risikoen for eksponering for patogener 11. Tidligere i mange dyrkningssystemer af pluripotente stamceller, har kalvefosterserum og fødeceller blevet anvendt som væsentlige reagenss 12. Dog er udtagelse af begge disse reagenser fra dyrkningssystemet er at foretrække for iPSC generation til at reducere risikoen for uforudsigelige patogenicitet.
Desuden er denne fremgangsmåde har den fordel, at man undgår invasive celleprøveudtagningsproceduren fra patienter og besværlig fremstilling af fødeceller. Fordi T-celle-afledte iPSCs allerede er blevet anvendt med succes i sygdom forskning 13,14, er denne fremgangsmåde også anvendelig og nyttig til frembringelse af sygdomsspecifikke iPSCs fra patienter.
Blandt T-celle-omprogrammering metoder, ved hjælp af Sendai-virus (SeV) vektor som et gen køretøj er en metode, der kan generere iPSCs med høj effektivitet 7,16. Desuden, fordi SeV er en enkeltstrenget RNA-virus og behøver ikke en DNA fase for replikation, dets anvendelse i iPSC generation undgår at bryde værtsgenomet 17-19. Derfor har vi etableret protokoller til generering iPSCs fra humane perifere T-celler i serum-frEE og fødefri betingelser ved anvendelse af en kombination af matrigel, mTeSR medium og SeV-vektorer.
Protocol
1. Klargør Aktiverede humane T-celler
- Saml 10 ml hepariniserede fuldblod fra en donor ved venepunktur.
- Indhente informeret samtykke fra donorer forud for venepunktur. Venepunktur skal udføres af kvalificeret og uddannet personale.
- Håndtag opnået blodprøver med sterilt udstyr og følgende relevante retningslinjer biosikkerhed.
- Fortynd 10 ml hepariniserede helblod med 10 ml D-PBS (-).
- Sæt 15 ml Ficoll-opløsning (Ficoll-Paque Premium) i en ny 50 ml konisk rør.
- Lag 20-ml blod opløsning fremstillet i trin 1.2 på Ficoll opløsning i trin 1.3. Anvendelse af en elektrisk pipette, lad blod opløsning fremstillet i trin 1.2 løb langsomt langs med indersiden af røret. Pas på ikke at blande blodopløsningen og Ficoll løsning.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 30 minutter ved stuetemperatur. Sæt centrifugal deceleration hastighed til "langsom".
Bemærk: Efter centrifugering en hvid tyndlag opstår mellem en øvre mælkeagtig plasma lag og et nedre klart Ficoll lag. Denne hvide tyndt lag indeholder mononukleare celler. - Overfør mononukleære cellelag i et nyt 50-ml konisk rør med en 1-ml pipette. Pas på ikke at medtage Ficoll løsning.
- Tilføj D-PBS (-) til mononukleære celler til et samlet volumen på 10 ml, og der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér supernatanten. Der tilsættes 10 ml D-PBS (-) til mononukleære celler, og der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, tilsættes 1 ml KBM502 medium til de indsamlede mononukleære celler, og tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer. Over 5 × 10 6 mononukleære celler kan fås fra 10 ml hepariniserede fuldblod med passende adskillelse hjælp Ficoll.
- Forbered et anti-humant CD3-antistof ved en koncentration på 10 ug / ml i D-PBS (-). Tilsæt anti-humant CD3-antistof-opløsning til en 6-brønds plade, sættetid brændingenes hver brønd, og inkuber fadet ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i mindst 30 minutter.
- Fjern anti-humant CD3-antistof-opløsning fra hver brønd og vask en gang med D-PBS (-) lige før podning af cellerne.
- Seed mononukleære celler, som blev fremstillet i trin 1.9 med en tæthed på 2,5 x 10 5 celler / cm2 på den anti-humant CD3-antistof-coatede plader med 6 brønde i KBM502 medium. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator i 3-7 dage uden udskiftning af mediet, indtil T-cellerne flyder sammen. T-celler i denne periode er begge suspenderede og vedhængende celler.
2. inficere humane T-celler med SeV Vektorer
- Efter 3-7 dages dyrkning, indsamle de aktiverede T-celler med eksisterende medium ved pipettering. Overføre dem til en 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml frisk KBM502 medium. Tæl cellerne og pladen 1.5 x 10 6 celler (i 2 ml frisk KBM502 medium) i hver brønd på et anti-CD3-antistof-coatede plade med 6 brønde.
- Optø SEV løsninger OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF, og c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF på is.
- Tilføj SEV opløsninger indeholdende OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF og c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF individuelt til brøndene, hver ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator i yderligere 24 timer.
3. Fjern SeV Vektorer fra humane T-celler
- 24 timer efter infektion, indsamle de inficerede celler med en pipette. Hvis der er adhærerende celler, kan de nemt adskilles pipettering dem flere gange op og ned. Overføre dem til en 15 ml konisk rør, og der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten indeholdende SEV vektorer og tilsæt 2 ml frisk KBM502 medium. Udpladning celler i each af brøndene. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator i yderligere 24 timer.
4. reseed Celler på en Matrigel Layer
- Basalmembranmatrix opløsning ved optøning matrixgel forberede (se venligst Materialer List for specifikt mærke anvendt i denne undersøgelse) ved 4 ° C og opløse 0,2 ml i 10 ml DMEM / F12-medium.
Bemærk: Matrix gel (se venligst Materialer List for specifikt mærke anvendt i denne undersøgelse) skal tø O / N ved 4 ° C for at være helt optøet. Holde den på is indtil lige før anvendelse. - Pladen 5 ml basalmembranmatrix opløsning pr skål i 100 mm skåle og henstår ved stuetemperatur i mindst 30 minutter før såning celler. Der er behov for mindst to 100-mm-retter til et eksperiment.
- Saml SeV-inficerede celler ved pipettering, overføre dem til en 15 ml konisk rør, og der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsæt 1 ml frisk KBM502 medium. Tæl antallet af ceLLS anvendelse af et hæmocytometer, fjerne basalmembranmatrix løsning fra 100 mm skåle fremstillet i trin 4.2 og pladen 1 × 10 5 og 1 x 10 6 celler (i 10 ml frisk mTeSR medium) på en 100 mm basalmembranmatrix-overtrukne retter. Brug til sidst pladen, hvor kolonier nemt plukkes.
- Inkubér fadet ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator O / N.
- Skift mediet til 10 ml kød mTeSR medium hver anden dag.
Bemærk: Ca. 20-30 dage efter infektion, kolonier, der nøje ligner embryonale stamceller (EKSF) vises.
5. Expand T celleafledt iPSCs
- Basalmembranmatrix opløsning ved optøning matrixgel forberede (se venligst Materialer List for specifikt mærke anvendt i denne undersøgelse) ved 4 ° C og opløse 0,2 ml i 10 ml DMEM / F12-medium.
- Plade 1 ml af basalmembranmatrix opløsning per brønd i en 6-brønds plade og henstår ved stuetemperatur imindst 30 min før plukke kolonier.
- Fyld en plade med 96 brønde med 20 pi mTeSR medium per brønd.
- Vælg kolonier, der ligner økonomiske og sociale råd under stereomikroskop ved hjælp af en 20 pi pipette.
Bemærk: Kolonierne af økonomiske og sociale råd iPSCs er runde og flade som vist i figur 1B. - Overfør udvalgte kolonier i 96-brønds plade fyldt med mTeSR medium i trin 5.3.
- Tilsæt 200 pi mTeSR medium til hver brønd og omhyggeligt pipetteres op og ned for at bryde kolonien i små klumper under stereomikroskop ved anvendelse af en 200 pi pipette. Fjern basalmembranmatrix løsning fra brønden forberedt på 5,2 og sætte hver koloni i en brønd af basalmembranen matrix-coatede plade med 6 brønde med 2 ml mTeSR medium per brønd.
- Skift mediet til 2 ml kød mTeSR medium hver anden dag.
6. Oprethold T celleafledt iPSCs
T-celle-afledte iPSCs kan opretholdesog gemmes ved hjælp af de samme teknikker som for humane iPSCs og menneskelige økonomiske og sociale råd. Når IPSC kolonier vokser op, udvide dem til større retter ved at gentage den samme procedure.
- Skift mTeSR medium hver 1-2 dage.
- Når kolonierne bliver sammenflydende hver 5-7 dage, passage cellerne under anvendelse dissocieringsopløsning for humane iPSCs og menneskelige ESC i overensstemmelse med producentens anvisninger.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol, brugerne er i stand til at generere iPSCs fra humane perifere T-celler stabilt. iPSC generation fra T-celler med SeV og matrigel viste ca. 0,002% -. 0,005% af effektiviteten af celle omprogrammering i mellem flere donor sager og SeV blev ikke påvist efter flere passager 16 Figur 1A viser en skematisk af protokollen til at generere T-celle-afledt iPSCs i feeder-fri betingelser ved anvendelse matrigel og mTeSR medium. Omkring 20-30 dage efter infektion med SeV, er IPSC kolonier genkendes ved deres ESC koloni-morfologi (figur 1B). Immunfluorescensfarvning afslørede udtryk for typiske pluripotente cellemarkører (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, og TRA-1-81) i T-celle-afledte iPSCs genereret under feeder-fri betingelser (figur 1C).
"Width =" 700 "/>
Figur 1. (A): En skematisk af protokollen for omprogrammering T-celler under feeder-fri forhold i denne undersøgelse. (B): En typisk ESC-lignende iPSC koloni på dag 27 efter blodprøvetagning under fødefri betingelser. (C): ALP farvning og immunofluorescensfarvning til pluripotens og overflademarkører (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, og TRA-1-81) i T-celle-afledte iPSCs genereret under feeder-fri betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende eller modstridende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, og Rei Ohno fra Keio University School of Medicine til teknisk bistand. Dette arbejde blev delvist finansieret af en R & D Systems støtteprogram til at fremskynde den praktiske anvendelse af sundheds- forskningsresultater, og Highway Program for realiseringen af regenerativ medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
