Developmental Biology

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

Published: November 11, 2015 doi: 10.3791/53225

Yoshikazu Kishino¹, Tomohisa Seki², Shinsuke Yuasa¹, Jun Fujita¹, Keiichi Fukuda¹

¹Department of Cardiology, Keio University School of Medicine, ²Department of Emergency and Critical Care Medicine, Keio University School of Medicine

Abstract

最近では、性IPSCは、再生医療のための細胞の新しいソースとして注目を集めています。 iPS細胞を生成するための初期の方法は侵襲的生検および導入遺伝子のレトロウイルスゲノムに挿入して得られた皮膚線維芽細胞に依存していましたが、これらの欠点を回避するために多くの努力がなされてきました。ヒト末梢T細胞がiPS細胞を生成するためのユニークな細胞源です。 T細胞由来のiPS細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、抗原特異的T細胞の供給源です。さらに、ゲノム中のT細胞受容体の再配置は、個々の細胞株を標識し、移植したドナー細胞とを区別する可能性を有します。性IPSCの安全な臨床応用のためには、有害な薬剤に新たに生成されたiPS細胞を曝露する危険性を最小限にすることが重要です。ウシ胎児血清およびフィーダー細胞は、多能性幹細胞培養のために必須であったが、リスクを軽減するために、培養システムから削除することが好ましいです。予測不可能な病原性の。これに対処するために、我々は、未定義の病原体へのiPS細胞を曝露する危険性を低減するためにセンダイウイルスを用いて、ヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを確立しました。センダイウイルスを処理することは、適切なバイオセーフティーレベルと機器が必要ですが、センダイウイルスに感染はゲノム挿入せずに、まだ高効率でT細胞を活性化しました。このプロトコルでは、我々は、活性化T細胞培養およびセンダイウイルスの組み合わせを使用して無フィーダー条件でヒト末梢T細胞からのiPS細胞の生成を実証します。

Introduction

性IPSCは、再生医療^1-3のための細胞の画期的な供給源として大きな注目を集めています。現在までに、iPS細胞を生成するための多様な方法が^4,5報告されています。これらの中でも、ヒトT細胞から生成されたiPS細胞のための細胞採取^6~8の低侵襲法の特に注目されています。さらに、T細胞由来のiPS細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、したがって抗原特異的T細胞^9,10の源です。そのため、安全性T細胞由来のiPS細胞を生成する再生医療の進展のために有用です。

この方法は、予測不可能な病原性の危険性を減少させるという概念に基づいています。性IPSCの安全な臨床応用のためには、病原体¹¹への暴露の危険性を低減することが重要です。以前に多能性幹細胞の多くの培養系において、ウシ胎児血清およびフィーダー細胞を、必須の試薬として使用されています^12秒。 iPS細胞の生成は、予測不可能な病原性の危険性を低減するが、培養系からのこれらの試薬の両方を除去することが好ましいです。

さらに、この方法は、患者からの浸潤性細胞のサンプリングおよびフィーダー細胞の面倒な準備を回避するという利点を有します。 T細胞由来のiPS細胞は、既に疾患研究^13,14に首尾よく使用されているため、この方法も適用可能であり、患者の疾患特異的iPS細胞を生成するために有用です。

遺伝子車両としてセンダイウイルス（SeVの）ベクターを用いて、T細胞の再プログラミング方法の中でも、高効率^7,16でiPS細胞を生成することができる方法です。センダイウイルスは、一本鎖RNAウイルスであり、複製のためのDNAの相を必要としないため、また、iPS細胞の生成におけるその使用は、宿主ゲノム^{17-19を破壊}が回避されます。したがって、我々は血清FRにおけるヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを確立していますEEおよびマトリゲル、mTeSR媒体の組み合わせを使用して無フィーダー条件、およびセンダイウイルスベクターです。

Protocol

1.活性化されたヒトT細胞を準備します

10ミリリットルを静脈穿刺によってドナーからのヘパリン化全血を採取します。
1. 静脈穿刺の前にドナーのインフォームドコンセントを取得します。静脈穿刺は、資格や訓練を受けた者が行う必要があります。
2. 滅菌装置と、次の適切なバイオセーフティ指針に得られた血液サンプルを処理します。
10 mlのD-PBSを用いて全血10 mlのヘパリンを希釈（ - ）。
新しい50mlのコニカルチューブに15ミリリットルフィコール溶液（フィコール・パックプレミアム）を置きます。
ステップ1.3でフィコール液にステップ1.2で作製した20 mlの血液溶液をレイヤ。電動ピペットを用いて、血液溶液は、管の内壁に沿ってゆっくりとステップ1.2の実行を準備しましょう。血液溶液とフィコール溶液を混合しないように注意してください。
室温で30分間、400×gで遠心分離します。「遅い」遠心減速度を設定します。
注：遠心分離した後、白い薄いです層は、上部乳白色の血漿層と下部透明なフィコール層との間に現れます。このホワイト薄い層は、単核細胞が含まれています。
1 mlのピペットを用いて新しい50mlのコニカルチューブに、単核細胞層を転送します。フィコール液を含まないように注意してください。
10ミリリットルの合計体積に単核細胞に、そして室温で5分間、200×gで遠心分離（ - ）D-PBSを追加します。
上清を捨てます。単核細胞に、そして室温で5分間、200×gで遠心分離（ - ）のD-PBS 10ミリリットルを追加します。
、上清を捨て、収集した単核細胞にKBM502培地1mlを追加し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 ^6×10 5以上の単核細胞を、フィコールを用いて適切な分離と全血をヘパリンmlの10から得ることができます。
D-PBS中10μg/ mlの濃度の抗ヒトCD3抗体溶液を調製します（ - ）。サーフソーク、6ウェルプレートに、抗ヒトCD3抗体溶液を加えます各ウェルのエース、少なくとも30分間、5％CO _{2インキュベーター}中、37℃で皿をインキュベートします。
各ウェルからの抗ヒトCD3抗体溶液を除去し、D-PBSで1回洗浄（ - ）細胞を播種する直前に。
KBM502培地中の抗ヒトCD3抗体でコーティングした6ウェルプレートに2.5×10 ⁵細胞/ cm ²の密度で、ステップ1.9で調製した種単核細胞。 T細胞がコンフルエントに達するまで、培地交換せずに3-7日、5％-CO ₂インキュベーター内で37℃でインキュベートします。この期間中のT細胞が両方懸濁し、接着細胞です。

センダイウイルスベクターを用い2.感染ヒトT細胞

3-7日の培養後、ピペッティングすることによって、既存の媒体と活性化T細胞を収集します。室温で5分間、200×gで15 mlのコニカルチューブと遠心分離機にそれらを転送します。
上清を除去し、1mlの新鮮なKBM502媒体を追加します。細胞とプレート1をカウントします。5×10 ⁶細胞を、抗CD3抗体でコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに（2 mlの新鮮な培地でKBM502）。
氷の上に、OCT3 / 4-たSeV /TSΔF、SOX2-たSeV /TSΔF、KLF4-たSeV /TSΔF、およびc-MYC（HNL）-sev /TS15ΔFのセンダイウイルスソリューションを解凍します。
-sev /TS15ΔFは、感染の多重度（MOI）の各ウェルに個別にSOX2-たSeV /TSΔF、KLF4-たSeV /TSΔF、およびc-MYC（HNL）、OCT3 / 4のSeV /TSΔFを含むセンダイウイルスソリューションを追加します。さらに24時間、5％-CO ₂インキュベーター内で37℃で10インキュベートの。

3.ヒトT細胞からのSeVベクターを削除します

24時間感染後、ピペットを用いて感染した細胞を収集します。接着細胞が存在する場合、それらは容易に繰り返して上下にピペッティングして取り外すことができます。 15mlのコニカルチューブにそれらを移し、室温で5分間、200×gで遠心します。
センダイウイルスベクターを含む上清を除去し、2ミリリットル新鮮なKBM502媒体を追加します。 EACで細胞をReplate井戸の時間。さらに24時間、5％-CO ₂インキュベーター中、37℃でインキュベートします。

4.マトリゲル層上の細胞を再播種

4℃で（この研究で使用される特定のブランドのための材料のリストを参照）マトリックスゲルを解凍し、DMEM / F12培地10mlの0.2 mlで溶解することにより基底膜マトリックス溶液を調製します。
注：マトリックスゲルは、（本研究で用いた特定のブランドのための材料リストを参照してください）完全に解凍されるように、4℃でO / Nを解凍する必要があります。使用直前まで氷上で保管してください。
100-mmディッシュにディッシュ当たりプレート5 mlの基底膜マトリックス溶液と、細胞を播種する前に、少なくとも30分間室温で残します。少なくとも二つの100mm皿を一つの実験に必要とされます。
ピペッティングによりセンダイウイルス感染細胞を回収し、15mlのコニカルチューブに転送し、室温で5分間、200×gで遠心します。
上清を除去し、1mlの新鮮なKBM502媒体を追加します。 CEの数を数えます血球計数器を使用してLLSは、100 mmの基底膜マトリックス被覆に100 mmのステップ4.2で作製した料理やプレート1×10 ^{5〜1×10 6}細胞（10ml中の新鮮なmTeSR媒体）から基底膜マトリックス溶液を除去料理。最後に、コロニーは簡単にピックアップされたプレートを使用しています。
5％-CO ₂インキュベーターO / Nで37℃で皿をインキュベートします。
一日おきにmTeSR媒体を肉mlの10に培地を変更します。
注：約20〜30日、感染後、密接に胚性幹細胞（ESC）の似ているコロニーが表示されます。

5. T細胞由来のiPS細胞を展開

4℃で（この研究で使用される特定のブランドのための材料のリストを参照）マトリックスゲルを解凍し、DMEM / F12培地10mlの0.2 mlで溶解することにより基底膜マトリックス溶液を調製します。
プレート1 6ウェルプレート中でウェルあたり基底膜マトリックス溶液のミリリットルとで室温で残しますコロニーを選ぶ前に少なくとも30分。
ウェルあたりmTeSR培地20μlを96ウェルプレートを埋めます。
20μlのピペットを用いて実体顕微鏡下のESCに似たコロニーを選択します。
注： 図1（b）に示すように、ESCのと性IPSCのコロニーをラウンドとフラットです。
転送は、ステップ5.3でmTeSR媒体で満たされた96ウェルプレートにコロニーを選択しました。
200μlのピペットを用いて実体顕微鏡下で小さな塊にコロニーを破壊するために上下にピペッティングし、慎重に各ウェルにmTeSRの培地200μlを加え、。 5.2によく準備から基底膜マトリックス溶液を除去し、ウェルあたりmTeSR培地2mlで基底膜マトリックスでコーティングした6ウェルプレートの1ウェルに各コロニーを置きます。
一日おきにmTeSR媒体を肉mlの2にメディアを変更します。

6. T細胞由来のiPS細胞を維持

T細胞由来のiPS細胞を維持することができます人間性IPSCとヒトESCと同様の技術を使用して格納されています。 iPS細胞コロニーが成長したら、同じ手順を繰り返すことによって、より大きな皿にそれらを展開します。

1〜2日ごとにmTeSR媒体を変更します。
コロニーは、細胞は、製造業者の説明書に従って、ヒトiPS細胞およびヒトESCの解離溶液を使用して、毎5~7日経過コンフルエントになったとき。

Representative Results

このプロトコルを使用して、ユーザは安定したヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成することができます。センダイウイルスおよびマトリゲルを有するT細胞からのiPS細胞の生成は、約0.002％を示した-いくつかのドナー例とのSeVの間での細胞のリプログラミングの効率の0.005％は、いくつかの通路¹⁶の後には検出されなかった。図1（a）は、T細胞由来を生成するためのプロトコルの概略図を示します。マトリゲルとmTeSR媒体を用いた無フィーダー条件で性IPSC。センダイウイルス感染後20〜30日の周りに、iPS細胞のコロニーをそれらのESCコロニー様形態（ 図1B）によって認識されます。免疫蛍光染色は、無フィーダー条件（ 図1C）の下で生成されたT細胞由来のiPS細胞に典型的な多能性細胞マーカー（NANOG、OCT3 / 4、SSEA4、TRA-1-60、およびTRA-1-81）の発現を明らかにしました。

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図1（A）：この研究では、フィーダーフリー条件下での再プログラミングT細胞のためのプロトコルの概略図。 （B）：典型的なESCのようなiPS細胞コロニーフィーダーフリーの条件下で採血後27日目に。 （C）：T細胞由来のiPS細胞でALP染色および多能性および表面マーカーの免疫蛍光染色（NANOG、OCT3 / 4、SSEA4、TRA-1-60、およびTRA-1-81）は、フィーダーを含まない条件下で生成してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Disclosures

著者らは、開示するいかなる競合や利害を持っていません。

Acknowledgments

我々は、技術支援のために慶應義塾大学医学部から佳子三宅さやかKanaami、Chihana藤田美穂山口、夏子辺見、とレイ大野に感謝します。この研究の一部は健康研究成果の実用化を加速するために、R＆Dシステムズ支援プログラム、および再生医療の実現のためのハイウェイプログラムによって資金を供給されました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare	17-5442-02
Purified NA/LE mouse anti-human CD3	BD Pharmingen	555336
Bovine albumin fraction V solution	Gibco	15260-037
mTeSR1 medium kit	STEM CELL	5850	Warm at room temperature before use
Dissociation Solution	ReproCELL	RCHETP002
D-PBS(–)	Wako	045-29795
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0	DNAVEC	DV-0303c	Thaw on ice before use
100-mm tissue culture dish	Falcon	353003
96-well tissue culture plate	Falcon	353078
6-well tissue culture plate	Falcon	353046
15 ml Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	188271
50 ml Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	227261