This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Resistência a herbicidas em ervas daninhas apresenta uma séria ameaça para a produção mundial de alimentos e fibras 1,2. Atualmente, milhares de populações resistentes e biótipos de mais de cem espécies de plantas daninhas em todo o mundo têm sido documentadas e estudadas 3. Um importante mecanismo que confere resistência a herbicida em plantas, é a alteração de herbicidas genes e proteínas do local-alvo, incluindo as mutações genéticas que afectam a cinética de ligação proteína-herbicida ou amplificação do gene-alvo local 2. Desintoxicação metabólica via actividades elevados de mono-oxigenase citocromo P450 (P450) ou glutationa S -transferase (GST) enzimas é outro mecanismo que confere resistência a herbicidas em ervas daninhas, que é distinto de várias formas de mecanismos baseados em local de destino 2. Resistência à base metabólica tem ramificações significativas para se os custos de fitness planta (aka sanções aptidão) pode resultar dos mechanis de resistência ao herbicidam, bem como em relação ao potencial para um único mecanismo de desintoxicação para conferir resistência cruzada ou de vários herbicidas em populações de plantas daninhas 1,2,4. Geralmente, o metabolismo do herbicida em plantas pode ser dividida em três fases distintas 5. Fase I envolve a conversão herbicida ou de activação tal como hidroxilação P450-mediada de anéis aromáticos ou grupos alquilo, ou por N – ou reacções de desalquilação O-, levando ao aumento da polaridade e herbicida parcial desintoxicação 5,6. Recentemente introduzido grupos funcionais na Fase I podem proporcionar sítios de ligação para conjugação de glutationa reduzida por GSTs ou para glicose pelo glicosiltransferases UDP-dependentes na Fase II 5,7. Por exemplo, o principal metabolito inicial de primi sul furão-metilo no milho é hidroxi-primi sul furão-metilo 8, que pode ser posteriormente metabolizado para hidroxi-primisulfurão-glucósido (Fase II) e, em seguida, transportados para o vacúolo para armazenamento a longo prazo ou mais metabólica prócessamento 5,6 (Fase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) é uma de difícil controle, dicot espécies de plantas daninhas anuais que dificulta a produção de milho (Zea mays), soja (Glycine max) e algodão (Gossypium hirsutum) nos Estados Unidos. O alto grau de diversidade genética de waterhemp é facilitada pela sua biologia dióico e de longa distância vento polinização, e uma única planta waterhemp fêmea pode produzir até um milhão de sementes 9. Estas sementes são pequenas e facilmente se espalhar, o que naturalmente dotar waterhemp com um mecanismo de dispersão eficaz. Waterhemp exibe germinação contínua durante todo o período de crescimento 9, e suas sementes são capazes de germinar após vários anos de dormência. Waterhemp é uma planta C 4 que possui uma taxa de crescimento mais elevada do que a maioria das ervas daninhas de folha larga em sistemas de culturas arvenses 10. Além disso, numerosas populações waterhemp são resistentes a múltiplos famílias de herbicidas 3.
Uma população de waterhemp (designado MCR) de Illinois é resistente à 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenase (HPPD) herbicidas -inhibiting 11, tais como a mesotriona, bem como a atrazina e acetolactato sintase (ALS) -inhibiting herbicidas, incluindo primi sul furão-metilo , devido à não-alvo do local mecanismos baseados 12,13. Uma população diferente de waterhemp designado ACR 14, que é-primi sul furão-metilo resistentes (devido a uma mutação no gene de ALS) e atrazina-resistentes, mas sensível a mesotriona, e uma população waterhemp designado WCS 14 que é sensível à primi sul furão-metilo, mesotriona, atrazina e foram usadas em comparação com MCR na nossa pesquisa anterior 12 e experiências actuais (resumidas na Tabela 1). Estudos iniciais não detectaram alterações nos níveis de sequências genéticas HPPD ou expressão, ou reduzida absorção mesotriona, no MCRpopulação quando comparados com populações sensíveis à mesotriona 12. No entanto, estudos de metabolismo com plantas inteiras mostraram níveis significativamente mais baixos de pai mesotriona herbicida em comparação com o ACR MCR e WCS, o que se correlacionou com respostas fenotípicas anteriores para mesotrione 11,12.
Waterhemp População | Abreviatura | Fenótipo para Mesotriona | Mecanismo de resistência mesotriona | Fenótipo para primisulfurão | Mecanismo de resistência primisulfurão |
O Condado de McLean-Resistant | MCR | Resistente | Metabolismo * | Resistente | Metabolismo |
Adams County-Resistant | ACR | Sensitive | – | Resistente | Mutação alvo local em ALS 14 |
Wayne County-Sensitive | WCS | Sensível | – | Sensível | – |
* Mecanismos de resistência não-alvo do local, com excepção metabolismo reforçada, também podem conferir resistência mesotriona na população MCR 12.
Tabela 1: Descrição das populações waterhemp de Illinois utilizados neste estudo.
Além de determinar as taxas de metabolismo herbicida em plântulas waterhemp intactas, uma abordagem experimental diferente foi desenvolvido e utilizado na nossa investigação anterior para investigar o metabolismo usando um ensaio excisado waterhemp folha 12, bem como vários inibidores de P450 (por exemplo, tetcyclacis e malatião). Este método foi adaptado especificamente para waterhemp de um PREVIinvestigação ous do metabolismo primisulfurão-metil em milho extirpado deixa 15, uma vez que o ensaio de folha excisada ainda não haviam sido notificados para a realização de pesquisas metabolismo herbicida numa planta dicotiledônea. O inseticida malathion organophophosate tem sido frequentemente utilizado para in vivo e em pesquisa herbicida metabolismo vitro para indicar envolvimento P450 16. Por exemplo, a tolerância eo metabolismo rápido de mesotriona no milho são devido a hidroxilação do anel P450 catalisada, o que foi verificado quando malathion aumento da sensibilidade do milho para mesotriona 17. Da mesma forma, malatião inibiu o metabolismo do inibidor de primi sul furão-metilo ALS de milho em folhas excisadas 15. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada é que os dados gerados são independentes de padrões de translocação da planta inteira de, um factor importante a considerar quando se avalia o metabolismo de sistémicas, herbicidas pós-emergentes em plantas. Por conseguinte, este método permite que quantitativa emetabólica análises qualitativas para se concentrar em uma única folha tratada 12.
Uma estratégia de clonagem vegetativo, em combinação com o protocolo de folha excisada, foi previamente utilizado em waterhemp para conduzir estudos de metabolismo 12. Devido à natureza de cruzamento de waterhemp (plantas masculinas e femininas separadas), e elevado grau de diversidade genética dentro das espécies Amaranthus dióicas 9, este protocolo assegurado que waterhemp mudas geneticamente idênticas foram analisadas dentro dos experimentos longo do tempo. Este artigo demonstra a utilidade do método para a medição de folha excisada taxas de metabolismo herbicida em plantas daninhas dicotiledóneas um (waterhemp). A quantidade de herbicida-mãe remanescente foi determinada em cada ponto de tempo (Figura 1) por análise não linear de regressão dos mínimos quadrados, e foi adequado com uma curva de primeira ordem simples, a fim de estimar o tempo para 50% de herbicida absorvida para degradar ( DT 50). Representantecromatogramas da cromatograf ia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) são exibidos para ALS-resistentes e sensíveis ao waterhemp populações, que indicam o desaparecimento de herbicida-mãe e formação concomitante de metabolito polar (s) durante um estudo de tempo-curso (figura 2). O foco do nosso artigo é descrever e demonstrar a utilidade do ensaio da folha excisada em combinação com um método de clonagem vegetativa para determinar as taxas precisas e reprodutíveis do metabolismo de herbicidas em plantas dicotiledôneas, utilizando anel marcado (URL-14 C) herbicidas de maneira uniforme em três populações waterhemp que diferem nas suas respostas a planta inteira de HPPD- e inibidores da ALS herbicidas (Tabela 1).
O método extirpado-leaf aqui descrito foi usado anteriormente em pesquisar metabolismo primisulfurão no milho deixa 15, mas os nossos resultados demonstram que este protocolo é igualmente eficaz, preciso e reprodutível para medir o metabolismo do herbicida em um dicot 12 espécies de plantas daninhas. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada em comparação com os estudos da planta inteira de uma folha que é excisada é independente de padrões de translocação da planta inteira de p…
The authors have nothing to disclose.
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |