This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Herbicidresistens i ugress presenterer en alvorlig trussel mot den globale produksjonen av mat og fiber 1,2. Foreløpig tusenvis av resistente populasjoner og biotypes fra over hundre plantearter over hele verden har blitt dokumentert og studert tre. En viktig mekanisme som overfører herbicidresistens i planter er endring av herbicid target-site gener og proteiner, inkludert genetiske mutasjoner som påvirker ugressmiddel-proteinbindingskinetikken eller amplifikasjon av target-området gen 2. Metabolsk avgiftning via forhøyede aktiviteter av cytokrom P450 monooksygenase (P450) eller glutation S -transferase (GST) enzymer er en annen mekanisme som overfører herbicidresistens i ugress, som er forskjellig på flere måter fra target-site-baserte mekanismer 2. Metabolsk basert motstand har betydelige konsekvenser for hvorvidt anlegget fitness kostnader (aka fitness straffer) kan resultere fra ugressmiddel-motstands mechanism, så vel som med hensyn til muligheten for en enkelt avgiftning mekanisme til å meddele tverr- eller flere herbicid resistens i plantepopulasjoner 1,2,4. Vanligvis kan herbicid metabolisme hos planter deles i tre distinkte faser 5. Fase I innebærer omdannelse herbicid eller aktivering, slik som P450 hydroksylering av aromatiske ringer eller alkylgrupper, eller med N – eller O- dealkyleringsreaksjoner, som fører til øket polaritet og delvis herbicid avgiftning 5,6. Nylig innført funksjonelle grupper i fase kan jeg gi ledd nettsteder for konjugering til redusert glutation ved GST eller til glukose av UDP-avhengige glycosyltransferases i fase II 5,7. For eksempel er den store første metabolitt av primisulfuron-methyl i mais hydroksy-primisulfuron-methyl 8, som kan videre metaboliseres til hydroksy-primisulfuron-glukosid (fase II), og deretter transportert til vakuolen for langtidslagring eller videre metabolsk proling 5,6 (fase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) er en vanskelig å kontroll, dicot årlige plantearter som hindrer produksjonen av mais (Zea mays), soyabønner (Glycine max), og bomull (Gossypium hirsutum) i USA. Den høye graden av genetisk mangfold av waterhemp er tilrettelagt av sin dioecious biologi og langdistanse vind pollinering, og en enkelt kvinne waterhemp plante kan produsere opp til en million frø 9. Disse frøene er liten og lett spre seg, som naturligvis gi gave waterhemp med en effektiv spredning mekanisme. Waterhemp viser kontinuerlig spiring gjennom hele vekstsesongen 9, og dens frø er i stand til å spire etter flere år med dvalen. Waterhemp er en C 4 plante som besitter en høyere vekst enn de fleste bredbladet ugress i dyrkbar beskjæring systemer 10. I tillegg en rekke waterhemp bestander er resistente mot flere famlige fundament av ugressmidler 3.
En populasjon av waterhemp (betegnet MCR) fra Illinois er resistent overfor 4-hydroksy-fenylpyruvat dioksygenase (HPPD) hemmende herbicider 11, slik som mesotrion, så vel som til atrazin og acetolaktat-syntase (ALS) hemmende herbicider, inkludert primisulfuron-methyl På grunn av non-target-språk baserte mekanismer 12,13. En annen populasjon av waterhemp betegnet ACR 14, som er primisulfuron-methyl-resistente (på grunn av en mutasjon i ALS-genet) og atrazin-motstandsdyktig, men følsomme for mesotrion, og en waterhemp populasjon betegnet WCS 14 som er følsom for primisulfuron-methyl, mesotrion, og atrazine ble anvendt i forhold til MCR på vår tidligere forskning 12 og aktuelle eksperimenter (oppsummert i tabell 1). Innledende studier ikke oppdage endringer i HPPD gensekvens eller uttrykk nivåer, eller redusert mesotrion opptak, i MCRbefolkningen sammenlignet med mesotrion-sensitive populasjoner 12. Men metabolismestudier med hele planter viste signifikant lavere nivåer av foreldre mesotrion ugressmiddel i MCR sammenlignet med ACR og WCS, som korrelert med tidligere fenotypiske responser til mesotrion 11,12.
Waterhemp Befolkning | Forkortelse | Fenotype til mesotrion | Mesotrion Resistance Mechanism | Fenotype til Primisulfuron | Primisulfuron Resistance Mechanism |
McLean fylke-Resistant | MCR | Resistent | Metabolisme * | Resistent | Metabolisme |
Adams fylke-Resistant | ACR | SensITive | – | Resistent | Target-site mutasjon i ALS 14 |
Wayne County-Sensitive | WCS | Sensitive | – | Sensitive | – |
* Ikke-target-språk resistensmekanismer, annet enn økt metabolisme, kan også gi mesotrion motstand i MCR befolkningen 12.
Tabell 1: Beskrivelse av waterhemp populasjoner fra Illinois brukt i denne studien.
I tillegg til å bestemme priser av ugressmiddel metabolisme i intakte waterhemp frøplanter, ble en annen eksperimentell tilnærming utviklet og anvendt i vår tidligere forskning for å undersøke stoffskifte ved hjelp av en spaltet waterhemp blad analysen 12 samt ulike P450-hemmere (f.eks tetcyclacis og malathion). Denne metoden ble tilpasset spesielt for waterhemp fra en PreviOUS etterforskning av primisulfuron-metyl metabolisme i skåret mais blader 15, siden utskåret blad analysen ennå ikke hadde blitt rapportert for å gjennomføre ugressmiddel metabolisme forskning i et dicot plante. Den organophophosate insektmiddel malathion har vært hyppig brukt for in vivo og in vitro ugressmiddel-metabolisme forskning for å indikere P450 involvering 16. For eksempel, toleranse og hurtig metabolisme av mesotrion i mais skyldes P450-katalysert ring hydroksylering, som ble bekreftet ved malathion øket følsomhet for mais mesotrion 17. Tilsvarende, malathion hemmet metabolisme av ALS inhibitor primisulfuron-methyl utskåret i mais blader 15. En stor fordel med den utskårede blad teknikken er at data som er generert er uavhengige av hel-anlegget trans mønstre, for å vurdere en viktig faktor når man vurderer metabolismen av systemiske herbicider, postemergence i planter. Derfor tillater denne metoden kvantitative ogkvalitativ metabolsk analyser for å fokusere på en enkelt behandlet blad 12.
En vegetative kloning strategi, i kombinasjon med utskåret blad protokollen, ble tidligere benyttet i waterhemp å gjennomføre metabolismestudier 12. På grunn av den outcrossing natur waterhemp (separate mannlige og kvinnelige planter), og stor grad av genetisk mangfold innenfor dioecious Amaranthus arter 9, denne protokollen sørget for at genetisk identiske waterhemp frøplanter ble analysert innenfor tidskurs eksperimenter. Denne artikkelen viser nytten av det utskårede blad metode for å måle forekomst av herbicid metabolisme i en tofrøbladet ugress (waterhemp). Mengden av basis herbicid gjenværende ble bestemt på hvert tidspunkt (figur 1) ved ikke-lineær minste kvadraters regresjonsanalyse, og er i form med en enkelt første-ordens kurve for å beregne tiden for 50% av absorbert herbicid å degradere ( DT 50). RepresentantKromatogrammene fra reversfase-væskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) vises for ALS-resistente og -sensitive waterhemp populasjoner, som viser forsvinningen av moder herbicid og samtidig dannelse av polar metabolitt (er) i løpet av en tidsstudium (figur 2). Fokus for vår artikkelen er å beskrive og demonstrere nytten av utskåret blad analyse i kombinasjon med en vegetativ klonings fremgangsmåte for å bestemme nøyaktige og reproduserbare forekomst av herbicid metabolisme i tofrøbladet planter, ved hjelp av jevnt ring-merkede (URL- 14 C) i herbicider tre waterhemp populasjoner som varierer i deres hel-anlegget svar på HPPD- og ALS-hemmer ugressmidler (tabell 1).
Det utskårede-blad metoden beskrevet her har tidligere vært brukt i forskning primisulfuron metabolisme i mais blader 15, men våre resultater viser at denne protokollen er også effektiv, nøyaktig og reproduserbar for måling av ugressmiddel metabolisme i en dicot ugrasarter 12. En stor fordel med den utskårede blad teknikk sammenlignet med hel-anlegget studier er at et utskåret blad er uavhengig av hel-anlegget trans mønstre av postemergence, systemiske herbicider eller forskjeller i opptak…
The authors have nothing to disclose.
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |